预防兽医学专业(微生物与免疫学方向)毕业论文
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泰山松花粉多糖
中文摘要
目前对于一些传染性疾病，灭活苗和活苗已被广泛应用，然而由于疫苗的灭活制备过程，使其抗原的物理及化学结构发生改变，从而影响了疫苗对机体的免疫保护能力。随后，人们生产出的具有天然结构和统一快速生产特性的重组亚单位疫苗也被广泛用于预防各种传染性疾病，然而，由于重组亚单位疫苗在机体的快速清除等影响，使得蛋白质或多肽通常具有较短的血清半衰期及有限的抗原刺激。因此为了更有效的控制禽类传染病，亟需开辟新的途径，研发新型疫苗。近年来，将哺乳动物免疫球蛋白Fc与外源蛋白连接的融合技术已经被开发出来，这种技术中IgG Fc片段的连接赋予了融合的外源蛋白质或多肽类似抗体的特性，不仅增强了对抗原捕获的速度和效率，同时还增强了融合蛋白的血清半衰期。然而对于融合表达的IgY Fc是否与融合表达的IgG Fc一样，可以有效促进动物机体的非特异性免疫应答和特异性免疫应答，目前还没有被研究。
因次，在本项研究中，实验室以一种常见的可导致禽类呼吸道疾病的禽波氏杆菌（Borderella avium）中具有免疫原性的外膜蛋白A（ompA）为模型，使用巴斯德毕赤酵母GS115真核表达系统，表达连接有鸡IgY Fc和禽波氏杆菌ompA的融合蛋白；首先检测ompA-Fc融合蛋白对鸡腹腔巨噬细胞活性的影响，以评价连接的Fc对鸡体非特异性免疫应答的影响；再将融合蛋白免疫雏鸡，以评价连接的Fc对特异性免疫应答的影响；此外，本实验室经多年研究发现，泰山松花粉多糖（Taishanpinusmassonianapollenpolysaccharide,TPPPS）作为一些灭活疫苗及亚单位疫苗的佐剂时表现出良好的免疫增强效果，因此，TPPPS作为一种免疫调节剂对巨噬细胞的活化，以及用作佐剂对融合蛋白的免疫增强效果也被探究。
碱基对
BSA
bovine serum albumin
牛血清蛋白
ConA
concanavalin A
刀豆素球蛋白A
CPE
cytopathic effect
细胞病变
d
day
天
dpi
day postinfection
感染后天数
DMSO
dimethyl sulfoxide
二甲基亚砜
DNA
deoxyribonucleic acid
P.pastoris
Pichia pastoris
毕赤酵母
PTH
Parathyroid Hormone
甲状旁腺激素
RNA
ribonucleicacid
核糖核酸
rpm
rotationper minute
每分钟转速
s
second
秒
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
克隆载体，同时基因测序鉴定重组克隆载体中重组基因序列，随后利用限制性内切酶Xho I和Not I对测序成功的重组克隆载体进行双酶切及产物胶回收，随后将回收产物与经相同酶酶切后的表达载体pPIC9再次进行连接转化。之后，将基因测序验证正确的重组表达质粒线性化，并转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，对经RDB板筛选的阳性转化子进行PCR鉴定及基因测序。与此同时，以转化的空质粒pPIC9载体做为阴性对照。对经PCR检测正确的毕赤酵母阳性转化子及空质粒对照分别进行甲醇诱导表达。表达后的产物通过SDS-PAGE检测分析，与蛋白凝胶层中阴性对照孔相比，在阳性孔中显示有一条与目的蛋白分子量大小一致的约为47.4kDa的条带。毕赤酵母表达的融合蛋白在72h获得最大蛋白质产量（18mg/L）。随后对表达的蛋白经镍柱进行纯化，并且SDS-PAGE检测分析中同样检测到一条大小约为47.4kDa蛋白条带。
脱氧核糖核酸
EDTA
Ethylenedianine tetra-acetic
乙二胺四乙酸
ELISA
Enzymelinked immuno sorbent assay
酶联免疫吸附试验
FBS
fetal bovine serum
胎牛血清
FDA
food and drug administration
美国食品药品监督管理局
十二磺酸钠-聚丙烯酰胺
凝胶电泳
SPF
Specific pathogen free
无特定病原体
Tc
cytotoxic T cell
