转基因动物与动物生物反应器 PPT课件

转基因动物第一章绪论PPT.

牛 Colman A 1996 英国敲除牛乳中β-乳球蛋白
Jost B
1999 法国敲除牛乳中乳糖
Brophy B 2003 新西兰牛乳中转入β-酪蛋白
李宁
2008 中国牛乳中转入乳铁蛋白
羊 Reh W A 2004 美国转入硬脂酸辅酶A基因
（4）提高羊毛产量和品质 (1) 通常是因为站立时间过久，疼痛、精神紧张、恐惧、平卧、下蹲时突然站起来，使回流到心脏的血液减少，造成脑组织的血流量不
转基因动物：是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达的一类动物（包括基因敲除的动物）。
一、为什么要研究和应用转基因动物？
细菌基因工程？细胞基因工程？
二、转基因动物技术的应用
1、在畜牧业
（1）加快生长速度，提高饲料报酬
Growth-enhanced Transgenic (900g) and control(350g) Catfish at the same age about one year.
Growth-enhanced Transgenic (730g) and control(15g) salmon at the same age about one year.
比利时蓝牛肌肉增加表型
（2）提高畜禽对疾病的抵抗力
溶葡萄球菌酶基因
（3）改善乳品质
种属创始人年份国家
具体成果
汽车公司销售汽车的时候基本上没有考虑过安全带，特别是后排座的安全带。后排座有的时候会有三个安全带，中间有一个，旁边有两个。有时候安全带都散在座位上，这是不允许的，必须把它折好以后用一个橡皮筋扎起来，塞到后座和座位中间的缝儿里面，留一半在外面。这些都是给客户一个信号，这家汽车公司是一个管理规范的汽车公司，是一个值得信赖的公司。临床表现：三种毒素致病的局部和全身的表现特征。

转基因动物与动物生物反应器

9.1.2 逆转录病毒感染法
• 1.原理： • 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。
2. 流程
• （1）构建逆转录病毒载体； • （2）包装细胞； • （3）重组病毒感染早期胚 • • • • • • 以转基因小鼠的培育为例： 1. 目的基因的制备与纯化； 2. 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备； 3.供体母鼠超数排卵处理； 4. 供体母鼠与公鼠交配； 5. 受精卵采集； 6. 目的基因显微注射； 7. 受精卵移植； 8. 目的基因表达鉴定和检测； 9. 建立遗传基因小鼠近交系。
（1）构建逆转录病毒载体
• • • • 步骤：病毒DNA提取；病毒DNA克隆到载体；外源目的基因克隆到载体。
（2）包装细胞
• 包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA 。 • 载体转染包装细胞，逆转录酶催化下，载体DNA转录为 RNA，包装细胞表达产生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白组装为具有感染性的重组病毒颗粒（位于包装细胞内）。
9.1 转基因动物的培育技术
• • • • • • • 常用的转基因动物培育技术有： 9.1.1 基因显微注射法 9.1.2 逆转录病毒感染法 9.1.3 胚胎干细胞介入法 9.1.4 精子载体导入法 9.1.5 YAC介导法 9.1.6 细胞核移植技术
9.1.1 基因显微注射法
• 原理 • 通过显微注射仪把外源基因直接注射到受精卵的雄性原核内部，并使之整合到基因组DNA中，获得转基因动物。

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Gordon等首次成功地将含有HSV和SV40 DNA 片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序小鼠。
1982年，Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。
到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。
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动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。
一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合体动物。
当外源基因在转基因动物体内表达，并培育出其表型与人类疾病症状相似的动物模型，则称其为转基因动物模型。
目前, 已经培育出了动脉粥样硬化、镰刀形红细胞贫血症、痴呆症、自身免疫病、淋巴系统病、真皮炎及前列腺癌等多种疾病的模型动物,为这类疾病的研究提供了方便。
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（3）动物品种改良
通过外源基因的导入，改造动物的基因组,可达到使家畜、家禽的生长速度加快，肉、蛋或奶产量及品质提高，饲料利用率提高、抗病力加强的目的。目前应用最广的是，通过此技术改变牛奶的品质和成份。在我国已获得转人乳清白蛋白、人乳铁蛋白等转基因牛奶，为我国的“人源化牛奶”产业化定了重要的基础。
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转基因动物（transgenic animal）的概念
指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后，随细胞的分裂而扩增，在体内表达，并能稳定的遗传给后代的动物。
即指基因组中整合有外源基因的一类动物。整入动物基因组的外源基因被称为转基因
(transgene)。
类具有较多的相似性。因而猪在提供人类移植所用的器官方面成为

细胞工程-7.转基因动物与生物反应器

从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。
整理：灵魂的心碎更多内容请联系 linghundexinsui@
■ 目的基因的选择
选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因。
■ 体外重组
选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。
■ 基因转导
将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。
■ 胚胎移植
利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁，来获得目的基因表达产物。
━转基因技术:通过人工方式将外源基因整合到生物体基因组内，并使该转基因生物能够稳定地将此基因遗传给后代的技术。
━转基因动物:在基因组内稳定地整合外源基因，并且可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。
━转基因动物细胞反应器制备流程
■ 外源目的基因的制备
■ 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
■ 选择获得携有目的基因的细胞
■ 选择合适的体外培养系统和宿主动物
■ 转基因细胞胚
■ 胎发育及鉴定
■ 筛选所得的转基因动物品系。
━生物反应器的类型
■ 动物血液生物反应器
■ 动物乳腺生物反应器
■ 动物膀胱生物反应器
动物乳腺生物反应器的制备
■ 表达载体的构建
目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控元件。

