丝状噬菌体展示

• 2.噬菌体抗体库的分类 (1)根据 免疫抗体库 插入基 因片段 非免疫抗体库 天然抗体库 的来源 半合成抗体库 全合成抗体库
(2)根据可利用的载体主要分为: 丝状噬菌体展示 （M13为最常用）
λ 噬菌体展示
T4噬菌体展示 T7噬菌体展示 具体内容如下：
①丝状噬菌体是一种分泌型噬菌体。是单链环状 DNA病毒，其含有五种结构蛋白： 主要衣壳蛋白p8
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2.侵入：吸附后尾丝收缩，基板从尾丝 中获得一个构象刺激，促使尾鞘中的144 个蛋白质亚基发生复杂的移位，并紧缩 成原长的一半，由此把尾管推出并插入 细胞壁和膜中。此时尾管端所携带的少 量溶菌酶可把细胞壁上的肽聚糖水解， 以利侵入。头部的核酸迅速即通过尾管 及其末端小孔注入宿主细胞中，并将蛋 白质躯壳留在壁外。从吸附到侵入的时 间极短，例如T4只需15s。
T4噬菌体展示系统 ： T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中 期建立起来的一种新的展示系统。它的显 著特点是能够将两种性质完全不同的外源 多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外 壳蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融 合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它 表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免 了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4 噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分 泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋 白质，很少受到限制。
（2）D蛋白展示系统：D蛋白的分子质量为 11 ku，参与野生型λ噬菌体头部的装配。 低温电镜分析表明，D蛋白以三聚体的形式 突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组 小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D 蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外 源序列融合的载体，而且展示的外源多肽 在空间上是可以接近的。
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5.裂解：当宿主细胞内的大量子代噬菌 体成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和 水解细胞壁的溶菌酶等的作用，促进了 细胞的裂解，从而完成子代噬菌体的释 放。
噬菌体侵染过程如下：
噬菌体的侵染过程示意图：
噬菌体的侵染实验的研究证明了 DNA是遗传物质
二、噬菌体展示及抗体库技术
（一）噬菌体展示技术： • 1.展示技术的发展历程 1985年,Smith第一次成功 地将EcoRⅠ核酸内切酶基 因插入丝状噬菌体基因pⅢ 中,并在噬菌体表面表达出了 融合的蛋白。
此外，尚有丝状噬菌体PⅥ展示系统的 研究报道。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌体表 面，可以作为外源蛋白的融合位点，可以 用于研究外源蛋白C端结构区域功能。从所 掌握的文献来看，该系统主要用于cDNA表 面展示的构建，并取得了不错的筛选 效果。
λ噬菌体展示系统： （1）PV展示系统：λ噬菌体的PV蛋白构成了它的 尾部管状部分，该管状结构由32个盘状结构组成， 每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域， C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插 入或替换。目前，用PV系统已成功展示了有活性 的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465 ku）和植物外 源凝血素BPA（120 ku）等。λ噬菌体的装配在 细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。 该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子 /噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ 噬展示系统依赖于细胞内基因 的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子 如生物毒素分子，很难得到有效表达和展 示。
（二）噬菌体抗体库技术： • 1.简介： 噬菌体抗体库技术是指利用分子生物 学手段将外源DNA片段插入噬菌体基因,与 编码噬菌体外壳蛋白的基因相连接,通过侵 染宿主,在噬菌体表面表达成融合蛋白的过 程经过对目标分子如蛋白、糖蛋白、病毒 及小分子物质等的特异性结合筛选过程,从 而富集得到针对的目标分子的噬菌体展示 抗体的技术。
其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌 毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白 结构的一部分，并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚 定于噬菌体的一端。PⅢ有2个位点可供外源序列 插入，当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的 信号肽(SgⅢ)和N1之间时，该系统保留了完整的 PⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或 蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体 丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬 菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易 被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染时， 可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白， 即所谓“单价”噬菌体。
病毒颗粒的组装可以在体内也可以在 体外，体外组装即是将D融合蛋白结合到 λD-噬菌体表面，而体内组装是将含D融合 基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌 种中，从而补偿溶源菌所缺的D蛋白，通过 热诱导而组装。该系统有一个很好的特点， 噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿 主的抑制tRNA活性加以控制，这对于展示 那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质 时特别有用。
• 4.目标抗体的表达：
