转基因动物与动物生物反应器
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第9章 转基因动物 与动物生物反应器
Transgenic Animal ＆ Animal Bioreactor
学习须知
• 主要内容：动物转基因技术及其应用
• 重点：常用的转基因动物培育技术
章节内容
• 前言
• 9.1 转基因动物的培育技术
• 9.2 转基因动物的应用
• 9.3 动物乳腺生物反应器
转基因动物
9.1.2 逆转录病毒感染法
• 1.原理： • 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制 成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或 着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释 放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达 到感染的目的，通过病毒将外源目的基因 插入整合到宿主基因组DNA中去。
2. 流程
• （1）构建逆转录病毒 载体； • （2）包装细胞； • （3）重组病毒感染早 期胚胎；
9.1 转基因动物的培育技术
• • • • • • • 常用的转基因动物培育技术有： 9.1.1 基因显微注射法 9.1.2 逆转录病毒感染法 9.1.3 胚胎干细胞介入法 9.1.4 精子载体导入法 9.1.5 YAC介导法 9.1.6 细胞核移植技术
wenku.baidu.com
9.1.1 基因显微注射法
• 原理 • 通过显微注射仪把外源基因直接注射到受 精卵的雄性原核内部，并使之整合到基因 组DNA中，获得转基因动物。
9.1.1 基因显微注射法
• • • • • • • • • • 以转基因小鼠的培育为例： 1. 目的基因的制备与纯化； 2. 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备； 3.供体母鼠超数排卵处理； 4. 供体母鼠与公鼠交配； 5. 受精卵采集； 6. 目的基因显微注射； 7. 受精卵移植； 8. 目的基因表达鉴定和检测； 9. 建立遗传基因小鼠近交系。
6. 目的基因显微注射；
• 用显微注射 装置将目的 基因溶液导 入受精卵雄 性原核内 。
显微注射的机理
• 受精卵1个小时之内，精子与卵子各自形成 自己的原核，不融合，随着时间的推移， 雄原核开始膨大。 • 注射针要插入雄原核内。首先将受精卵置 于培养基的液滴内，用吸持针找到受精卵 并吸持住，调整雄原核的位置。将注射针 装好DNA溶液，通过调节注射管，慢慢将 DNA溶液注射进入雄原核内 。
转基因动物 的一般制备 过程
转基因动物 的一般制备 过程（续）
转基 因动 物的 一般 制备 过程
• 显微注射法优点： • 外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直 接转移目的基因，目的基因的长度可>100Kb。它 可以直接获得纯系，实验周期短。 • 显微注射法不足点： • 外源基因整合的效率低，不能控制整合的位点， 外源基因随机结合或随机插入位点，有插入突变 的风险，而且整合的拷贝数未知，方法较复杂， 技术性强，设备昂贵等，基因稳定耗时较长，效 率低。
3.供体母鼠超数排卵处理；
• 向可育雌鼠注射孕马血清取绒毛膜促性腺 激素（PMSG）以及人绒毛膜促性腺激素 (HCG)促使其超排卵。
4. 供体母鼠与公鼠交配；
• 超排卵处理后，供体母鼠与可育雄鼠交配。
5. 受精卵采集；
• 交配次日，剖腹从供体母鼠的输卵管内收 集受精卵，CO2培养箱内培养液保存备用。
（1）构建逆转录病毒载体
• • • • 步骤： 病毒DNA提取； 病毒DNA克隆到载体； 外源目的基因克隆到载体。
（2）包装细胞
• 包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生 病毒结构基因所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为 重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能 转录产生编码完整病毒的基因组RNA 。 • 载体转染包装细胞，逆转录酶催化下，载体DNA转录为 RNA，包装细胞表达产生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白组 装为具有感染性的重组病毒颗粒（位于包装细胞内）。
1. 目的基因的制备与纯化；
• • • • • 目的基因的来源： 内切酶的酶切片段； cDNA; 人工合成基因片段； PCR扩增特异片段。
2. 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备；
• 将输精管结扎后绝育的雄鼠交配可育雌鼠， 剌激雌鼠产生一系列一系列妊娠变化反应 而得到假孕母鼠，做为受精卵转基因后的 养母 。
（founder）（半合子：目的基因整合在二倍体动物的其中
一条染色体上 ）；
• ② 检测：通过 northern (RNA) and western (Pr) 杂交在转录和蛋白质水平上检测表达。
9. 建立遗传基因小鼠近交系。
• 首建鼠(半合子)与正常的野生型小鼠杂交， 检测后代的整合率，取后代有50%机率带 有整合基因的小鼠(阳性)，近亲繁殖，再通 过同一窝的阳性雌雄小鼠(兄妹)交配，在基 因的同源重组作用下，最终得到纯合子小 鼠。
7. 受精卵移植
• 将已转入基因的受精卵先体外培育，从单 细胞到桑葚胚阶段，自假孕母鼠的背部植 入其输卵管内，使胚胎在养母体内发育成 熟。
8. 目的基因表达鉴定和检测
• ①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的 基因探针作分子杂交（southern），鉴定外 源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠
Transgenic Animal
前言
在基因组内稳定地整合了以实验方法导入 的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗 传给后代的遗传工程动物。 • 或者是指借助基因工程技术把外源基因导 入受体动物的染色体内，外源基因可在受 体内稳定遗传的动物。
转基因动物的研究历史：
• 1974年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜注射法获得转基因小鼠。 • 1981年，美国科学家成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基 因动物技术。1982年获得转基因小鼠。 • 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究 所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌α —抗胰蛋白酶，含量高 达30毫克/升。 • 1989年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了 纯系转基因小鼠。 • 1997年10月，英国罗斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只携 带有人凝血因子Ⅸ基因转染绵羊。 • 1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体 内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十 大科技进展”之一。
