第二章 组织培养基本技术.ppt
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植物组织培养基本技术
④诱导分化、增殖和生根阶段一般选用IBA和NAA
10
2.细胞分裂素（CTK）： （1）作用： ①促进细胞分裂； ②诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长； ③抑制顶端优势，延缓离体组织衰老； ④对根的生长一般起抑制作用 （2）常用的细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）
等。 （3）使用浓度：一般0.1~10.0mg/L
（4）有些生长调节物质不溶于水，2,4-D 、NAA 、 IAA 、GA3等在配制时可先用少量95%的乙醇溶 解。KT、6-BA等可先溶解于少量1mol/L的盐酸 中。叶酸则可先用少量稀氨水溶解。
18
3、配制好的母液贴上标签 标签：注明母液的名称、配制倍数、配制日期、配制人员及配1L培养基时
应移取的量。 注意：母液要低温保存，储存时间不易过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。
4
（三）有机营养物质： 培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。 为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成 分主要有以下几类：
5
1、碳水化合物——碳源： 可作为碳源的有蔗糖，葡萄糖和果糖最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用浓度
在2%—5%，常用3%（30g/L），即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用 2.5%。
21
（三）计算： 1.欲配制1L MS＋6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L＋3%蔗糖+0.6%琼脂培养基，已知
MS母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素10倍，微量元素200倍，铁盐 100倍，有机物500倍， 1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA。 （1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量 （2）叙述培养基的配制过程
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2.细胞分裂素（CTK）： （1）作用： ①促进细胞分裂； ②诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长； ③抑制顶端优势，延缓离体组织衰老； ④对根的生长一般起抑制作用 （2）常用的细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）
等。 （3）使用浓度：一般0.1~10.0mg/L
（4）有些生长调节物质不溶于水，2,4-D 、NAA 、 IAA 、GA3等在配制时可先用少量95%的乙醇溶 解。KT、6-BA等可先溶解于少量1mol/L的盐酸 中。叶酸则可先用少量稀氨水溶解。
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3、配制好的母液贴上标签 标签：注明母液的名称、配制倍数、配制日期、配制人员及配1L培养基时
应移取的量。 注意：母液要低温保存，储存时间不易过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。
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（三）有机营养物质： 培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。 为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成 分主要有以下几类：
5
1、碳水化合物——碳源： 可作为碳源的有蔗糖，葡萄糖和果糖最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用浓度
在2%—5%，常用3%（30g/L），即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用 2.5%。
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（三）计算： 1.欲配制1L MS＋6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L＋3%蔗糖+0.6%琼脂培养基，已知
MS母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素10倍，微量元素200倍，铁盐 100倍，有机物500倍， 1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA。 （1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量 （2）叙述培养基的配制过程
植物组织培养ppt课件
1946年：罗士韦在菟丝子茎尖培养地观察到花的形成，为试管 受精奠定了基础
1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解 除生长素对芽生长的抑制作用。
ppt精选版
42
1952-1953年：美国科学家Steward F.C. 用胡萝卜根的细胞悬浮 培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完 整植抹，证实了植物细胞全能性学说。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
ppt精选版
43
组织培养的奠基人
植物组织培养是由于人为控制培养条件，
根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同
的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比
较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植 物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于 植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说
成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗
