转基因动物与动物生物反应器
09转基因动物与生物反应器-HXY78页PPT
转基因动物技术路线
外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物
转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系
哺乳动物生殖生理
哺乳动物受精和妊娠，整乳动物的制备方法
显微注射法 逆转录病毒载体感染 胚胎干细胞介导法 精子载体介导法 YAC介导的基因转移
1 显微注射法
雄性原核
显
受精卵
微
注
射
显微注射
法
操
作
胚胎移植
流
程
后定检测
显微注射法的优点
a、转移率较高、整合效率达30%； b、外源基因长度可达50Kb； c、方法简单，导入过程直观；
缺点
a、设备昂贵、操作复杂； b、随机整合、首尾相连的多拷贝； c、常造成插入位点附近宿主DNA大片
段缺失、重组等突变，出现动物严重 生理缺陷； d、外源基因能否稳定整合要到子一代 中筛选得到。
1987年美国科学家戈登（Gordon）等 人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋 白──tPA（组织型纤溶酶原激活物）， 展示了用动物乳腺生产高附加值产品的 可能性。利用动物乳腺生产高价值产品 的方式称为乳腺生物反应器。
微生物反应器 植物反应器 动物反应器
(一) 优点 1可以利用发酵工程 技术大规模生产。 2 胞外活性物质制备 容易。 （二）不足 1哺乳动物或人类的 基因往往不能表达。 有些表达了，却没有 活性，需要进一步修 饰。 2真核生物蛋白质翻 译后加工的精确性有 限。 3需要大型发酵设备 和车间。 4细菌发酵常形成不 溶聚合物，使下游加 工成本增加。
疾病模型
基因转移方法
转导的基因
生物乳腺反应器的原理及进展
动物乳腺生物反应器的原理及进展摘要：动物乳腺生物反应器技术是转基因技术的应用，于上世纪80年代提出，其目的是利用动物乳腺产生目的蛋白。
利用该技术生产的蛋白具有低成本，高活性，易提取纯化的优点。
虽然该技术尚处于发展时期，但具有广阔的应用前景和巨大地商业潜力，是许多公司大力发展的对象。
关键词：动物乳腺生物反应器、原理、进展、优点动物乳腺生物反应器（mammary gland reactor）是指利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并能从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。
1生物反应器(bioreactor) 经历了3 个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。
细菌基因工程产物往往不具备生物活性,必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后, 才能成为有效的药物,而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻,成本太高,限制了规模生产。
动物生物反应器具有产品质量高,容易提纯的特点，弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。
它是在转基因技术体系基础上发展起来的。
7自从上世纪80年代出现以来，已经取得了许多突破，现己成为生物技术研究的热点。
并向商业化阶段转变，显示了广阔的应用前景。
并且利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用奶，以期望获得既能满足蛋白质需要，又能增加抵抗力的品质全面的奶，为人类服务。
21、动物乳腺生物反应器的原理乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA 技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。
1 外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。
它是一个专门化的分泌腺体，可以生产出具完全生物活性的药用重组蛋白质，其纯化简单，生产投资及成本相对较少，而且对环境不具污染性，也被称为“分子农场”。
转基因生物反应器
反转录病毒感染法：将含目的基因的反转录病毒载体人为感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生转基因动物。
01
特点：基因转移效率、感染率、整合率明显高于其他基因转移方法。
02
但不能完全杜绝反转录病毒在转基因动物生产的商品中的污染。
03
卵母细胞显微注射法 基本方法：将带有外源目的基因的反转录病毒通过显微注射技术注入卵母细胞的卵周腔，通过体外受精，胚胎移植获得转基因动物。 优点（ห้องสมุดไป่ตู้62） 适合制备大型转基因动物 对卵的机械损伤小 提高外源基因与核染色体接触的机会 提高外源基因的整合率
