冰冻切片免疫荧光取材
各种组织冰冻切片、取材,染色等具体操作方法(连载一 脑、肠、眼球)
各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。
不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。
再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。
设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。
冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。
在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。
防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。
而且产生冰晶。
2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。
西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。
3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。
一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。
不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。
楼上的几位同仁说得不错。
就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点：1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。
神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。
免疫荧光法—冰冻切片
免疫荧光－冰冻切片间接法
免疫荧光法实验——冰冻切片
间接法
【标本】正常肝、肝癌标本冰冻切片
【抗体和试剂】
（1）荧光标记抗体：兔抗人LAPTM-4B-N端（胞浆内）一抗；羊抗兔IgG-TRITC二抗；小鼠抗人integrin α6 McAb；小鼠抗人EGFR多抗
（小鼠抗人EGFR单抗）；羊抗鼠IgG-FITC二抗（工作浓度为1:30）；
（2）0.01mol/L pH7.4 PBS
（3）2%BSA：用于配制一抗及封闭非特异性结合位点（可用正常羊血清封闭非特异性结合位点）
（4）缓冲甘油封片：1份0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液与9份甘油混合
0.2mol/L PB：X ml 0.2mol/L Na2HPO4 + Y ml 0.2mol/L NaH2PO4
pH8.0 X=94.7ml; Y=5.3ml
【染色步骤】
1．冰冻切片室温丙酮（冷丙酮）固定10min，PBS洗5min×3；
2．2％BSA37︒C封闭60min或4︒C过夜；
3．置切片于湿盒内，分别滴加一抗37︒C 30min；
4．PBS洗5min×3；
5．分别滴加二抗37︒C 30min；
6．PBS洗5min×3；
7．若染核；用1μg/ml Hoechst33342染色10min；PBS洗5min×3；
8．缓冲甘油封片；
9．荧光显微镜下观察或-20℃避光保存；。
冰冻切片 免疫荧光组化
冰冻切片免疫荧光组化
冰冻切片和免疫荧光组化技术是生命科学中广泛应用的技术。
以
下是两种技术的简介：
1. 冰冻切片技术：冰冻切片是把组织或细胞快速冻结并切成薄
片的技术。
不同于石蜡包埋技术，冰冻切片不需要前期的化学处理和
固定，具有样品保留完整活性、切片速度快、质量高等优点。
冰冻切
片广泛应用于免疫荧光组化、原位杂交、基因组学等技术中。
2. 免疫荧光组化技术：免疫荧光组化技术是一种利用特异性抗
体对目标分子进行标记和检测的技术。
该技术在机体免疫学、病毒学、肿瘤学和神经科学等领域广泛应用，可用于检测病毒、肿瘤标志物、
蛋白质表达、分子相互作用等。
通过将免疫球蛋白标记荧光染料或酶
标记物质后，通过显微镜或荧光显微镜观察样品上的染色，并进行分析。
该技术具有灵敏、特异、可视化等优点，已成为生命科学研究中
必不可少的技术之一。
冰冻切片免疫荧光实验步骤
冰冻切片免疫荧光实验步骤1. 前言嘿，朋友们！今天我们来聊聊一个科学实验的酷炫玩法——冰冻切片免疫荧光实验。
你可能会想，这听起来有点高深，其实没那么复杂，咱们用轻松的方式来搞定它！这个实验就像是给细胞穿上五光十色的衣服，让它们在显微镜下闪闪发光。
是不是听起来有点像魔法？不过，魔法背后可是需要一系列精细的步骤哦，接下来就让我们一起踏上这趟科学之旅吧！2. 材料准备2.1 器材首先，咱们得准备好一些“武器”。
你需要的工具有：冷冻切片机、显微镜、抗体、荧光染料、冰块、以及小瓶子。
别担心，这些东西在实验室里一般都能找到。
好比去超市购物，准备齐全才能大干一场嘛！2.2 样本收集然后，咱们得搞定样本。
可以用小动物的组织，比如小鼠的肝脏或脑组织，当然也可以是细胞培养。
像选菜一样，找个健康的样本，才能做出美味的实验结果。
记得小心翼翼哦，样本可是你实验的“主角”！3. 冰冻切片3.1 制作切片接下来就是最重要的环节了！将收集到的样本放进冷冻机，设置好温度，通常是在20°C到80°C之间，具体要看你使用的试剂。
等样本冰冻得像冰棍一样，取出来，用冷冻切片机将它切成薄薄的片，厚度大约在510微米之间。