或脱病毒种苗。
细胞全能性的高低：
受精卵>生殖细胞>体细胞
植物细胞>动物细胞
分化程度低的细胞>分化程度高的细胞
细胞分化的实质：基因的选择性表达。
ppt精选版
16
②全能性的表达
少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质, 因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞 核,因而没有全能性。
目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。
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3、 迅速发展阶段（1960-1980）
1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解 除生长素对芽生长的抑制作用。
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1952-1953年：美国科学家Steward F.C. 用胡萝卜根的细胞悬浮 培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完 整植抹，证实了植物细胞全能性学说。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
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组织培养的奠基人
植物组织培养是由于人为控制培养条件，
根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同
的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比
较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植 物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于 植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说
成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗
或脱病毒种苗。
细胞全能性的高低：
受精卵>生殖细胞>体细胞
植物细胞>动物细胞
分化程度低的细胞>分化程度高的细胞
细胞分化的实质：基因的选择性表达。
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②全能性的表达
少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质, 因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞 核,因而没有全能性。
目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。
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3、 迅速发展阶段（1960-1980）
《组织培养》PPT课件
力。
整理课件
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3、逐步添加和逐步排除的试验方法：
在植物组织分化与再生的研究中，在没有 取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种 有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后， 就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是 使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以 便找到最有影响力的因子，或是为了实用上 的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利 于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用 到这种加加减减的简单方法。
整理课件
4
二、培养基特点
1.MS培养基：无机盐和离子浓度较高， 比较稳定的离子平衡溶液。养分数量和比 例较合适，硝酸盐含量较其他培养基高， 广泛应用于植物的器官、花药、细胞和原 生质体培养。
2.B5培养基：含有较低的铵，这个成分可 能对不少培养物生长有抑制作用，双子叶 特别是木本植物适合于B5培养基。
铁(Fe)、硼(B)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼 (Mo)、钴(Co)、氯(Cl)。
整理课件
8
2）有机成分
有机成分（organic compound）： 指植物生长发育时必需的有机碳、、 氢、氮等物质。主要有糖、维生素、 肌醇、氨基酸等。
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9
①糖（sugar）
糖既可作为碳源，为培养的外植体 提供生长发育所需的碳骨架和能源外， 还具有维持培养基一定渗透压的作用。 常用蔗糖，浓度为1～5%。
4)水解酪蛋白（CH） 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸， 使用浓度为100—200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用时要 注意。
5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维 生素类；麦芽提取液(0.01%～0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的 果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，
植物的组织培养技术ppt
n(个)
3.1 6.1 5.3 5.0
回答下列问题： (1)按照植物旳需求量，培养基中无机盐旳元素可分为 ____________和________两类。上述培养基中，6－BA属于 ________类生长调整剂。 (2)在该试验中，自变量是________，因变量是_________， 自变量旳取值范围是________。 (3)从试验成果可知，诱导丛芽总数至少旳培养基是________ 号培养基。 (4)为了诱导该菊花试管苗生根，培养基中一般不加入 ________(填“6－BA”或“IAA”)。
①按照不同旳顺序使用这两类激素，会得到不同旳试验
成果(如下表)：
使用顺序
试验成果
先使用生长素，后使用细胞 有利于细胞分裂，但细胞
分裂素
不分化