01
优良动物的育种：通过转基因可获得生长快速、品质良好、抗病力强、产量高的动物品种。
03
在异种器官移植中，通过转基因技术以期获得人类所需的不被免疫排斥的器官。
05
转基因动物模型与基因治疗
02
在医药领域：通过相应转入目的基因的动物获得所需的药物
04
生物反应器：P263－265 优点：易养殖、通过乳腺和血液制备活性物质简单易行 不足：制备转基因动物成本高 易产生一些伦理问题
曾溢滔院士预测称，目前一种新药从它的研制开发、通过药审、直到上市，约需10~15年。如果利用转基因动物-乳腺生物反应器，新药生产的周期为5年左右。
据悉，曾溢滔院士在1998年研制出转基因羊、1999年研制出转基因牛，这两项成果，震惊了世界，并连续两年获得两院院士评选的十大科技进展。
12.4 转基因植物生物反应器
方法：外源目的基因导入能进行体外培养的动物细胞，再以这些细胞作为核供体，利用克隆动物技术获得转基因动物。
优点（262）
获得转基因动物的效率高
通过鉴别核供体核型预知转基因动物性别
所需动物数量大为减少
转基因动植物生物反应器 综述
转基因动植物生物反应器生物技术1002摘要:生物反应器，指以活细胞或酶为生物催化剂进行细胞增殖或生化反应提供适宜环境的设备，它是生物反应过程中的关键设备。
随着转基因技术问世,生物反应器不再局限于传统“冷冰冰”的设备，而是富有生命特性的动植物。
动植物生物反应器指的是通过基因工程途径以常见的农作物或者活体动物，高效表达某种器官或组织，进行工业化生产功能蛋白等生物制剂。
本文为大家阐述了转基因动植物反应器的优缺点，研究进展及其应用。
关键词:转基因动物反应器，转基因植物反应器，优缺点，研究进展，应用一、转基因动植物生物反应器的优缺点1.1转基因动物生物反应器的优点1易养殖，实现大规模制备。
2通过乳腺和血液制备活性物质简单易行。
3可以通过动物细胞培养实现大量制备。
4产量高，转基因动物在每升乳汁中可得几十克产物，而转基因植物，微生物在每升培养液中只能获得几毫克。
5成本低，用细菌、酵母菌或动物细胞生产基因工程药物，反应条件要求严格，而转基因动物只需要正常饲养。
6用于转基因动物制药的受体牛、羊、猪等哺乳动物，与人类亲缘关系比细菌、酵母菌要近的多，所以其产品具有与人体自身产生的蛋白相同的生物学活性川。
7用转基因动物培植活体器官和组织，用于更替人体患病的器官和组织。
1.2转基因动物生物反应器的缺点1细胞培养需要昂贵的培养基和设备。
2转基因动物制备成本昂贵。
3转基因动物易产生一些伦理问题。
4目前转基因动物的研究存在理论基础薄弱、技术不完善等问题"使得转入的基因在受体动物基因组中存在着随机整合、调节失控、遗传不稳定、表达率不高等问题。
为确保转入的基因能得到高效表达并完全整合，关键是基因构建和位点整合。
5转基因表达产物的分离与纯化也存在问题，可能会出现要纯化的产物含量低的现象，还要确保去除引起人类变态反应的非人类蛋白。
6转基因表达产物的结构和生物活性是否与人体蛋白相似#转基因产品必须与人体产生的蛋白高度相似，以免人体对它产生免疫反应。
生物反应器的分类与发展
分都可经过人为驯化为生物反应器
动物血液生物反应器
动物膀胱生物反应器
动物生物反应器
外源基因编码产物可直 接从血清中分离
出来,血细胞组分可通 过裂解细胞获得，
外源基因在膀胱中表达的转基因动物 生物反应器,叫动物膀胱生物反应器
动物乳腺生物反应器
动物乳腺生物反应器利用哺
泌尿系统
乳动物乳腺特异性表达的启 动子元件构建转基因动物,
生物反应器是发酵工程中最重要的设备之一
原料
原料制备 预处理
能量 灭菌
过程控制
生物 反应器
能量 产品回收
产物
空气
空压机 除菌
热量
废物
二、生物反应器的分类
机械搅拌式反应器 气升式生生物反应器
动物生物反应器 植物生物反应器
生物反应器有很多种,按照不同的分类角度
组织或整株植物，
其中以转基因植物作为生物反应器生产贵重药物和疫
苗已经成为植物基因工程中最有研究前景和商业价值的领
域，
植物生物反应器种类不断增多, 从最初的烟草、拟南
芥到后来的马铃薯、番茄、香蕉、木瓜、豇豆、菠菜、苜
蓿、油菜和芜青等,表达产物包括疫苗、抗体及其片段、
细胞因子、酶及其它药用蛋白和生物活性肽等，
3 生产啤酒 4 生产能源
目前用来生产啤酒的填充 床固定化细胞反应器已完 成中试进入工业生产阶段
光合细菌利用有机物作为电子供 体光敏产氢为工业化生产清洁、 无污染的生物能源提供了具有竞
争力的技术方法
2、动物生物反应器
一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动 物生物反应器，几乎任何有生命的器官、组织或其中一部
在转基因家畜血液中得到人免疫球蛋白、d 球蛋白、B球蛋白、胰蛋白酶、干扰素和生长激素 等,并且都具有正常的生物活性，美国哺乳动物细 胞表达或生产的生物技术药物有53种，
