植物细胞质雄性不育性是由于细胞器和核基因组之间的不兼容性和防止自我授粉的结果 2

植物细胞质雄性不育性是由于细胞器和核基因组之间的不兼容性和防止自我授粉的结果，使混合育种农作物提高收益率。自1970年代（野生流产WA)细胞质雄性不育性已经利用在大多数三系杂交水稻生产，但在这一特性的分子基础仍然未知。我们在这里报告一个新的最近起源于野生水稻的线粒体基因WA352。授予WA细胞质雄性不育性是因为WA蛋白质编码和核线粒体蛋白质交互编码产生COX11基因。在WA352引起的细胞质雄性不育性系，WA352基因优先积累在花药绒毡层，从而抑制COX11基因在过氧化氢代谢的功能和引发绒毡层过早的细胞程序性死亡以及顺向花粉堕胎。WA352基因可以由两个恢复系的生育基因抑制诱导导致不孕，表明不同机制的存在来抵消有害的细胞质因素。因此，和细胞质雄性不育性相关的细胞质—核不兼容性是由于一个新进化的线粒体基因和基本核基因之间的有害交互作用守恒。

在混合农作物育种，跨越不同的自交系产生F的1杂交种通常有比亲本更高的收益率，一个现象是杂种或者杂种优势。然而，生产足够数量的杂交种子因很多物种构成的逻辑的问题，诸如大米的自我授粉繁殖。用水稻细胞质雄性不育性系作为雌株的母本来避免自花传粉对商业生产杂交水稻种子至关重要。1970年代细胞质雄性不育线粒体基因WA352在野生稻中被发现，野生稻中的细胞质被用到与籼稻杂交来生产细胞质雄性不育系的WA352线粒体基因系。三系杂交水稻的培育技术，其中99%使用细胞质雄性不育线粒体基因WA352系和其他的也携带了同样的细胞质雄性不育线粒体基因WA352的细胞质雄性不育系，三系杂交水稻培育技术具有较强的杂种优势,能增加粮食产量达到20%。三系水稻杂交培育种已经被种植在中国水稻种植面积总量的55%到60%，同样被种植在其它大约30个国家里，正因如此对农业有了一个很伟大的影响。很多细胞器功能障碍，比如线粒体病，是由于线粒体基因或相关的核基因基因突变所引起的。相比之下，细胞质雄性不育通常和额外的线粒体基因相关，因此可以由两个恢复系的核基因来抑制，其中许多三角状五肽蛋白质编码重复。为细胞质雄性不育系统提出了解释，包括线粒体能量不足，细胞质雄性不育蛋白细胞毒性和过早的绒毡层细胞程序性死亡。然而，细胞质雄性不育基因如何包括雄性不育尚未阐明，以及是否细胞质雄性不育感应涉及细胞质雄性不育蛋白质相互作用和核编码的线粒体系统因素未知。

为了确定CMS-WA的关键因素，我们通过检测整个CMS-WA线粒体基因组转录的RNA印迹，和一个探测器包含核糖体蛋白基因rpl5透露在CMS-WA系Zhenshan 97(ZS97A)18的不同文本。此外，这受Rf信使核糖核酸基因的影响。序列分析的两个ZS97A线粒体基因组克隆表面杂化到rp15透露一个15，15742 - bp重新排列DNA区域包括五段匹配水稻线粒体和核序列和两段来历不明的(补充图1 a)基因组。这个区域包含一个未知的rpl5 ORF下游包括三个水稻线粒体基因组片段和一段来历不明的(图1)基因组。5′区(512 bp)的ORF是相同的是前相同的水稻线粒体ORF,orf284,而3′区(583 bp)的ORF是高度相似的另一个预测水稻线粒体ORF,orf288;这些特征表明,这是最近进化重组结构。这种嵌合ORF编码一个假定的352 -残渣蛋白质与三个螺旋的跨膜片段(补充图 1 b),因此命名为WA352(野生流产的352)。不像大多数CMS基因那样和已知功能的线粒体基因有相似之处,比如那些参与ATP 产生的2-4,WA352和这些已知基因没有相似之处。植物线粒体（CMS）基因组转化目前是有限的，但CMS基因的功能可以通过测试核转换候补基因(s)与线粒体运输信号(MTS)12、19融合。我们构造了MTS-WA352转换结构，MTS-GFP-WA352和WA352由CaMV35S促进(P35S)和转移它们到中华