细胞毒性T细胞
Th
helper T cell
辅助性T细胞
TNF-α
tumor necrosis factor
肿瘤坏死因子
TPPPS
TaishanPinus massonianapollen polysaccharide
FITC
fluorescein isothiocyanate
异硫氰酸荧光素
g
gram
克
h
hour
小时
IgG
immunoglobulin G
免疫球蛋白G
IgY
immuபைடு நூலகம்oglobulinY
免疫球蛋白Y
IFA
Indirect immunofluorescence
间接免疫荧光
IL-2
Interleukin-2
白介素2
IL-4
Interleukin-4
白介素4
kb
kilobase
千碱基(对)
L
liter
升
LD50
median lethal dose
半数致死量
LTR
Lymphocyte transformation rate
淋巴细胞转化率
mg
microgram
微克
MHC-II
major histocompatibility complex
毕业设计（论文）
禽波氏杆菌ompA-IgY Fc融合蛋白表达及松花粉多糖对鸡体免疫应答的调节作用
学院名称
学院名称
专业名称
专业名称
学生学号
学生学号
学生姓名
学生姓名
指导教师
教授姓名
助理指导老师
老师姓名
202 年 月
符号说明
英文缩写
英文全称
中文名称
B.avium
bordetella
禽波氏杆菌
bp
base pair
本研究分以下三部分内容：
1.ompA-Fc融合蛋白毕赤酵母转化子的构建，表达及产物分析
对GenBank中公布的禽波氏杆菌ompA及鸡IgY Fc基因序列分别设计特异性引物，以本实验室先前分离得到的禽波氏杆菌DNA及本试验提取的鸡脾脏RNA为模板，采用SOE-PCR的方法进行重组基因的扩增。随后对扩增后的重组基因连接转化至pMD18-T
主要组织相容性复合体二类分子
min
minute
分
mL
milliliter
毫升
MTT
MTT Thiazolyl blue
噻唑蓝
OD
Optical density
光密度值
PBS
Phosphate Buffered Saline
磷酸盐缓冲液
PCR
Polymerase chain reaction
聚合酶链式反应
中文摘要
目前对于一些传染性疾病，灭活苗和活苗已被广泛应用，然而由于疫苗的灭活制备过程，使其抗原的物理及化学结构发生改变，从而影响了疫苗对机体的免疫保护能力。随后，人们生产出的具有天然结构和统一快速生产特性的重组亚单位疫苗也被广泛用于预防各种传染性疾病，然而，由于重组亚单位疫苗在机体的快速清除等影响，使得蛋白质或多肽通常具有较短的血清半衰期及有限的抗原刺激。因此为了更有效的控制禽类传染病，亟需开辟新的途径，研发新型疫苗。近年来，将哺乳动物免疫球蛋白Fc与外源蛋白连接的融合技术已经被开发出来，这种技术中IgG Fc片段的连接赋予了融合的外源蛋白质或多肽类似抗体的特性，不仅增强了对抗原捕获的速度和效率，同时还增强了融合蛋白的血清半衰期。然而对于融合表达的IgY Fc是否与融合表达的IgG Fc一样，可以有效促进动物机体的非特异性免疫应答和特异性免疫应答，目前还没有被研究。
因次，在本项研究中，实验室以一种常见的可导致禽类呼吸道疾病的禽波氏杆菌（Borderella avium）中具有免疫原性的外膜蛋白A（ompA）为模型，使用巴斯德毕赤酵母GS115真核表达系统，表达连接有鸡IgY Fc和禽波氏杆菌ompA的融合蛋白；首先检测ompA-Fc融合蛋白对鸡腹腔巨噬细胞活性的影响，以评价连接的Fc对鸡体非特异性免疫应答的影响；再将融合蛋白免疫雏鸡，以评价连接的Fc对特异性免疫应答的影响；此外，本实验室经多年研究发现，泰山松花粉多糖（Taishanpinusmassonianapollenpolysaccharide,TPPPS）作为一些灭活疫苗及亚单位疫苗的佐剂时表现出良好的免疫增强效果，因此，TPPPS作为一种免疫调节剂对巨噬细胞的活化，以及用作佐剂对融合蛋白的免疫增强效果也被探究。
碱基对
BSA
bovine serum albumin
牛血清蛋白
ConA
concanavalin A
刀豆素球蛋白A
CPE
cytopathic effect
细胞病变
d
day
天
dpi