转基因动物应用的研究现状与发展前景
3、生物反应器：转基因动物可以作为生物反应器，生产具有重要价值的生 物制品，如药物、工业原料等。
然而，要实现这些目标，还需要在政策、技术和社会接受度等方面取得更多 的支持。
三、关键技术
转基因动物应用的关键技术包括基因编辑技术和合成生物学等。基因编辑技 术可以通过对动物基因进行精确的改造，实现对动物性状的改良。合成生物学则 通过设计和构建新的生物部件，实现对动物基因组的全面改造。这些技术的不断 发展，为转基因动物的应用提供了更多的可能性。
结论
总的来说，转基因动物的发展前景是广阔的。虽然仍存在一些技术和社会层 面的挑战，但随着科技的不断进步和应用的深入挖掘，转基因动物将在未来生物 科技领域发挥越来越重要的作用。通过国际合作、政策推动和公众教育，我们可 以期待转基因动物在未来的发展中实现更多的突破和创新。
引言
转基因动物研究是生物技术领域的一项重要前沿课题，旨在通过改变动物的 遗传信息来提高其性能、增强其抗性或用于疾病治疗等。随着科学技术的不断进 步，转基因动物研究取得了显著的成果，从提高畜禽生产效率到治疗人类疾病等 方面，转基因动物都有着广泛的应用前景。本次演示将介绍转基因动物的研究进 展及未来发展趋势。
为了实现这些目标，需要科研人员继续深入研究转基因动物的机制和安全性 问题，并加强国际合作和技术交流。同时，需要制定更加科学、严格的法规和伦 理指导原则，以确保转基因动物研究的安全性和可持续性。
结论
转基因动物研究是生物技术领域的一项重要技术，具有广泛的应用前景和巨 大的价值。在过去的几十年中，科研人员已经在提高畜禽生产性能、增强抗性、 构建疾病模型等方面取得了显著的成果。然而，仍需转基因动物的安全性、法规 和社会接受程度等问题。未来，随着科研技术的不断进步和法规体系的不断完善， 转基因动物研究将有望为人类社会的发展做出更加重要的贡献。
转基因动物与动物生物反应器ppt课件
Gordon等首次成功地将含有HSV和SV40 DNA 片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精 卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序小 鼠。
1982年，Palmiter等运用此法得到的所谓“超 级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。
到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、 兔、牛等等大小动物。
4
动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源 基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。
一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的 第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射 法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合 体动物。
当外源基因在转基因动物体内表达，并培育出其 表型与人类疾病症状相似的动物模型，则称其为 转基因动物模型。
目前, 已经培育出了动脉粥样硬化、镰刀形红细胞 贫血症、痴呆症、自身免疫病、淋巴系统病、真 皮炎及前列腺癌等多种疾病的模型动物,为这类疾 病的研究提供了方便。
35
（3）动物品种改良
通过外源基因的导入，改造动物的基因组,可 达到使家畜、家禽的生长速度加快，肉、蛋或奶 产量及品质提高，饲料利用率提高、抗病力加强 的目的。 目前应用最广的是，通过此技术改变牛奶的品质 和成份。在我国已获得转人乳清白蛋白、人乳铁 蛋白等转基因牛奶，为我国的“人源化牛奶”产 业化定了重要的基础。
2
转基因动物（transgenic animal）的概念
指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染 色体内，外源基因与动物基因整合后，随细胞的 分裂而扩增，在体内表达，并能稳定的遗传给后 代的动物。
即指基因组中整合有外源基因的一类动物。 整入动物基因组的外源基因被称为转基因
(transgene)。
类具有较多的相似性。 因而猪在提供人类移植所用的器官方面成为
动物乳腺生物反应器的研究概况
动物乳腺生物反应器的研究概况摘要：转基因动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并从转基因动物乳汁中获取重组蛋白。
近年来，生物学和分子生物学研究领域的成就促进了该技术的蓬勃发展。
本文简要概述了转基因动物乳腺生物反应器的基本概念、原理、特点及应用，并重点阐述了其研究现状及前景，从而探讨其存在的问题。