先使用细胞分裂素，后使用 生长素
细胞既分裂又分化
同步使用
分化频率提升
②当同步使用这两类激素时，两者用量旳百分比影响植 物细胞旳发育方向。
①高：利于根的分化、抑制芽的形成 细生胞长分素裂用素量用量的比值②低：利于芽的分化、抑制根的形成
(1)配制诱导愈伤组织旳固体培养基，分装后要进行________。 接种前，要对人参根进行________。 (2)用于离体培养旳根切块，叫做________。培养几天后发觉少 数培养基被污染，若是有颜色旳绒毛状菌落，属于________ 污 染；若是有光泽旳黏液状菌落，属于________污染。 (3)用少许________酶处理愈伤组织，获取单细胞或小细胞团， 在液体培养基中进行悬浮培养，可有效提升人参皂苷合成量。 (4)人参皂苷易溶于水溶性(亲水性)有机溶剂，从培养物干粉中 提取人参皂苷宜选用________措施，操作时应采用________加 热。
《组织培养基本技术》PPT课件
4、用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。
整理课件
38
5、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养 基的培养器皿，放进工作台。
6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的 酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。
7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。
8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口 各部分都烧到。
与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受 到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养 基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体 部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影 响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个 重要问题。
超净工 作台
紫外灯 照射
70%—75% 的酒精擦洗
整理课件
空气消 毒灭菌
培养材料 的接种
34
（6）外植体灭菌
流水冲洗10—20min 或更长时间
0.1%—0.2%氯化汞 液中浸泡10min左右
在10%的次氯酸钠、 饱和漂白粉浸泡 30min左右
整理课件
70%—75% 酒精中浸泡 30s
蒸馏水冲洗 4—5次
洗衣粉 洗涤
清水 冲洗
晾干 备用
整理课件
27
2、塑料用品洗涤
新的塑料器皿打开即用
已用过的 塑料器皿
2%NaOH浸泡 12h
蒸馏水 冲洗
清水 冲洗
晾干备用 整理课件
清水 冲洗
2%—5%盐 酸浸泡 30min
28
3、金属用品洗涤
热洗衣粉水 洗净
冲洗
擦干
整理课件
29
五、灭菌技术
1、灭菌方法
物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤
整理课件
38
5、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养 基的培养器皿，放进工作台。
6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的 酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。
7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。
8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口 各部分都烧到。
与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受 到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养 基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体 部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影 响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个 重要问题。
超净工 作台
紫外灯 照射
70%—75% 的酒精擦洗
整理课件
空气消 毒灭菌
培养材料 的接种
34
（6）外植体灭菌
流水冲洗10—20min 或更长时间
0.1%—0.2%氯化汞 液中浸泡10min左右
在10%的次氯酸钠、 饱和漂白粉浸泡 30min左右
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70%—75% 酒精中浸泡 30s
蒸馏水冲洗 4—5次
洗衣粉 洗涤
清水 冲洗
晾干 备用
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2、塑料用品洗涤
新的塑料器皿打开即用
已用过的 塑料器皿
2%NaOH浸泡 12h
蒸馏水 冲洗
清水 冲洗
晾干备用 整理课件
清水 冲洗
2%—5%盐 酸浸泡 30min
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3、金属用品洗涤
热洗衣粉水 洗净
冲洗
擦干
整理课件
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五、灭菌技术
1、灭菌方法
物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤
组织培养技术二PPT课件.ppt
母液的配制方法：
• 单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的 母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。
• 混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称 量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混 合母液，浓度可用a mg/L表示，即配制一升培养基吸取该 母液a ml.
第二节 培养基的制备
• 一、母液(stock solution)的配制和保存 • 在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为简便