第9章转基因动物与生物反应器

利用鸡蛋生产重组药用蛋白。
优点：
鸡输卵管是一个自我封闭的系统，肝脏合成蛋黄中的蛋白质和脂肪，并由血液直接输入输卵管，避免大量表达的外源性蛋白质对鸡健康造成的危害。
产量可观，且成本低廉。
产品的活性接近天然产品
本章结束
在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将 DNA注射进去。
3、裸DNA直接转移法：效率低。
显微操作系统
二、化学方法
1、DEAE-葡聚糖介导法：效率低
(乙二胺乙基葡聚糖)
DNA上的磷酸带负电
DEAE带正电
→ DNA大颗粒→ 细胞胞饮
2、磷酸钙-DNA共沉淀法：效率低(P254)
表面活性剂
3.脂质体介导法(P255)
转基因动物乳腺生物反应器的优越性：产品质量稳定，活性高；可持续大量地表达；成本低，经济效益显著；无污染；药物分离纯化工艺简便，可获得纯度
高达99%的产品；研制开发周期短。
转基因动物乳腺生物反应器存在的问题：
转基因在受体动物基因组中随机整合，有些存在调节失控、遗传不稳定、表达率不高等问题
第9章转基因动物第9章与生转物基反因应动器物
与生物反应器
9.1 转基因技术
通过人工操作的方式将外源基因整合到生物体基因组内，使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的实验技术。
细胞转染外源基因分三步：
(1)选择合适的受体细胞; (2)有效的转染方法； (3)转化后的筛选。
细胞转染外源基因的方法：
9.2.1 转基因动物的制备
一、步骤： •外源目的基因的制备； •目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞； •选择获得携有目的基因的细胞； •选择合适的体外培养系统和宿主动物； •转基因细胞胚胎发育及鉴定； •筛选所得的转基因动物品系。

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39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞罗
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
x亚伯拉罕·林肯
转基因动物与动物生物反应器
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们就不再配享受自由了。—— 毕达哥拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的利益，而是为了公共的利益；一部分靠有害的强制，一部分靠榜样的效力。 ——格老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话，那么法律作为一件无用之物自己就会消灭。— —洛克

转基因动物与生物反应器

历史事件
1973年美国斯坦福大学的Cohen 等人，将大肠杆菌R6-5质粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌pSC101质粒DNA（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，产生同时表现出两种抗性的细菌。 1974年科恩将非洲爪蟾编码核糖体的基因同pSC101质粒构成重组DNA分子，并导入大肠杆菌，证实动物基因进入了细菌细胞，并在细菌细胞中增殖和转录产生相应的mRNA。
体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。
优点：
受精卵携带外源基因的阳性率高外源基因多单拷贝整合操作简单，避免注射法对卵子的损害宿主范围广可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高
缺点：
容纳大小有限潜在致癌性,载体复杂
整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性
精子载体法是精子和外源DNA 混合培养时，外源DNA可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。
要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。
在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术
基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它是建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上的。通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。
利用脉冲电场提高细胞膜的

第六章转基因动物与生物反应器

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第二节转基因效率的影响因素一、动物转基因存在的问题 1. 成功率低 2. 整合率和表达率低 3. 模型与预期目标不符合二、提高动物转基因表达效率的途径 1. 基因构件设计 2. 降低外源基因的拷贝数 3. 利用引导肽进行表达产物的定位
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• 五、体细胞克隆法 • （一）操作流程 • 1. 将目标基因转移到体外培育的动物体细胞中，筛选出阳性转基因细胞并进行培养繁殖，制备出供移植的细胞核供体； • 2. 将转基因细胞核供体移植到去核的卵母细胞中，重构胚经过启动和培养后，移植到受体母畜的输卵管或子宫中。 • （二）优点 • 1. 可以减少受体动物的数量； • 2. 预先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞的筛选，简化了转基因动物生产的许多环节，具有很大的优越性。
• 二、胚胎干细胞介导法 • （一）操作流程 • 1. 构建带有抗性基因的外源DNA来转染已经建系的胚胎干细胞，经过药物筛选得到阳性克隆细胞； • 2. 将此阳性克隆细胞注入囊胚腔； • 3. 移植囊胚到假孕动物体内发育呈个体； • 4. 如果生殖细胞中出现外源基因的整合，就有可能传入下一代，获得转基因动物。 • （二）优点 • 由于外源基因的整合位点、拷贝数目、表达水平以及稳定性都可在细胞水平筛选和检测，其预期性明显高于原核显微注射。
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三、精子载体法（一）操作流程 1. 把外源基因转入精子； 2. 用携带外源基因的精子给发情母畜授精，这样就有一定比例的后代整合了外源基因的转基因动物。 • （二）优点 • 1. 成本很低，只有显微注射法成本的1/10； • 2. 不需要对动物进行手术处理，因此可以大规模进行转基因动物。
• 3. 转基因药品的安全性 • 问题不大，可根据其结构与天然蛋白结构是否一致来判断安全性。但如何避免转基因动物的遗传物质进入药物是应该重点强调的问题；其次，转基因动物一旦不产药了，应如何处理也该慎重考虑。