关键词：转基因动物；乳腺生物反应器；进展Abstract：Mammary gland bioreactor of transgenic animals is a useful biological technology, which expresses foreign genes under the direction of special promoters of the mammary gland as regulating components in the mammary gland and produces functional pharmaceutical proteins in milk．In recent years，achievements of biology and molecular biology accelerate the development of this technology. This paper briefly reviews the basic concepts, principle, chara- cteristics and applications of the mammary gland bior- eactor of transgenic animals，especially summarizing its current research status and bright future，meanwhile discusses the problems existed．Key words:transgenic animals；mammary gland bioreactor；progress前言21世纪是生命科学突飞猛进的时代，生命科学在人类生活中占有极为重要的位置。
第9章 转基因技术
重组目的基因的结构示意图
限制性核酸内切酶
20
21
DNA连接酶
22
转入受体进行表达
23
二、中游部分
1、外源基因的导入 2、外源DNA整合、转录及表达的检测
24
1、外源基因的导入
1）受精卵原核显微注射法 2）逆转录病毒感染法 3）胚胎干细胞法 4）精子载体法 5）细胞核移植法 6）脂质体介导法 8）基因打靶 9）原始生殖细胞技术
效率高
感染率高、细胞损伤小，胚胎存活率高。
宿主范围广泛，外源DNA在整合位点附近较少发生缺失 和重排
呈单位点、单拷贝整合，并且不受胚胎发育阶段的限制。
43
缺点：
逆转录病毒载体容量有限，只能转移≤10kb的DNA，转 入的基因一般没有其邻近的调控序列。
载体病毒基因有潜在的致病性，携带外源基因的病毒 载体在导入受体细胞过程中有可能激活受体细胞DNA序 列上的原癌基因或其它有害基因，威胁受体动物的健 康安全。
基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
48
第二节
原理 同源重组(homologous recombination)
发生在同源序列间的重组，通过链的断裂 和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链 或双链片段的交换。 细胞水平实现基因的定位修饰
49
50
51
优点：
可对阳性细胞选择，实现外源DNA的定点整合，避免 了随即整合的缺点。
，是一项旨在培育肉多低脂且环境友好型家禽的研究组成部
分。无毛鸡能够减少养殖户用在防止鸡遭受高温侵袭的通风
设施上的投入
9
约翰斯-霍普金斯大学的科学家注视着两只小老鼠，左边的 是一只普通老鼠，右边的是一只转基因老鼠，肌肉发达程 度是普通老鼠的2到3倍。在对一种新发现的基因进行研究 时，科学家培育了转基因鼠。这只转基因鼠有助于科学家 寻找伴随癌症或者艾滋病出现的肌肉萎缩症的治疗手段。
细胞工程-7.转基因动物与生物反应器
从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。
整理：灵魂的心碎 更多内容请联系 linghundexinsui@
■ 目的基因的选择
选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因。
■ 体外重组
选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。
■ 基因转导
将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。
■ 胚胎移植
利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁，来获得目的基因表达产物。
━转基因技术:通过人工方式将外源基因整合到生物体基因组内，并使该转基因生物能够稳定地将此基因遗传给后代的技术。
━转基因动物:在基因组内稳定地整合外源基因，并且可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。