要知道，切片越薄，观察的时候越清晰，就像看电影的时候画面越高清，效果自然越棒！3.2 贴片固定切好的薄片就像鲜花一样，需要“小心翼翼”地处理。
将切片放到载玻片上，记得用一些固定液，比如丙酮或者甲醇，给它们来个“定妆”！这样能让你的切片在后续步骤中更加稳固。
让我们给这些切片点个赞，做得不错哦！4. 免疫染色4.1 抗体孵育好了，接下来的步骤就像给细胞化妆一样。
把固定好的切片放进抗体溶液里，让它们充分“泡澡”。
通常来说，先用一抗（即特异性抗体）孵育，时间可以在1小时到过夜之间，视情况而定。
这个时候，你可以想象细胞们正开心地吸收着抗体，准备好接下来的“盛宴”！4.2 荧光染料待一抗充分结合后，咱们再来一剂“荧光染料”！同样把切片浸泡在二抗（荧光标记抗体）里，接着再静置一会儿。
冰冻切片详细说明
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。
⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。
⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。
切片可保存于10%甲醛液中。
⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。
冰冻切片 免疫荧光组化
冰冻切片免疫荧光组化都是生物医学研究中常用的技术。
冰冻切片是将组织样本冻结后，使用切片机将其切成薄片，用于病理学研究、免疫组化等方面。
冰冻切片是一种快速、简便的技术，适用于病理诊断，可以用于分析组织、细胞和细胞器的结构和功能。
免疫荧光组化是一种检测特定抗原或抗体在组织中分布情况的技术。
它利用荧光染料与抗原或抗体的结合来检测它们在组织中的位置。
这种技术可以用于研究细胞的分子结构和功能，诊断疾病，以及监测治疗的效果等。
在实际应用中，冰冻切片和免疫荧光组化常常结合使用。
首先，使用冰冻切片制备细胞或组织切片，然后通过免疫荧光染色技术检测特定抗原或抗体在切片中的分布情况，从而获得更详细的细胞或组织结构信息。
冰冻切片免疫荧光间接法实验
实验报告3.因为相同种属的一抗具有相同的同种型抗原表位，因此一种与一抗不同种属的二抗可以结合多种一抗。
间接法荧光标记一方面节省标记成本，提高通用性；另一方面提高灵敏性，使信号更强。
但容易出现非特异染色，所以要用用与二抗同种的正常血清或白蛋白与组织孵育，封闭非特异位点。
4.注意：1）一抗和二抗是不同种属来源的抗体。
2）标记二抗与一抗必须是同一类（通常用的是抗人IgG）分、均匀，同时降低非特异结合或吸附）。
3）反应后用PBS洗3次，每次5分钟。
4）在冰浴中预先用0.1MPBS 配制荧光标记二抗。
5）切片甩干，擦去多余PBS。
滴加适量的二抗，盖好湿盒。
于37℃恒温培养箱孵育2小时。
注意加二抗过程及孵育过程中避光。
6）为更好显示细胞结构，一般用蓝色DAPI衬染，以确定所检测抗原的位置。
DAPI分装后，一般用锡纸包裹避光，-20℃保存，用时提前取出解冻。
7）在二抗孵育结束前8分钟，取出湿盒，滴加荧光染料DAPI，吹吸混匀，盖好湿盒。
于37℃继续孵育8分钟。
注意实验过程中避光。
8）二抗孵育结束后取出切片置于染缸中，0.01M pH7.4PBS浸泡。
9）置于37℃摇床中摇洗三次，每次15分钟。
摇床转速一般每分钟100转，摇洗过程注意避光。
4.封片1）免疫荧光技术常用封片剂：缓冲甘油封片剂。
2）将浸洗好的切片甩干，擦去多余水分。
滴加甘油封片剂，轻轻盖上盖玻片，防止出现气泡。
待干燥后在盖玻片周围涂指甲油封边5.镜下观察立即用荧光显微镜观察。
注意：一般标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就有荧光减弱现象。
经荧光染色的标本最好在当天观察，随时间延长，荧光强度会逐渐下降。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT 包埋。
-20C保存3月，-80C长期保存。
请勿保存于液氮。
2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3，切片从-20 取出后，在通风橱放10-30 分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20 C 丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS 清洗玻片, 3X5min 从此请保持玻片湿润5, 有时,抗原修复3 小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度 ,时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间）,抗原修复液必须遵循自然降温规律, 使用足量的抗原修复液… 选择不同PH 值的修复液（A 液枸盐酸缓冲液PH6.0, B 液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温封闭1 小时封闭液：5%BSA+1 0%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS （细胞因子,无需封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1 小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14,干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1 ，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-, DDW5min4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。