11(ZH11)和拟南芥粳稻品种的父本。几乎所有的(27/28)与MTS-WA352 T0转基因植物和大多数(27/42)的MTS-GFP-WA352花药花粉有异常与流产,但没有其他的表现型，和不育MTS-WA352被隔离，同样的，大多数(39/45)转基因a与MTS-WA352是雄性不育(补充图2 a和补充表1)。然而,所有27型大米和20 a .芥转基因植物与WA352(缺乏MTS)是雄性肥沃(无花果。1 b,补充图2 b和补充表1)。证明雄性不育需要线粒体WA352来定位，其他的转换与截断MTS-WA352构造和抑制WA352互动的基因o . COX11马唐(OsCOX11)也产生雄性不育(无花果。1 c,d和补充图2 b)。因此，WA-352是导致线粒体雄性不育的基因。

我们转录WA-352的下一个特征，RNA痕迹使用探针1(rpl5;图1 a)发现了一个比在ZS97B的探针5转录本更长的在ZS97A的探针1转录本。但探针2检测到三个转录本，PT-PCR计量显示一个未知功能的orf288，是在营养组织中表达，而不是在有受精能力的花药片段。使用PNA-RT-PCR检测转录本末端，我们确定了三个转录起始点和为了终止这些转录本的两个端点。最长的信使PNA是顺反子包含rpl5和WA352基因。其它两个双顺反子仅仅来自于在基因间区的不同起始点。暗示这个新的基因成为活跃在转录更始和转录与生物学rpl5。RNA是普遍的线粒体基因，但是没有生物发生在WA352信使PNA中。

CMS-WA在孢子体的基因方面，意味着WA352导致二倍体花粉细胞CMS。CMS-WA能通过任意一个显性Rf基因，Rf3 或Rf4被修复（见图6），位于染色体1号和10号[21-22]。我们利用三个近等基因系细胞质中的WA和细胞核中的ZS97A检测Rf基因如何影响WA352的表达，但那会携带不同的Rf基因型：ZSR1 (Rf3Rf3rf4rf4), ZSR5 (rf3rf3Rf4Rf4) and ZSR11 (Rf3Rf3Rf4Rf4)[21].在Rf4携带体系中，由于ZS97A的影响WA352和rpl5-WA352转录的数量减少到20%-25%，但是Rf3并不影响其数量（图2a,b；图7a,b）。这些减少可能影响rpl5的功能；因此，CMS-WA可能成为一个理想模型系统去研究负多效性和育性恢复的成本[23]。免疫印迹检测到的WA352在幼嫩花粉中的CMS-WA线，但在这些携带Rf3或Rf4的花粉中没有检测到。因此，Rf4 和Rf3抑制WA352通过不同的机制，可能与Rf4和Rf3功能表达翻译有关。显然的，在CMS-WA植物中，WA352 mRNAs 无处不在表达，但是WA352在花粉囊中只在累积的小孢子母细胞时期表达而不是在叶片中。在这些转基因植物叶片中，WA352（不含MTS）稳定积累，但是线粒体靶蛋白MTS-WA352无法检测到。此外，P35S::TS-GFP-WA352转基因株系中的抗GFP免疫组织化学表明融合蛋白表达主要在MMC期绒毡层上，并在减数分裂1期大量减少。这些结果表明，除了Rf基因的抑制，同时存在着WA352的影响，同样地对于ORF239在雄性器官特异性积累在菜豆的CMS系中。因此，绒毡层WA352的特异性决定了CMS的特异性。

为了进一步研究CMS-WA的分子机制，我们筛选水稻WA352互作蛋白通过WA352诱导两个酵母(Y2H)杂交，鉴别了11个候补蛋白（表2）。我们选择一个细胞核编码的线粒体跨膜蛋白OsCOX11做更进一步的研究。COX11蛋白保存在真核生物中，在细胞色素C氧化酶集合中发生作用。OsCOX11是组成型表达的（表9）。拟南芥AtCOX11（287个氨基酸残基），与OsCOX11有80%的相似性，亦与WA352相互作用（图3a）。Y2H缺失试验分析了两个WA352区域（残基218-292和294-352），能与OsCOX11相互影响（图3a）。与OsCOX11（图3a）WA352确定了两个区域（残基218-292和294-352）。同样，OsCOX11的一个37个氨基酸残基序列（184-220）的高度保守区域与WA352结合（图3b,c）。双分子荧光互补（BiFC）试验检测确认的OsCOX11在线粒体的定位和其在体内与