━转基因动物细胞反应器制备流程
■ 外源目的基因的制备
■ 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
■ 选择获得携有目的基因的细胞
■ 选择合适的体外培养系统和宿主动物
■ 转基因细胞胚
■ 胎发育及鉴定
■ 筛选所得的转基因动物品系。
━生物反应器的类型
■ 动物血液生物反应器
■ 动物乳腺生物反应器
■ 动物膀胱生物反应器
动物乳腺生物反应器的制备
■ 表达载体的构建
目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控元件。
细胞工程(动物部分)
绪论1.细胞培养与组织培养：属于体外培养，是指生物细胞和组织在离体条件下的生长和增值。
细胞的离体培养称为细胞培养，组织的离体培养称为组织培养。
2.细胞融合：又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。
3.细胞核移植：是利用显微镜操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂合细胞的过程。
4.干细胞：是动物体内具有分化潜能、并能自我更新的细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。
5.转基因动物：是通过基因工程技术将外源的目的基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。
第一章1.细胞工程实验室与其他一般实验室的区别：要求保持严格无菌环境、避免微生物及其他有害因素的影响。
2.细胞工程能进行的六方面工作：无菌操作、培养、制作、清洗、消毒灭菌处理和储藏。
3.植物细胞工程实验室特殊的设置：光照条件的培养箱、试管苗需要温室和移植驯化室。
4.细胞工程实验室通用的仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、电热干燥箱、水纯化装置、低温装置、高压蒸汽消毒器。
5.实验室的生物安全分为p1，p2 ，p3 和p4四个生物安全等级，其中P4生物安全实验室等级最高。
第二章1.清洗的主要目的是清除培养器皿中的杂质和微生物等影响细胞生长的成分。
2.细胞培养过程中主要使用两类消毒方法:物理灭菌法法和化学消毒法。
物理法灭菌法：a.紫外线法适用于无菌室或超净工作台的台面等大面积消毒。
紫外线照射工作台面的距离不应超过1.5cm,照射时间以30min左右为宜。
（注意：紫外灯关闭5min后方可进入使用）b. 湿热消毒:适用于含有不耐热成分的培养基和试剂的消毒，为121.3℃，20min .（注意点：加足水、排尽气、气压降到0时才能打开盖）c.干热消毒法:适用于消毒玻璃仪器，160℃以上，并保持90~120min，以杀死细菌和芽孢 d.过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤,薄膜0.22~0.45um直径。
第9章 转基因动物与生物反应器
优点：
鸡输卵管是一个自我封闭的系统，肝脏 合成蛋黄中的蛋白质和脂肪，并由血液 直接输入输卵管，避免大量表达的外源 性蛋白质对鸡健康造成的危害。
产量可观，且成本低廉。
产品的活性接近天然产品
本章结束
在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将 DNA注射进去。
3、裸DNA直接转移法：效率低。
显微操作系统
二、化学方法
1、DEAE-葡聚糖介导法：效率低
(乙二胺乙基葡聚糖)
DNA上的磷酸带负电
DEAE带正电
→ DNA大颗粒→ 细胞胞饮
2、磷酸钙-DNA共沉淀法：效率低(P254)
表面活性剂
3.脂质体介导法(P255)
转基因动物乳腺生物反应器的优越性： 产品质量稳定，活性高； 可持续大量地表达； 成本低，经济效益显著； 无污染； 药物分离纯化工艺简便，可获得纯度
高达99%的产品； 研制开发周期短。
转基因动物乳腺生物反应器存在的问题：
转基因在受体动物基因组中随机整合， 有些存在调节失控、遗传不稳定、表达 率不高等问题
第9章 转基因动物 第9章与生转物基反因应动器物
与生物反应器
9.1 转基因技术
通过人工操作的方式将外源基因整合到 生物体基因组内，使该转基因生物能稳定 地将此基因遗传给后代的实验技术。
细胞转染外源基因分三步：
(1)选择合适的受体细胞; (2)有效的转染方法； (3)转化后的筛选。
细胞转染外源基因的方法：
9.2.1 转基因动物的制备
一、步骤： •外源目的基因的制备； •目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞； •选择获得携有目的基因的细胞； •选择合适的体外培养系统和宿主动物； •转基因细胞胚胎发育及鉴定； •筛选所得的转基因动物品系。
