实验二 离体蛙心灌流

实验二蛙心灌流观察体液因素对心脏活动的影响
[原理]
心脏的正常节律性活动需要一个适宜的内环境（如Na＋，K＋，Ca2＋等的浓度及比例、pH值和温度），而内环境的变化则直接影响到心脏的正常节律性活动。

在体心脏还受交感神经和迷走神经的双重支配，交感神经末梢释放递质去甲肾上腺素，使心肌收缩力加强，传导速度加快，心率加快；迷走神经末梢释放乙酰胆碱，使心肌收缩力减弱，心肌传导速度减慢，心率减慢。

将失去神经支配的离体心脏保持于适宜的理化环境中（如任氏液），在一定时间内仍能产生自动节律性兴奋和收缩。

而改变任氏液的组成成分，离体心脏的活动就会受到影响。

用受体阻断剂阻断受体，则相应的受体不能发挥作用。

本实验通过观察内环境理化因素对维持心脏正常节律性活动的重要作用，了解Na+，K+，Ca2＋离子以及肾上腺素（β受体激动剂）、乙酰胆碱（M受体激动剂）等激素对心脏活动的调节意义。

各种体液因素都是通过影响细胞质内钙离子浓度来起作用。

钙离子浓度升高，心肌收缩力量增强，反之减弱。

[目的]
学习离体蛙心灌流的方法；
观察钠、钾、钙三种离子对心脏活动的影响；
观察肾上腺素、乙酰胆碱等因素对心脏活动的影响。

[材料及设备]
BL-420型生物机能试验系统，蛙，蛙心套管，蛙心夹，任氏液（与蛙心内环境相似的溶液），0.65%氯化钠，2%氯化钙，1%氯化钾，0.01%肾上腺素，0.0 1%乙酰胆碱，滴管，万能支架，张力换能器。

[方法及步骤]
（一）制备离体蛙心
1．用探针破坏蟾蜍的脑和脊髓。

2.蟾蜍固定。

将蟾蜍仰卧位固定于蛙板上。

3．打开蟾蜍胸腔。

用剪刀剪开胸骨表面皮肤并游离、去掉胸骨，再用眼科剪剪开心包以暴露心脏。

4.蟾蜍心脏插管。

用小剪刀在主动脉的根部朝心室的方向剪一小口，以灌有任氏液的蛙心滴管的尖端，由此口插入动脉球。

然后将插管稍向后退，再转向心室中央的方向，插入心腔内。

如确实插入心室，即以另一线将动脉球与套管的尖端一起结扎固定，然后将结扎剩下的线头结扎在套管侧壁的小玻璃钩上，并固定之，以免心脏滑脱。

注意：插套管时要特别小心，应逐渐试探插入，以免损伤心肌，然后滴入少量任氏液。

套管插好后的斜口应向心室腔，以免心室收缩时堵塞斜口。

如果其深度和位置合适，则套管中的液面随心脏的跳动而上升和下降。

于是可将与心脏相连的血管和其他组织剪断，摘出心脏，但切勿损伤静脉窦。

然后用任氏液洗涤心脏内外，并经常保持其湿润。

（二）仪器连接
将两个双凹夹固定于万能支架上，将连有分离好的离体蛙心的蛙心滴管固定在上方的双凹夹上，将张力换能器置于下方双凹夹，用连有丝线的蛙心夹于心舒期夹住心尖；再将丝线连结在张力感受器上（张力感受器事先接在计算机的3
通道上）。

即可在显示屏上显示出心博曲线，根据屏幕显示信号适当调整扫描速度和灵敏度等，等得到满意的图形就开始试验。

[实验项目]
•正常心脏收缩的曲线：用滴管向蛙心套管中注入1—3毫升任氏液（以后的溶液量均应与第一次相同）。

注意观察心跳频率和收缩强度。

•钠离子的影响：向套管中加入2%氯化钠数滴，观察心脏活动有何变化？
待心脏活动发生明显改变时，添加新鲜的任氏液进行洗涤，反复数次，
直至心脏恢复正常活动后，再加入其它溶液（以下实验皆同此）。

•钙离子的影响：向套管中加入1%氯化钙1—2滴。

观察心脏活动有何改变？
•钾离子的影响：向套管中加入氯化钾1—2滴。

观察心脏活动有何变化？
•肾上腺素的影响：向套管中加入0.1%肾上腺素1—2滴。

观察心脏活动有何改变？
•乙酰胆碱的影响：向套管中加入0.01%已先酰胆碱1—2滴。

观察心脏活动有何变化？
[实验结果]
图1 0.65%NaCl
（1）加入 0.65%NaCl溶液后，收缩幅度降低，心率变慢。

图2 1%KCl
（2）加入1%KCl后，收缩的幅度降低，心率变慢。

图3 2%CaCl
（3）加入2%CaCl2后，收缩的幅度变大，心率变快，甚至达到强制收缩，出现异常的停止搏动。

图4 1:5000肾上腺素
（4）加入肾上腺素，根据所得数据，心肌的收缩变大，心率变快。

图5 1:10000乙酰胆碱
（5）加入1:10000乙酰胆碱，收缩的幅度急剧下降，心率变慢。

[实验结论]
（1）观察到一定浓度的肾上腺素、Ca2＋可以使心脏搏动增强；
（2）NaCl（低钙任士液）、KCl、乙酰胆碱使心脏搏动减弱。

[结果讨论]
心肌细胞兴奋时，通过兴奋-收缩耦联机制，触发心肌细胞收缩。

心肌收缩的特点是：1.对细胞外Ca2+浓度的依赖性高；2.“全或无”式收缩。

心脏的正常活动有赖于内环境理化性质的相对稳定，所以改变灌流液的成分可以引起心脏活动的改变。

肾上腺素有加剧心脏搏动的作用，氯化钠、氯化钾、氯化钙及乙酰胆碱阻碍心脏搏动。

肾上腺素主要与心脏β1受体结合。

产生正性变作用。

乙酰胆碱与M受体结合，产生负性变作用。

心肌动作电位的产生和传导是以钠离子、钾离子和钙离子活动为基础的。

其对心肌活动影响如下：
1、氯化钠灌流：——细胞外钙离子浓度下降——心肌细胞动作电位期间钙
离子内流减少——心肌细胞胞浆钙离子浓度下降——心肌收缩力量减弱。

（心肌细胞外的钠离子浓度升高，钠离子内流与钙离子交换增加，导致心肌内钙离子浓度降低）
2、氯化钾灌流：细胞外钾离子浓度升高——膜内外钾离子浓度梯度减小——静息电位与阈电位之间的差距减小——AP平台期缩短——钙离子内流下降——兴奋收缩偶联下降——收缩力下降。

（钾离子与钙离子在心肌细胞上有竞争性抑制作用。

细胞外钾离子浓度升高会使钙离子内流受阻，从而使心肌收缩力量下降。

）
3、氯化钙灌流：细胞外钙离子浓度升高——钙离子内流增加——肌浆网钙离子浓度升高——钙与肌钙蛋白结合数量增多——心肌收缩力量增大。

4、ACh→与心肌M受体结合→抑制心肌细胞膜上Ca2+通道的开放→Ca2+内流↓→兴奋-收缩耦联↓→收缩力↓
ACh→与心肌M受体结合→K+外流↑, Ca2+内流↓→细胞内[Ca2+]↓→兴奋-收缩耦联↓→收缩力↓
5、NA与心肌β
受体结合→心肌细胞膜上Ca2+通道开放增加→Ca2+内流↑→兴
1
奋-收缩耦联↑→收缩力↑。