冰冻切片免疫荧光取材

2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。

2.1.5.1 标本制备

1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只，

麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)，

先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上），

将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳；

2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。

3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水；

脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋；

4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用；

5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。

6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。

7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。

2.1.5.2 免疫荧光染色步骤

1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次；

2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）；

3) PBS 洗10min×3 次；

4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）；

5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈；

6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h；

7) 一抗：甩去多余血清，不洗。滴加PBS配置的一抗，4℃过夜。阴性对照用PBS替代一抗；

8) PBS 洗10min×3 次；

9) 二抗：滴加Alexa Fluor488 标记的驴抗羊荧光二抗（均为1：200配置），20~25℃室温避光孵育2h；

10) PBS 洗10min×3 次；

11) Hochest33342 复染核10~20min；

12) PBS 洗10min×3 次；

13)抗荧光衰减封片剂封片，置于避光盒内；

14) Olympus F1000 激光共聚焦显微镜用488nm 波长的激光器激发绿色，计算机进行数据采集和成像。