Transgenic Animal ＆ Animal Bioreactor
学习须知
• 主要内容：动物转基因技术及其应用
• 重点：常用的转基因动物培育技术
章节内容
• 前言
• 9.1 转基因动物的培育技术
• 9.2 转基因动物的应用
• 9.3 动物乳腺生物反应器
转基因动物
9.1.2 逆转录病毒感染法
• 1.原理： • 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制 成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或 着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释 放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达 到感染的目的，通过病毒将外源目的基因 插入整合到宿主基因组DNA中去。
2. 流程
• （1）构建逆转录病毒 载体； • （2）包装细胞； • （3）重组病毒感染早 期胚胎；
9.1 转基因动物的培育技术
• • • • • • • 常用的转基因动物培育技术有： 9.1.1 基因显微注射法 9.1.2 逆转录病毒感染法 9.1.3 胚胎干细胞介入法 9.1.4 精子载体导入法 9.1.5 YAC介导法 9.1.6 细胞核移植技术
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9.1.1 基因显微注射法
• 原理 • 通过显微注射仪把外源基因直接注射到受 精卵的雄性原核内部，并使之整合到基因 组DNA中，获得转基因动物。
9.1.1 基因显微注射法
• • • • • • • • • • 以转基因小鼠的培育为例： 1. 目的基因的制备与纯化； 2. 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备； 3.供体母鼠超数排卵处理； 4. 供体母鼠与公鼠交配； 5. 受精卵采集； 6. 目的基因显微注射； 7. 受精卵移植； 8. 目的基因表达鉴定和检测； 9. 建立遗传基因小鼠近交系。
6. 目的基因显微注射；
• 用显微注射 装置将目的 基因溶液导 入受精卵雄 性原核内 。
显微注射的机理
• 受精卵1个小时之内，精子与卵子各自形成 自己的原核，不融合，随着时间的推移， 雄原核开始膨大。 • 注射针要插入雄原核内。首先将受精卵置 于培养基的液滴内，用吸持针找到受精卵 并吸持住，调整雄原核的位置。将注射针 装好DNA溶液，通过调节注射管，慢慢将 DNA溶液注射进入雄原核内 。
转基因动物 的一般制备 过程
转基因动物 的一般制备 过程（续）
转基 因动 物的 一般 制备 过程
• 显微注射法优点： • 外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直 接转移目的基因，目的基因的长度可>100Kb。它 可以直接获得纯系，实验周期短。 • 显微注射法不足点： • 外源基因整合的效率低，不能控制整合的位点， 外源基因随机结合或随机插入位点，有插入突变 的风险，而且整合的拷贝数未知，方法较复杂， 技术性强，设备昂贵等，基因稳定耗时较长，效 率低。
3.供体母鼠超数排卵处理；
• 向可育雌鼠注射孕马血清取绒毛膜促性腺 激素（PMSG）以及人绒毛膜促性腺激素 (HCG)促使其超排卵。
4. 供体母鼠与公鼠交配；
• 超排卵处理后，供体母鼠与可育雄鼠交配。
5. 受精卵采集；
• 交配次日，剖腹从供体母鼠的输卵管内收 集受精卵，CO2培养箱内培养液保存备用。
（1）构建逆转录病毒载体
• • • • 步骤： 病毒DNA提取； 病毒DNA克隆到载体； 外源目的基因克隆到载体。
（2）包装细胞
• 包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生 病毒结构基因所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为 重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能 转录产生编码完整病毒的基因组RNA 。 • 载体转染包装细胞，逆转录酶催化下，载体DNA转录为 RNA，包装细胞表达产生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白组 装为具有感染性的重组病毒颗粒（位于包装细胞内）。
1. 目的基因的制备与纯化；
• • • • • 目的基因的来源： 内切酶的酶切片段； cDNA; 人工合成基因片段； PCR扩增特异片段。
2. 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备；
• 将输精管结扎后绝育的雄鼠交配可育雌鼠， 剌激雌鼠产生一系列一系列妊娠变化反应 而得到假孕母鼠，做为受精卵转基因后的 养母 。
（founder）（半合子：目的基因整合在二倍体动物的其中
一条染色体上 ）；
• ② 检测：通过 northern (RNA) and western (Pr) 杂交在转录和蛋白质水平上检测表达。
9. 建立遗传基因小鼠近交系。
• 首建鼠(半合子)与正常的野生型小鼠杂交， 检测后代的整合率，取后代有50%机率带 有整合基因的小鼠(阳性)，近亲繁殖，再通 过同一窝的阳性雌雄小鼠(兄妹)交配，在基 因的同源重组作用下，最终得到纯合子小 鼠。
7. 受精卵移植
• 将已转入基因的受精卵先体外培育，从单 细胞到桑葚胚阶段，自假孕母鼠的背部植 入其输卵管内，使胚胎在养母体内发育成 熟。
8. 目的基因表达鉴定和检测
• ①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的 基因探针作分子杂交（southern），鉴定外 源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠
Transgenic Animal
前言
在基因组内稳定地整合了以实验方法导入 的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗 传给后代的遗传工程动物。 • 或者是指借助基因工程技术把外源基因导 入受体动物的染色体内，外源基因可在受 体内稳定遗传的动物。
转基因动物的研究历史：
• 1974年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜注射法获得转基因小鼠。 • 1981年，美国科学家成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基 因动物技术。1982年获得转基因小鼠。 • 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究 所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌α —抗胰蛋白酶，含量高 达30毫克/升。 • 1989年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了 纯系转基因小鼠。 • 1997年10月，英国罗斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只携 带有人凝血因子Ⅸ基因转染绵羊。 • 1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体 内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十 大科技进展”之一。