-20℃保存3月，-80℃长期保存。
请勿保存于液氮。
2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（ A液枸盐酸缓冲液 PH6.0， B 液 EDTA-Na缓冲液 PH8.0， C液枸盐酸缓冲液 PH4.5）6，室温封闭1小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白7，一抗4℃过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14，干片后4℃保存石蜡切片的免疫荧光1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水： 58℃20min-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-， DDW5min4, Rinse 玻片 1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程
一、准备液体和器材：
1. 表面活性剂：TBS-T，Triton X-100，PBS，Ethanol，DMSO；
2. 染色液：PBS，Trizma-HCL，和4％PFA；
3.小刀：刀片用于切片，可以用来将切片切割为更小的片段；
4.水槽：若可用多个水室，可以将液体装入不同的水室，流程操作更便捷；
5.酶标仪：一般是用来进行荧光染色的，也可以用来进行基因分析。
二、准备样品：
1.将样品置于-80℃冰箱内，并将其在冰上进行切片；
2.将切片放置于室温，进行解冻，解冻时间需要20分钟至30分钟，静置时间应该在2小时左右；
三、免疫荧光染色：
1. 将冰冻切片浸入表面活性剂（TBS-T，Triton X-100，PBS，Ethanol，DMSO）中，使样品有足够的湿润；
2.接着将样品放入PBS，4％PFA溶液中；
3.将样品放入染色液中，依次洗涤，3次洗涤时间应该为30分钟；
4.将染色液置于酶标仪中，开始荧光染色；
5.酶标仪操作结束后，将样品取出，然后放入椰子油中水解，用来溶解染料分子；
6.最后，将样品放入可见光荧光镜下观察，观察免疫荧光染色的结果。
四、数据分析：
1.用酶标仪进行荧光染色实验时，结果会生成图像文件；。
石蜡切片及免疫荧光
一、石蜡切片1.固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。
3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5包埋:以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6.切片:切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7.贴片与烤片:般使用恒温水浴锅，温度控制在37-401左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60^恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。
8.切片脱蜡及水化:干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9染色:经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
二、冰冻切片1.取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
2.速冻：1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。
2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20S组织即迅速冰结成块。
冰冻切片免疫荧光取材
冰冻切片免疫荧光取材2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。
2.1.5.1 标本制备1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只，麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)，先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上），将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。
灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳；2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。
3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水；脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋；4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。
