噬菌体抗体淘筛方法

这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。

TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。

我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。

使用此文库之前请认真阅读以下材料

确认收到以上材料

2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。

3. 参照方案G制备KM13

4. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对

照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）

5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用

聚丙烯管。

6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃

震荡过夜培养

(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在

0.4。（1.5-2小时）

7. 所有的离心，除了在微型离心机中操作的之外，都是在4℃下进行。

8.两个文库最好是同时使用，以保证筛选得到最多的抗原结合克隆。

In advance

准备好用到的仪器和试剂（详见方案后注解），确保有足够的用于细菌增殖的培养基（大的生物分析的培养皿在使用前进行灭菌和干燥处理）

在实验之前仔细阅读这个方案，以便安排你的时间同时进行操作

Steps Procedure

Day 1 (5 hrs) A1-A6 Grow libraries I and J and make phage

B1-B3 Make secondary stock of libraries

第一天A1-A6 增殖文库I和J，并且制备噬菌体

B1和B3 制作文库的第二原种

Day 2 (6 hrs) A7-A12 Grow libraries I and J and make phage (cont.)

C1 Coat immunotubes for 1st round of selection

第二天A7-A12 增殖文库I和J，并且制备噬菌体

C1 包被第一轮筛选用免疫管

Day 3 (6.5 hrs) C2-C11 1st round of selection

第三天C2-C11 第一轮筛选

Day 4 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 1st round of selection

C1 Coat immunotubes for 2nd round of selection

第四天D1-D6 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体

C1 包被第二轮筛选用免疫管

Day 5 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 1st round of selection (cont.)

C2-C11 2nd round of selection

第五天D7-D11 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）

C2-C11 第二轮筛选

Day 6 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 2nd round of selection

C1 Coat immunotubes for 3nd round of selection

第六天D1-D6 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）

C1 包被第二轮筛选用免疫管

Day 7 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 2nd round of selection (cont.)

C2-C11 3rd round of selection

第七天D7-D11 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）

C2-C11 第三轮筛选

Day 8 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 3rd round of selection

E1 Coat 96 well plate for polyclonal phage ELISA

第八天D1-D6 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体

E1 包被多克隆噬菌体ELISA用的96孔板Day 9 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 3rd round of selection (cont.)

E2-E8 Polyclonal phage ELISA

第九天D7-D11 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）

E2-E8 多克隆噬菌体ELISA

每个克隆的进一步的描述可以通过单克隆噬菌体ELISA（方案E），单克隆噬菌体ELISA用水溶性的scFv 片段（方案F）。PCR检测（检测插入，方案H）和测序（方案I）

1. 将文库的加入到200ml预热的含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2xTY培养基上

2. 37°C振荡培养至OD 600为0.4

3. 从中取50ml，加入2x1011 KM13辅助噬菌体（剩余的150ml在方案B中用来制备文库的第二细菌

储存液）

4. 37°C水中温浴30分钟

5. 3000g,离心10min,用100ml含有100 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml的卡那霉素和1 %葡萄糖的2xTY

培养基

6. 30度振荡过夜培养

7. 将过夜产物在3300g离心30分钟

8. 取上层液体80ml，加入20mlPEG/NACL(含20 % PEG，2.5 M NaCl)溶液