外源基因的克隆表达主要有两种途径, 即原核表达及真核表达,原核表达主要是通 过大肠杆菌进行表达,真核表达主要是通过 酵母菌进行表达,如毕赤酵母菌;噬菌体展示 抗体的表达多是通过各种不同的E. coil菌 种进行表达,如HB2151、pMF3、pHOG-21。
• 5.噬菌体抗体库的应用：
3.噬菌体展示技术的原理： 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的 编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外 壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正 确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况 下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表 达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而 展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白 可以保持相对独立的空间结构和生物活性， 以利于靶分子的识别和结合。
肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定 时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体， 然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合 吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细 胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3 轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分 子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得 的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望 结合特性的目标噬菌体。
影响噬菌体本身活性。
Hale Waihona Puke • 5.噬菌体展示技术的局限性 ： （1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、 噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜 分泌过程，这就大大限制了所建库的容量9。
（2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的 表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转 运、膜插入和络合，导致在体内筛容易被降解，因此， 必须差，也是体内选择压力的一个例子。真核细胞蛋 白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折 叠机制不同的缘故。
4种次要衣壳蛋白p3、p6、p7和P9。 ②丝状噬菌体展示外源性基因，有两种形式： 噬菌体载体 噬菌粒载体
• 3.目标抗体的筛选 ：
工程抗体的体外成熟对医疗领域具有 重要的作用,通过噬菌体抗体库的筛选是抗 体体外成熟的其中一种方式,通过不断地筛 选,从而促使阳性克隆不断地富集。
最常见的筛选方法包括固相筛选、生 物素筛选和液相筛选等。Burmester等构 建了青霉素免疫单链抗体库,并利用免疫试 管包被transferrin-EMCS-ampicillin进行 抗体的筛选。Yuan等从7个不同的人种,共 47个健康人类的血液中提取基因,构建了人 源天然scFv噬菌体抗体库,并利用细胞筛选 的方法获得anti-MISIIR单链抗体分子。
吴健敏等成功地将大小约215 aa SOC/m E2 融合蛋白展示于T4噬菌体衣壳表面。令人值得关 注的是，SOC与HOC蛋白的存在与否，并不影响 T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可 优于DNA的包装而装配于衣壳的表面，事实上， 在DNA包装被抑制时，T4是双股DNA噬菌体中唯 一能够在体内产生空衣壳的噬菌体（SOC和HOC 也同时组装）。因此，在用重组T4做疫苗时，它 能在空衣壳表面展示目的抗原，这种缺乏DNA的 空衣壳苗，在生物安全性方面具有十分光明的前 景。
（2）PⅧ及其他展示系统：PⅧ是丝状噬菌 体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，C端 与DNA结合，N端伸出噬菌体外，每个病毒 颗粒有2 700个左右PⅧ拷贝。PⅧ的N端附 近可融合五肽，但不能融合更长的肽链， 因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍， 影响噬菌体装配，使其失去感染力。但有 辅助噬菌体参与时，可提供野生型PⅧ蛋白， 降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。
• 4.噬菌体展示系统： 单链丝状噬菌体展示系统 ： （1）PⅢ展示系统:丝状噬菌体是单链DNA 病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病 毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌 所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷 贝PⅢ蛋白，其在结构上可分为N1、N2和 CT 3个功能区域，这3个功能区域由两段富 含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。
第二章 噬菌体的相关技术
一、噬菌体的侵染过程：
• • • • • 1.吸附 2.侵入 3.增殖 4.成熟（装配） 5. 释放
• 1.吸附：当噬菌体与其相应的特异宿主在水 环境中发生偶然碰撞后，如果尾丝尖端与 宿主细胞表面的特异性受体（蛋白质、多 糖或者脂蛋白-多糖复合物等）接触后，就 可触发颈须把卷紧的尾丝散开，随即就附 着在受体上，从而把刺突、基板固着于细 胞表面。 吸附作用受许多外来因素的影响，如 噬菌体的数量，阳离子浓度，温度和辅助 因子（色氨酸、生物素等）
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3.增殖：包括核酸的复制和蛋白质的生 物合成。首先，噬菌体一起核算中的遗 传信息向宿主细胞发出指令并提供“蓝 图”，使宿主细胞的代谢系统按严密程 序、有条不紊地逐一转向或适度改造， 从而转变成能有效合成噬菌体所特有的 组分和“部件”，其中所需“原料”可 通过宿主细胞原有核酸等的降解、代谢 库内的贮存物或从外界环境中取得。一 旦大批成套的“部件”已合成，就在细 胞“工厂”里进行突击装配，于是就产 生了一大群形状、大小完全相同的子代 噬菌体。
噬菌体展示抗体的应用已逐渐深入抗 体工程的多个领域如医疗制药、基于 ELISA技术的食品和环境的安全检测及蛋 白质相互作用等。
T7噬菌体展示系统： T7噬菌体是烈性噬菌体。具有两 个双链臂,外源基因可插入双臂间,经体 外包装后可直接侵染大肠杆菌,获得抗 体库,目前应用也较为广泛。