将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用；5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。
6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。
选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。
7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。
2.1.5.2 免疫荧光染色步骤1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次；2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）；3) PBS 洗10min×3 次；4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）；5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈；6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h；7) 一抗：甩去多余血清，不洗。
肾 活 检 冰 冻 切 片 免 疫 荧 光 染 色
肾活检冰冻切片免疫荧光染色
（直接法）
一．试剂
1.冷冻包埋剂OCT
2.荧光抗体：IgG-FITC,IgA-FITC,IgM-FITC,C3-FITC,C4-FITC,C1q-FITC，
Fg-FITC。
均用抗体稀释液进行1：100稀释。
二．取材
1.准备冷冻头（标号并预先包埋少量OCT）、纱布（生理盐水浸湿）、冰块
2.活检标本取出后，立即放入装有纱布的Tip管中，置冰块上送回实验室
3.组织立即置冷冻好的冷冻头上，再包埋少量OCT，恒冷切片机内制作冰冻切片（切片厚度为3um），用蒸馏水冲洗掉切片上的OCT;加稀释好的抗体，避光，湿盒内4℃过夜;蒸馏水洗2分钟×3次;荧光显微镜观察结果
三．注意事项：
1.取材后标本须快速冷冻
2.切片温度需适宜，不宜过高或过低
3. 染色过程中必须防止切片干燥，严格避光。
免疫荧光 双标
免疫荧光步骤（双标）1.冰冻切片制备将脱水后的脊髓标本放于冰冻托盘上，加OCT使组织被完全包埋，置于冰冻切片机中，调节箱体温度为-22℃，冷冻头温度为-23℃。
观察OCT冻成白色固态状时，将其放置于冷冻头，准备切片。
设置切片厚度为8µm，必要时用刷子辅助将切好的OCT薄片贴附于载玻片上。
室温下晾干载玻片后保存于-20℃冰箱。
2.免疫荧光染色（1）室温下晾干切片15min，待完全晾干后放置于湿盒内，PBS冲洗浸泡5min/次，3次（以除去OGT）。
（2）抗原修复液(1X)（双蒸水稀释），95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内)。
20-30分钟内冷却至室温。
PBS冲洗5min/次，3次。
（3）用滤纸吸干玻片上残余PBS，用免疫组化笔在标本周围画一适当大小圆圈，避免接触标本，将配置好的封闭液（5%驴血清=920ulPBS+50ul驴血清+30ul 10%trition）加入圆圈内，室温下封闭1h。
（4）用滤纸吸去封闭液，向标本加入相应一抗：（1%BSA）兔源一标：兔抗IL-33（1：50）小鼠源二标：小鼠抗NeuN（1：500，神经元）小鼠抗GFAP（1：300，星形胶质细胞）小鼠抗OX42（1：100，小胶质细胞）小鼠抗OLIG2（1: 25，少突胶质细胞）一抗于4℃静置过夜孵育。
（5）次日，PBS洗去一抗，10min/次，3次，用滤纸吸干PBS，之后操作均需避光，向标本加入相应二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG（1：300），Dylight 594标记驴抗小鼠IgG（1：300），二抗室温静置避光孵育2h。
（6）PBS清洗二抗，10min/次，3次，清洗后晾干后滴加DAPI封片，加盖玻片后于荧光显微镜下拍摄图片并保存。
计划：1.IL-33组：1）IL-33/NeuN X2个配比浓度2）IL-33/GFAP X23）IL-33/Iba-1 X24）只孵二抗X22.Sham组：1）IL-33/NeuN X12）IL-33/GFAP X13）IL-33/Iba-1 X14）只孵二抗需要购买：Triton-100，驴血清，一抗：小鼠抗RBFOX3/ NeuN、小鼠抗GFAP、小鼠抗OX42，二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG，BSA(牛血清白蛋白)注意：1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
肾活检标本的冰冻切片直接免疫荧光法中冰冻切片对包埋剂的选择及应用
肾活检标本的冰冻切片直接免疫荧光法中冰冻切片对包埋剂的选择及应用【关键词】包埋剂;肾活检标本;冰冻切片直接免疫荧光检查;冰冻切片;胶水肾脏疾病中,变态反应在其病因发病机制中占很大比重,所以在肾活检标本中显示抗原或抗体是很重要的,一般使用冰冻切片直接免疫荧光法观察切片标本上荧光抗体染色结果作为抗原的鉴定和定位。
冰冻切片直接免疫荧光法要求冰冻切片质量优良,制作一张质量优良的冰冻切片,制片过程中的每一步环节都很重要,其中包埋剂的使用也很关键,包埋剂包埋组织(-20℃~25℃)冷冻后对组织起到支托固定的作用。
现工作中制作冰冻切片常用包埋剂是OCT,在多年临床工作中,我科使用普通胶水替代OCT包埋,所制冰冻切片用于直接免疫荧光检查与使用OCT包埋剂所制冰冻切片用于直接免疫荧光检查效果相同。