细胞工程动物要点总结
第十章动物染色体工程动物染色体倍性改造：染色体倍性改造工程是指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术，主要包括多倍体育种和单倍体育种。
染色体加倍技术：1、化学诱导方法：（1）秋水仙素：秋水仙素能抑制和破坏纺锤丝的形成。
因此，用秋水仙素处理正在分裂的细胞，可使染色体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多倍体的细胞。
（2）细胞松弛素B：通过抑制动物的肌动蛋白聚合成微丝，阻止细胞质的分裂。
（3）麻醉剂N2O等。
2、物理诱导法：（1）温度休克法：包括略低于致死温度的冷休克法(0～5℃)和略高于致死温度的热休克法(30℃左右)两种。
温度休克法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段。
它受三个因素的制约：温度处理的开始时间,即受精后的时间(TA)处理持续时间(D)处理温度(T)。
（2）水静压法:采用较高的水静压(65 kg／cm。
)来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。
（3）高盐高碱法.3、生物学方法生物学方法主要是通过杂交方法，尤其是种间或不同属、科间的远缘杂交，使染色体加倍，也称为染色体组的合并技术。
如狮子和老虎杂交，马和驴杂交。
多倍体的倍性鉴定:1、直接法：（1）染色体计数法：染色体计数是鉴定多倍性的一个准确的直接方法，但比较费时。
质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎细胞分裂指数高。
（2）DNA含量测定：流式细胞仪(flow cytomety)可以简单、快速及准确测定单细胞DNA含量，从而确定细胞的倍性。
2、间接法：（1)细胞体积测量：按照一般规律，细胞大小与染色体数目成比例增加，而且为维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。
但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。
红细胞体积测量简便易行。
（3）蛋白质电泳（3）生化分析：二倍体和三倍体的血液成分和细胞组成比例不一样。
动物多倍体育种的意义：（1）诱导的多倍体动物多数都具有良好的生长率（2）低等动物(如鱼类等)的种间杂交优势也非常明显。
动物生物反应器
（2）目的基因的选择 选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻 译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用 前景广阔的蛋白基因。
（3）体外重组及检测
选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构 建融合基因。并将构建的表达载体转染至动物乳腺细胞中表 达，提取细胞分泌蛋白，检测目的基因表达情况。
乳腺动物反应器建立的关键在于： 乳腺组织特异性表达载体构建的合理性和有效 性，这包括外源基因在活体动物组织中分泌表达，
表达是否具有组织特异性，表达水平及其蛋白是
否具有全部的生物学活性。
为解决这些问题，国外采用的的方法：
• 采用BLG、WAP、酪蛋白启动子及部分内含子等乳腺定位
表达调控元件进行乳腺特异性表达的调控。
转基因动物乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商
业化生产水平的生物反应器。
• 动物就像一个活的发酵罐，其温度、气体、水分
和PH值均由动物自身调控，所以常被喻为药物工 厂、生物反应器、基因农场或分子农场。 • 动物生物反应器优点： ① 表达产物能充分被修饰且具有稳定的生物活性。 ② 产品成本低。可无限繁殖，且饲养成本低，可 大规模生产。 ③ 产品质量高，易提纯。由动物生物反应器生产 的药品为纯的生物制品，避免了化学试剂及生物 毒素的污染，安全可靠。 ④ 生物反应器目的基因对动物内部组织器官的干 扰和影响不大，一旦获得有高效表达的祖代个体， 其遗传性即可保证维持生产的低成本。
蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物 可直接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。
动物膀胱生物反应器
外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器 , 叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一