起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液 的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快 速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机 物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+ • 和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43- 一起溶解后，会产生沉淀，一定 要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。 药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要 准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。一般 配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、 氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱 内低温保存，用时再按比例稀释。
湿度 (humidity)
• 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受 培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。 在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利 于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接 影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受 阻，也会导致植物生长发育受影响。
植物的组织培养技术(共27张PPT)
➢按培养方法分为
固体培养 液体培养
看护培养 微室培养
按培养过程分为
初代培养
继代培养
离体的植物器官、组织、细胞 将植物的器官如胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织接种在无菌培养基上进行培养。
初代培养 继代培养 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株，而且均来自一单一的个体，遗传性状一致。
再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件 下可有转变为各种不同细胞类型的能力。
4.植物组织培养分类
➢按材料的类别分
愈伤组织培养 细 胞 培养
器 官 培养
原生质体培养
最为常见的组织培养
悬浮细胞培养 单细胞培养
胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、 花和幼果的部分组织的培养
⑴愈伤组织培养
将外植体接种在人工培养基上，由于植物生长调节剂的存 在，而其细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再 生植株。它是最为常见的。
1.组织培养定义
组织培养是指用
无菌方法使植 物体的离体器
官、组织和细胞 在人为提供的条 件下生长和发育 的所有培养技术 的总称，也称之 为离体培养。
（二）奠基阶段（从20世纪30
年代末到50年代中）：
1934年，White 用番茄根尖 建立起第一个活跃生长的无性繁 殖系，从而使非胚器官的培养首 先获得成功。
脱 分 化
离体的植物器官、 组织、细胞
愈伤组织
植物全能性 的表达
根、芽
胚状体 再生植株
游离单细胞 或原生质体
人工种子
培养条件：基 本培养基和适 宜的植物生长 调节物质，适 宜的温度、空 气、无菌环境、 适合的PH、 适时光照等。
脱分化：将分化组织的已停止分裂的细胞从植物体 部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。
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一、实验室组成 二、仪器设备 三、培养器皿及实验用具 四、洗涤技术 五、灭菌技术 六、无菌操作
一、实验室组成
组织培养实验室布局的总体要求
便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察
实验室 组成
基本实验室
准备室 缓冲室 无菌操作室 培养室
细胞生物学实验室 辅助实验室 温 室
生化分析实验室
基本实验室布局平面图
冰箱 电炉
酸度计
纯 天水 平器
培养基分装器
搅拌器
2、灭菌设备
蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、 过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。
蒸汽压力灭菌锅
干热消毒柜
无菌瓶顶过滤装置
（参考图）
喷雾消毒器
（参考图）
3、无菌操作设备
超 净 工 作 台
无菌接种箱
4、细胞培养设备
摇床
培养架
箱
培养
荡培
振照
22
127.8
1.543
24
129.6
1.681
30
134.5
50
147.6
（3）塑料器皿灭菌： 多采用高压蒸汽消毒灭菌
（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷
却后使用
（5）接种室灭菌
接种室
紫外灯 照射
超净工 作台
紫外灯 照射
70%—75% 的酒精擦洗
空气消 毒灭菌
消毒剂、抗菌素灭菌
2、灭菌
（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在9.8×104—10.8×104Pa 温度在121℃ 灭菌20—30min
（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌
饱和蒸汽压力与其对应的温度
饱和蒸汽压力
kg/cm2
1b/m2
5、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养 基的培养器皿，放进工作台。
6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95% 的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。
7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。
8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶 口各部分都烧到。
9、取下接种器械，在火焰上消毒。
10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。
洗衣粉 洗涤
清水 冲洗
晾干 备用