1 材料与方法1.1 材料肾活检标本,普通胶水(把胶水装入用完的OCT包埋剂的空瓶中),冰冻托盘架置于(-20℃~25℃)冰冻切片机箱体中待用,载玻片、荧光抗体(兔抗人IgA、兔抗人IgG、兔抗人IgM、兔抗人C1q、兔抗人C3)抗体为丹麦DAKO公司产品,PBS,缓冲甘油等。
1.2 方法将肾活检组织取材后放置到待用的托盘架正中位置上(由于肾活检组织小,托盘架要做底座,用胶水替代OCT做底座),用胶水替代OCT将组织块完全包埋。
在-20℃~25℃温度中托盘架上的组织被包埋剂包裹迅速凝冻固定。
取下托盘架固定到冰冻机的冷冻头上。
(冷冻头设定温度为-15℃左右)开始修切冷冻头上的组织至合适时留片,切片要求尽量薄些,以利抗原抗体接触和镜检。
取出切片用吹风机冷风吹干固定。
PBS冲洗3次,3 min/次,甩去PBS加荧光抗体20 μl,置于37℃温箱孵育18~30 min取出,PBS冲洗3次,3 min/次,甩去PBS,缓冲甘油封片避光。
2 结果用胶水包埋的组织块凝冻迅速,质感均匀、易切出完整的组织片、易展片,留片后胶水在玻片上容易用水洗净,同时组织不易脱落。
组织冰冻切片如何进行免疫荧光
组织冰冻切片如何进行免疫荧光观察组织中目的蛋白的定位，一般可以选择冰冻切片进行免疫荧光。
冰冻切片制作时间短，操作过程简单快捷，同时获得的免疫荧光图片相对于免疫组化图更加漂亮。
冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
用高分子材料配制成冰冻切片包埋液，将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘上加少许包埋液，在其固化前嵌入组织块，然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
冰冻切片过程较简单，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态。
免疫荧光技术亦称荧光抗体技术，应用化学方法将荧光色素（主要是异硫氰酸荧光黄FITC）与抗体结合起来，即荧光抗体，这种结合荧光色素的抗体的免疫原性并不因此而发生改变。
在特定条件下用荧光抗体染标本，如果标本中存在有相应的抗原，荧光抗体便与标本中的抗原发生特异性结合，在荧光显微镜的蓝紫光或紫外光照射下，标本中的抗原抗体复合物便发出特异的荧光，荧光的出现表明被检标本中特异抗原的存在。
免疫荧光特异性强、敏感性高、速度快。
今天就为大家介绍一下冰冻切片免疫荧光染色流程。
冰冻切片免疫荧光染色流程1冰冻切片一般选择多聚赖氨酸黏附性载玻片，多聚赖氨酸处理载玻片是带强阳离子的,主要用于病理组织切片、液基细胞学涂片,作用是防止玻片掉片。
冰冻切片之后如果不即时染色，可将片子放于负八十冰箱。
再次取出后可先在室温晾干15分钟。
然后置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；2用组化油笔将待染组织圈好，目的是为了在进行后续孵育抗体时尽量缩小范围，使抗体进行有效的孵育；30.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）;用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干）封闭的目的是通过血清与非特异性位点结合,以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性和降低背景；4加入一抗(1:100-1：500)，4℃孵育过夜。
冰冻切片免疫组化步骤
冰冻切片免疫组化步骤1.需要准备的材料Apes涂层玻片PBS（pH 7.4）4%多聚甲醛pbst（含tween-20）Pbst-g（含0.3mol/l甘氨酸）2.冰冻切片取出纸巾，放在软塑料盖或专用小盒中，然后慢慢平放在装有液氮的小杯中，让盒子底部与液氮接触（小盒和纸巾不应浸入液氮中），组织会在大约10-20秒内迅速冻结成块。
取出薄冰，立即储存在-80℃的冰箱中备用，或在恒温切片机中冷冻。
切片厚度4-8um(5um)，对于免疫组化的需要用apes包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。
如果切片后不立即染色，必须将其吹干并存放在低温冰箱中。
3.免疫组化染色步骤固定：取出切片，在室温下放置5分钟。
在室温下用4%多聚甲醛PBS溶液固定15分钟，用PBS冲洗三次（可采用侧斜浸出或在盘中摇动的方式进行冲洗）。
打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（tritonx-100）打孔：组织样品浸于含0.25%tritonx-100的pbs中10mins，之后用pbs洗3次，每次5mins。
如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。
阻断：将组织放入含有1%BSA的PBST溶液中30分钟，阻断非特异性结合抗体。
对于用多聚甲醛和免疫荧光固定的样品，向封闭缓冲液中添加0.3mol/l甘氨酸。
孵化：组织样本浸于一抗（用含1%bsa的pbst稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。
用pbs洗3次，每次5mins。
在室温下将二级抗体（1%BSA的PBST溶液）浸泡1小时。
PBS洗涤3次，每次5分钟。
染色：浸入0.1-1ug/ml的dapi或hoechst中，染色1min，pbs淋洗三次。
封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。