组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性, 而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5′端调控序列中, 就可以指导外源基因在尿中表达。
转基因动物生物反应器研究进展
制 的周 期来 算 ， 主要取 决 于动物 的泌 乳周 期 。 其 中
转 基 因猪 １ ２个 月 ， 转 基 因绵羊 ｌ ８个 月 ， 转基 因奶
牛 １ ５ ～２ ９个 月。
心 的新 型制 药公 司 ，在世 界 范 围 内掀 起 了一 个前
１ 转基 因动物 生物 反 应器 生 产 医用 蛋 白 药 物 的 优 越 性
与传统 的 生物反 应器 相 比 ，转 基 因动 物 生物 反应器 有着 不可 比拟 的优 越性 。一是转 基 因动 物
可 以不断繁 殖扩 群 ， 而 一个 动物 就像 一 个“ 天然 药 物 工厂 ” ， 从 而可 以大 规模 地生 产 出无 免疫 原性 且
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３ － ０ ６ — １ １
： 通讯作者 基金项 目 ： 国家青年 自 然科学基金项 目（ ３ １ １ ０ １ ６ ８ ９ ） ； 广东 省科技计 划项 目（ ２ ０ １ Ｉ Ａ ０ ２ ０ ９ ０ １ ０ ０ １ ； ２ ０ １ ｉ Ａ ０ ２ ０ １ Ｏ ２ ０ Ｏ ３ ）
成本， 而 转基 因动物 生 物 反应 器 只需 ０ ． ０ ２ ～０ ． ５ ０ 美元， 这 样大 大 降低 了投 资的风 险 。 三 是研 发周 期
公 司为 代表 的几 十家 利用 转基 因动 物 生物 反 应器 生产 贵 重 医用蛋 白药 物 的公 司 ， 已生 产 出一 百 多 种 珍贵 的医 用 蛋 白药物 ， 有些 如 人 ｈ Ｆ ｖ ｍ 、 ｈ ａ卜Ａ Ｔ
等 正处 于 临床 试 验阶 段 ，有些 已经 进 入Ｉ Ｉ Ｉ 期 临床 阶 段 。２ ０ ０ ６年 和 ２ ０ ０ ９年 美 国 Ｇ Ｔ Ｃ公司 用 山羊 乳
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
9.1.2 逆转录病毒感染法
• 1.原理： • 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制 成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或 着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释 放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达 到感染的目的，通过病毒将外源目的基因 插入整合到宿主基因组DNA中去。
2. 流程
• （1）构建逆转录病毒 载体； • （2）包装细胞； • （3）重组病毒感染早 期胚 • • • • • • 以转基因小鼠的培育为例： 1. 目的基因的制备与纯化； 2. 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备； 3.供体母鼠超数排卵处理； 4. 供体母鼠与公鼠交配； 5. 受精卵采集； 6. 目的基因显微注射； 7. 受精卵移植； 8. 目的基因表达鉴定和检测； 9. 建立遗传基因小鼠近交系。
（1）构建逆转录病毒载体
• • • • 步骤： 病毒DNA提取； 病毒DNA克隆到载体； 外源目的基因克隆到载体。
（2）包装细胞
• 包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生 病毒结构基因所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为 重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能 转录产生编码完整病毒的基因组RNA 。 • 载体转染包装细胞，逆转录酶催化下，载体DNA转录为 RNA，包装细胞表达产生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白组 装为具有感染性的重组病毒颗粒（位于包装细胞内）。
9.1 转基因动物的培育技术
• • • • • • • 常用的转基因动物培育技术有： 9.1.1 基因显微注射法 9.1.2 逆转录病毒感染法 9.1.3 胚胎干细胞介入法 9.1.4 精子载体导入法 9.1.5 YAC介导法 9.1.6 细胞核移植技术
9.1.1 基因显微注射法
• 原理 • 通过显微注射仪把外源基因直接注射到受 精卵的雄性原核内部，并使之整合到基因 组DNA中，获得转基因动物。
转基因动物 的一般制备 过程
转基因动物 的一般制备 过程（续）
转基 因动 物的 一般 制备 过程