2、塑料用品洗涤
新的塑料器皿打开即用
已用过的 塑料器皿
2%NaOH浸泡 12h
蒸馏水 冲洗
清水 冲洗
晾干备用
清水 冲洗
2%—5%盐 酸浸泡 30min
3、金属用品洗涤
热洗衣粉水 洗净
冲洗
擦干
五、灭菌技术
1、灭菌方法
物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤
除菌等 化学方法：
效果
次氯酸钙 次氯酸钠
漂白粉 溴水
过氧化氢 升汞 酒精
抗生素 硝酸银
9~10 2
饱和溶液
1~2 10~12 0.1~1 70~75 4~5（mg/L
1
易 易 易 易 最易 较难 易 中 较难
5~30 5~30 5~30 2~10 5~15 2~10 0.2~2 30~60 5~30
很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好 好
光
150C 250D HZC-250
养 箱
恒 温
5、细胞学鉴定设备
光学显微镜、体视 显微镜、倒置显微镜
光 学 显 微 镜
倒置显微镜
三、培养器皿及实验用具
1、玻璃器皿
三角瓶 培养皿 培养瓶
2、金属材质用具
接种针 镊子 解剖刀
四、洗涤技术
1、玻璃器皿洗涤
新购置玻 璃器皿
1%稀HCl
浸渍12h
已用过的 玻璃器皿
培养材料 的接种
（6）外植体灭 菌
流水冲洗10—20min 或更长时间
0.1%—0.2%氯化汞 液中浸泡10min左右
在10%的次氯酸钠、 饱和漂白粉浸泡 30min左右
70%—75% 酒精中浸泡 30s
蒸馏水冲洗 4—5次
备用
常用消毒剂消毒灭菌比较表
消毒剂
使用浓度 （%）
去除难易
消毒时间 （min）
温度（℃）
0.0 0.141 0.281 0.442 0.563 0.703 0.844 0.984
0
100
2
103.6
4
106.9
6
109.8
8
112.6
10 115.2
12 117.6
14 119.9
15
121.0
1.055
16
122.0
1.125
18
124.1
1.266
20
126.0
1.406
六、无菌操作
实验员消毒 实验室、无 菌台灭菌
实验台 卫生
实验器材 的灭菌
消毒
无菌接种
培养室 培养
1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接 种室。
2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯， 照射40min左右，后关闭。
3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面 和四周的台壁。
4、用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。
搁 水槽 架
搁
实
4.0m 架
验
台
电
炉
准备室
门
4.5m
冰箱 无菌台
药 品 及 无菌台 仪
器 无菌室
柜
缓冲室
搁
拉 窗
培养架
培养架
架 培养室
培
培
养
养
架
架
3.0m
3.5m
组织培养准备实验室
缓冲室
培养室
无菌室（一）
无菌室（二）
二、仪器设备
1、基本仪器设备136 6912 1358
冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯 水器、天平、移液器、解剖镜、光照 培养箱、摇床、生化培养箱、培养基 分装器、搅拌器等。
a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢； c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳
11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。
注意：操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工 作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡 和在火焰上消毒。
第二节 植物组织培养所需的环境 条件及营养成分
一、环境条件
与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受 到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养 基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植 体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的 影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一 个重要问题。
第二章 植物组织培养基本技术
第一节 实验室设置及基本技术 第二节 组织培养所需的环境条件及营养成分 第三节 培养基的配制与灭菌 第四节 外植体的选择和灭菌 第五节 外植体的接种和培养 第六节 外植体的褐变及其预防措施 第七节 玻璃化现象及其预防措施 第八节 试管苗的驯化和移栽
第一节 实验室设置及基本技术
温度
光照
湿度 环 境 条 气体 件
渗透压
pH值
一般最适温度在25±2℃之间
最常用的是光照16h，黑暗8h
一般情况下，培养器内相对湿度应达100%， 培养室内环境的相对湿度在70%—80%
氧气是愈伤组织生长所必需的 调节渗透压常常从糖入手 培养基的pH值大多在5.0—6.5，5.8
二、营养成分
植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素 在植物体内起到一定的生理作用：
一、实验室组成
组织培养实验室布局的总体要求
便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察
实验室 组成
基本实验室
准备室 缓冲室 无菌操作室 培养室
细胞生物学实验室 辅助实验室 温 室
生化分析实验室
基本实验室布局平面图
冰箱 电炉
酸度计
纯 天水 平器
培养基分装器
搅拌器
2、灭菌设备
蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、 过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。
蒸汽压力灭菌锅
干热消毒柜
无菌瓶顶过滤装置
（参考图）
喷雾消毒器
（参考图）
3、无菌操作设备
超 净 工 作 台
无菌接种箱
4、细胞培养设备
摇床
培养架
箱
培养
荡培
振照
22
127.8
1.543
24
129.6
1.681
30
134.5
50
147.6
（3）塑料器皿灭菌： 多采用高压蒸汽消毒灭菌
（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷
却后使用
（5）接种室灭菌
接种室
紫外灯 照射
超净工 作台
紫外灯 照射
70%—75% 的酒精擦洗
空气消 毒灭菌
消毒剂、抗菌素灭菌