冰冻切片免疫组化步骤
冰冻切片免疫组化步骤
1.需要准备的材料
APES包被的载玻片
PBS
4%多聚甲醛
PBST含Tween-20
PBST-G含L甘氨酸
2.冰冻切片
取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内,之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内,让盒底部接触液氮小盒及组织块切勿浸入液氮内,大约10-20秒组织即迅速冰冻成块;取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用,或置于恒温切片机冰冻切片;
切片厚度4-8 um 5 um,对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片,以增加组织片的粘附性;
切片后如不立即染色,必须吹干,储存于低温冰箱内保存;
3.免疫组化染色步骤
固定：取出切片,室温放置5mins;用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins,PBS冲洗三次冲洗可以采用侧斜淋洗,也可至于平皿中摇晃;
打孔：如果是需要染细胞内的蛋白,用曲拉通TritonX-100打孔：组织样品浸于含% TritonX-100的PBS中10mins,之后用PBS洗3次,每次5mins;如果是染膜蛋白的,不需要曲拉通打孔;
封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins,封闭非特异性粘合的抗体;对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本,在封闭缓冲液中加入L的甘氨酸;
孵化：组织样本浸于一抗用含1%BSA的PBST稀释,放于湿盒中,室温1h或4℃过夜;用PBS洗3次,每次5mins;
浸入二抗1%BSA的PBST溶液,室温1h;PBS洗3次,每次5mins;
染色：浸入mL的DAPI或Hoechst中,染色1min,PBS淋洗三次;
封片：用盖玻片封片,指甲油固定,保存与4或-20℃;。
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2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。
2.1.5.1 标本制备
1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只，
麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)，
先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上），
将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。
灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳；
2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。
3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水；
脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋；
4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。
将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用；
5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。
6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。
选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。
7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。
2.1.5.2 免疫荧光染色步骤
1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次；
2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）；
3) PBS 洗10min×3 次；
4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）；
5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈；
6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h；
7) 一抗：甩去多余血清，不洗。
滴加PBS配置的一抗，4℃过夜。
阴性对照用PBS替代一抗；
8) PBS 洗10min×3 次；
9) 二抗：滴加Alexa Fluor488 标记的驴抗羊荧光二抗（均为1：200配置），20~25℃室温避光孵育2h；
10) PBS 洗10min×3 次；
11) Hochest33342 复染核10~20min；
12) PBS 洗10min×3 次；
13)抗荧光衰减封片剂封片，置于避光盒内；
14) Olympus F1000 激光共聚焦显微镜用488nm 波长的激光器激发绿色，计算机进行数据采集和成像。