• 显微注射法优点： • 外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直 接转移目的基因，目的基因的长度可>100Kb。它 可以直接获得纯系，实验周期短。 • 显微注射法不足点： • 外源基因整合的效率低，不能控制整合的位点， 外源基因随机结合或随机插入位点，有插入突变 的风险，而且整合的拷贝数未知，方法较复杂， 技术性强，设备昂贵等，基因稳定耗时较长，效 率低。
1. 目的基因的制备与纯化；
• • • • • 目的基因的来源： 内切酶的酶切片段； cDNA; 人工合成基因片段； PCR扩增特异片段。
2. 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备；
• 将输精管结扎后绝育的雄鼠交配可育雌鼠， 剌激雌鼠产生一系列一系列妊娠变化反应 而得到假孕母鼠，做为受精卵转基因后的 养母 。
（founder）（半合子：目的基因整合在二倍体动物的其中
一条染色体上 ）；
• ② 检测：通过 northern (RNA) and western (Pr) 杂交在转录和蛋白质水平上检测表达。
9. 建立遗传基因小鼠近交系。
• 首建鼠(半合子)与正常的野生型小鼠杂交， 检测后代的整合率，取后代有50%机率带 有整合基因的小鼠(阳性)，近亲繁殖，再通 过同一窝的阳性雌雄小鼠(兄妹)交配，在基 因的同源重组作用下，最终得到纯合子小 鼠。
第9章 转基因动物 与动物生物反应器
Transgenic Animal ＆ Animal Bioreactor
学习须知
• 主要内容：动物转基因技术及其应用
• 重点：常用的转基因动物培育技术
章节内容
• 前言
• 9.1 转基因动物的培育技术
• 9.2 转基因动物的应用
• 9.3 动物乳腺生物反应器
转基因动物
7. 受精卵移植
• 将已转入基因的受精卵先体外培育，从单 细胞到桑葚胚阶段，自假孕母鼠的背部植 入其输卵管内，使胚胎在养母体内发育成 熟。
8. 目的基因表达鉴定和检测
• ①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的 基因探针作分子杂交（southern），鉴定外 源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠
3.供体母鼠超数排卵处理；
• 向可育雌鼠注射孕马血清取绒毛膜促性腺 激素（PMSG）以及人绒毛膜促性腺激素 (HCG)促使其超排卵。
4. 供体母鼠与公鼠交配；
• 超排卵处理后，供体母鼠与可育雄鼠交配。
5. 受精卵采集；
• 交配次日，剖腹从供体母鼠的输卵管内收 集受精卵，CO2培养箱内培养液保存备用。
6. 目的基因显微注射；
• 用显微注射 装置将目的 基因溶液导 入受精卵雄 性原核内 。
显微注射的机理
• 受精卵1个小时之内，精子与卵子各自形成 自己的原核，不融合，随着时间的推移， 雄原核开始膨大。 • 注射针要插入雄原核内。首先将受精卵置 于培养基的液滴内，用吸持针找到受精卵 并吸持住，调整雄原核的位置。将注射针 装好DNA溶液，通过调节注射管，慢慢将 DNA溶液注射进入雄原核内 。
Transgenic Animal
前言
在基因组内稳定地整合了以实验方法导入 的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗 传给后代的遗传工程动物。 • 或者是指借助基因工程技术把外源基因导 入受体动物的染色体内，外源基因可在受 体内稳定遗传的动物。
转基因动物的研究历史：
• 1974年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜注射法获得转基因小鼠。 • 1981年，美国科学家成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基 因动物技术。1982年获得转基因小鼠。 • 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究 所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌α —抗胰蛋白酶，含量高 达30毫克/升。 • 1989年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了 纯系转基因小鼠。 • 1997年10月，英国罗斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只携 带有人凝血因子Ⅸ基因转染绵羊。 • 1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体 内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十 大科技进展”之一。