2、灭菌
（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在9.8×104—10.8×104Pa 温度在121℃ 灭菌20—30min
（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌
饱和蒸汽压力与其对应的温度
饱和蒸汽压力
kg/cm2
1b/m2
5、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养 基的培养器皿，放进工作台。
6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95% 的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。
7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。
8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶 口各部分都烧到。
9、取下接种器械，在火焰上消毒。
10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。
洗衣粉 洗涤
清水 冲洗
晾干 备用
2、塑料用品洗涤
新的塑料器皿打开即用
已用过的 塑料器皿
2%NaOH浸泡 12h
蒸馏水 冲洗
清水 冲洗
晾干备用
清水 冲洗
2%—5%盐 酸浸泡 30min
3、金属用品洗涤
热洗衣粉水 洗净
冲洗
擦干
五、灭菌技术
1、灭菌方法
物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤
除菌等 化学方法：
效果
次氯酸钙 次氯酸钠
漂白粉 溴水
过氧化氢 升汞 酒精
抗生素 硝酸银
9~10 2
饱和溶液
1~2 10~12 0.1~1 70~75 4~5（mg/L
1
易 易 易 易 最易 较难 易 中 较难
5~30 5~30 5~30 2~10 5~15 2~10 0.2~2 30~60 5~30
很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好 好
光
150C 250D HZC-250
养 箱
恒 温
5、细胞学鉴定设备
光学显微镜、体视 显微镜、倒置显微镜
光 学 显 微 镜
倒置显微镜
三、培养器皿及实验用具
1、玻璃器皿
三角瓶 培养皿 培养瓶
2、金属材质用具
接种针 镊子 解剖刀
四、洗涤技术
1、玻璃器皿洗涤
新购置玻 璃器皿
1%稀HCl
浸渍12h
已用过的 玻璃器皿
培养材料 的接种
（6）外植体灭 菌
流水冲洗10—20min 或更长时间
0.1%—0.2%氯化汞 液中浸泡10min左右
在10%的次氯酸钠、 饱和漂白粉浸泡 30min左右
70%—75% 酒精中浸泡 30s
蒸馏水冲洗 4—5次
备用
常用消毒剂消毒灭菌比较表
消毒剂
使用浓度 （%）
去除难易
消毒时间 （min）
温度（℃）
0.0 0.141 0.281 0.442 0.563 0.703 0.844 0.984
0
100
2
103.6
4
106.9
6
109.8
8
112.6
10 115.2
12 117.6
14 119.9
15
121.0
1.055
16
122.0
1.125
18
124.1
1.266
20
126.0
1.406
六、无菌操作
实验员消毒 实验室、无 菌台灭菌
实验台 卫生
实验器材 的灭菌
消毒
无菌接种
培养室 培养
1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接 种室。
2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯， 照射40min左右，后关闭。
3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面 和四周的台壁。
4、用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。
搁 水槽 架
搁
实
4.0m 架
验
台
电
炉
准备室
门
4.5m
冰箱 无菌台
药 品 及 无菌台 仪
器 无菌室
柜
缓冲室
搁
拉 窗
培养架
培养架
架 培养室
培
培
养
养
架
架
3.0m
3.5m
组织培养准备实验室
缓冲室
培养室
无菌室（一）
无菌室（二）
二、仪器设备
1、基本仪器设备136 6912 1358
冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯 水器、天平、移液器、解剖镜、光照 培养箱、摇床、生化培养箱、培养基 分装器、搅拌器等。
a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢； c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳
11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。
注意：操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工 作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡 和在火焰上消毒。
第二节 植物组织培养所需的环境 条件及营养成分
一、环境条件
与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受 到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养 基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植 体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的 影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一 个重要问题。
第二章 植物组织培养基本技术
第一节 实验室设置及基本技术 第二节 组织培养所需的环境条件及营养成分 第三节 培养基的配制与灭菌 第四节 外植体的选择和灭菌 第五节 外植体的接种和培养 第六节 外植体的褐变及其预防措施 第七节 玻璃化现象及其预防措施 第八节 试管苗的驯化和移栽
第一节 实验室设置及基本技术
温度
光照
湿度 环 境 条 气体 件
渗透压
pH值
一般最适温度在25±2℃之间
最常用的是光照16h，黑暗8h
一般情况下，培养器内相对湿度应达100%， 培养室内环境的相对湿度在70%—80%
氧气是愈伤组织生长所必需的 调节渗透压常常从糖入手 培养基的pH值大多在5.0—6.5，5.8
二、营养成分
植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素 在植物体内起到一定的生理作用：