电转感受态细胞的制备

电转感受态细胞的制备

电转感受态细胞 (Electroporated sensitized cells) 是指通过电穿孔技术将外源 DNA 或 RNA 导入细胞内的一种技术。该技术广泛应用于基因治疗、疫苗研究、基因编辑等领域。本文将介绍电转感受态细胞的制备方法、原理以及注意事项。下面是本店铺为大家精心编写的5篇《电转感受态细胞的制备》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。

《电转感受态细胞的制备》篇1

一、电转感受态细胞的制备方法

电转感受态细胞的制备方法主要包括以下步骤:

1. 细胞培养：将细胞接种到培养皿中，并在适当的条件下培养细胞，使细胞生长至对电穿孔敏感的阶段。

2. 制备电穿孔缓冲液：根据细胞类型和实验需要，选择适当的电穿孔缓冲液，将其制备好。

3. 处理细胞：将细胞与电穿孔缓冲液混合，并在一定条件下进行电穿孔处理。

4. 收集细胞：将处理后的细胞收集到离心管中，并进行离心。

5. 检测细胞：通过荧光显微镜或 Western blot 等方法，检测细胞内是否成功导入外源 DNA 或 RNA。

二、电转感受态细胞的原理

电转感受态细胞的原理是利用高电压电流产生的电场，使细胞膜

通透性增加，从而使外源 DNA 或 RNA 通过细胞膜进入细胞内。电穿孔过程中，细胞膜上的脂质分子重新排列，形成一个暂时的孔道，外源 DNA 或 RNA 通过这个孔道进入细胞内。

三、注意事项

在进行电转感受态细胞制备时，需要注意以下几点:

1. 细胞选择：不同类型的细胞对电穿孔的敏感性不同，因此需要根据实验需要选择适当的细胞类型。

2. 电穿孔缓冲液：电穿孔缓冲液的组成和浓度对电转感受态细胞的制备非常重要，需要根据实验需要进行优化。

3. 处理条件：电穿孔处理的条件，如电压、电流、时间等，需要根据细胞类型和实验需要进行优化。

4. 检测方法：检测细胞内是否成功导入外源 DNA 或 RNA 的方法需要与实验目的相符，并进行严格的对照实验。

《电转感受态细胞的制备》篇2

电转感受态细胞是一种常用于分子生物学和基因工程领域的实验技术，它可以将外源 DNA 或 RNA 转入细胞中，从而实现基因转移和表达。以下是一种制备电转感受态细胞的步骤：

1. 获取感受态细胞：使用化学法或电击法将细胞转化为感受态细胞，通常使用大肠杆菌（E. coli）等常见菌种。

2. 准备电穿孔小槽：将感受态细胞与连接物混合，转移到电穿孔小槽中，利用电脉冲将细胞膜穿孔，使得外源 DNA 或 RNA 能够进入细胞。

3. 洗涤细胞：通过冲洗电击杯和用室温 SOC 冲洗细菌等步骤，将细胞洗涤干净，以去除多余的连接物和杂质。

4. 涂布平板：将细胞加入含有氨苄青霉素的培养基中，制备成100μl, 10μl 和 1μl 的涂布平板，以便进行后续的筛选和鉴定。

5. 培养细胞：将涂布平板放入 37°C 的培养箱中，振荡培养 1 小时，然后将其余培养物补加 Amp 至终浓度为 50g/ml，再于 37°C 培养 1 小时。

6. 过夜培养：将培养物转接于 100ml 含有 50g/ml Amp 的培养基中，37°C 过夜培养。

7. 制备质粒 DNA：通过构建轻链库和重链库，插入另一条链的可变区基因，制备成质粒 DNA。

8. 加入辅助噬菌体：将培养物转入 100ml 含有 50g/ml Amp 的培养基中，加入辅助噬菌体 M13K071012pfu，37°C 振荡培养 2 小时。

9. 加入卡那霉素：加入卡那霉素至 70g/ml，30 或 37°C 振荡培养过夜。

10. 离心：4000r/min 离心细菌，415min，将上清转移至一个干净的无菌瓶中，加入 4％PEG8,000 和 3％NaCl，用摇床振荡 5min 以

使其溶解。

11. 冰浴沉淀噬菌体：冰浴沉淀噬菌体 30 分钟。

12. 离心：9000r/min 离心 (4)20min 弃上清。在纸巾上吸干10min，尽可能除去 PEG。

13. 重悬：用 2ml TBS/1％BSA重悬，转移入5ml离心管中，14,000r/min离心5min，取上清贮存4(长期保存应加入0.02％NaN3)。

14. 筛选：只有新鲜制备的噬菌体可以用于筛选，因为残存的蛋白酶很容易将 ScFv 从噬菌体表面切下。长期贮存的制备物应重新感染扩增再用于筛选。

15. 制备噬菌粒 DNA：从离心的细菌中制备噬菌粒 DNA，贮存。

《电转感受态细胞的制备》篇3

电转感受态细胞是一种常用于分子生物学和基因工程领域的实

验技术，它可以将外源 DNA 或 RNA 转入细胞中，从而实现基因转化或基因敲除等操作。以下是一种制备电转感受态细胞的步骤：

1. 获取感受态细胞：使用化学法或电击法将细胞转化为感受态细胞，通常使用大肠杆菌等常见实验室菌株。

2. 准备电穿孔小槽：将感受态细胞与连接物混合，转移到电穿孔小槽中，利用电脉冲将细胞膜穿透，使得外源 DNA 或 RNA 能够进入细胞。

3. 冲洗细胞：立即冲洗电击杯，先用 1ml，然后用 2ml 室温 SOC 冲洗细菌，以去除多余的连接物和杂质。

4. 培养细胞：将细胞于 37°C 振荡培养 (250r/min)1 小时，以使外源 DNA 或 RNA 融入细胞基因组中。

5. 涂布平板：加入 10ml 37°C 预热的 SB(含 20g/ml 氨苄青霉素，Amp)，立即涂布平板，做 100μl, 10μl, 1μl 三种涂布。

6. 补充 Amp：将培养物于 37°C 振荡培养 (以下均为

300r/min)1 小时，补加 Amp 至终浓度为 50g/ml，再于 37°C 培养1 小时。

7. 过夜培养：将培养物全部转接于 100ml 含 50g/ml Amp 的SB 中，37°C 过夜培养。

8. 制备质粒 DNA：制备质粒 DNA，插入另一条链的可变区基因。通常先构建轻链库，再构建重链库；回到步骤（1）将第二条链插入已构建的第一链的库中。插入第二条链后，进行步骤（6），省略步骤（5）和（5a）。

9. 加入辅助噬菌体：加入辅助噬菌体 M13K071012pfu，将培养物转入 100ml SB(含 50g/ml Amp)，37°C 振荡培养 2 小时。

10. 加入卡那霉素：加入卡那霉素至 70g/ml，30°C 或 37°C 振荡培养过夜。

11. 离心细菌：4000r/min 离心细菌，415min，将上清转移至一个干净的无菌瓶中，加入 4％PEG8,000 和 3％NaCl，用摇床振荡