day postinfection
感染后天数
DMSO
dimethyl sulfoxide
二甲基亚砜
DNA
deoxyribonucleic acid
P.pastoris
Pichia pastoris
毕赤酵母
PTH
Parathyroid Hormone
甲状旁腺激素
RNA
ribonucleicacid
核糖核酸
rpm
rotationper minute
每分钟转速
s
second
秒
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
克隆载体，同时基因测序鉴定重组克隆载体中重组基因序列，随后利用限制性内切酶Xho I和Not I对测序成功的重组克隆载体进行双酶切及产物胶回收，随后将回收产物与经相同酶酶切后的表达载体pPIC9再次进行连接转化。之后，将基因测序验证正确的重组表达质粒线性化，并转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，对经RDB板筛选的阳性转化子进行PCR鉴定及基因测序。与此同时，以转化的空质粒pPIC9载体做为阴性对照。对经PCR检测正确的毕赤酵母阳性转化子及空质粒对照分别进行甲醇诱导表达。表达后的产物通过SDS-PAGE检测分析，与蛋白凝胶层中阴性对照孔相比，在阳性孔中显示有一条与目的蛋白分子量大小一致的约为47.4kDa的条带。毕赤酵母表达的融合蛋白在72h获得最大蛋白质产量（18mg/L）。随后对表达的蛋白经镍柱进行纯化，并且SDS-PAGE检测分析中同样检测到一条大小约为47.4kDa蛋白条带。
脱氧核糖核酸
EDTA
Ethylenedianine tetra-acetic
乙二胺四乙酸
ELISA
Enzymelinked immuno sorbent assay
酶联免疫吸附试验
FBS
fetal bovine serum
胎牛血清
FDA
food and drug administration
美国食品药品监督管理局
十二磺酸钠-聚丙烯酰胺
凝胶电泳
SPF
Specific pathogen free
无特定病原体
Tc
cytotoxic T cell
细胞毒性T细胞
Th
helper T cell
辅助性T细胞
TNF-α
tumor necrosis factor
肿瘤坏死因子
TPPPS
TaishanPinus massonianapollen polysaccharide
FITC
fluorescein isothiocyanate
异硫氰酸荧光素
g
gram
克
h
hour
小时
IgG
immunoglobulin G
免疫球蛋白G
IgY
immuபைடு நூலகம்oglobulinY
免疫球蛋白Y
IFA
Indirect immunofluorescence
间接免疫荧光
IL-2
Interleukin-2
白介素2
IL-4
Interleukin-4
白介素4
kb
kilobase
千碱基(对)
L
liter
升
LD50
median lethal dose
半数致死量
LTR
Lymphocyte transformation rate
淋巴细胞转化率
mg
microgram
微克
MHC-II
major histocompatibility complex
毕业设计（论文）
禽波氏杆菌ompA-IgY Fc融合蛋白表达及松花粉多糖对鸡体免疫应答的调节作用
学院名称
学院名称
专业名称
专业名称
学生学号
学生学号
学生姓名
学生姓名
指导教师
教授姓名
助理指导老师
老师姓名
202 年 月
符号说明
英文缩写
英文全称
中文名称
B.avium
bordetella
禽波氏杆菌
bp
base pair
本研究分以下三部分内容：
1.ompA-Fc融合蛋白毕赤酵母转化子的构建，表达及产物分析
对GenBank中公布的禽波氏杆菌ompA及鸡IgY Fc基因序列分别设计特异性引物，以本实验室先前分离得到的禽波氏杆菌DNA及本试验提取的鸡脾脏RNA为模板，采用SOE-PCR的方法进行重组基因的扩增。随后对扩增后的重组基因连接转化至pMD18-T
主要组织相容性复合体二类分子
min
minute
分
mL
milliliter
毫升
MTT
MTT Thiazolyl blue
噻唑蓝
OD
Optical density
光密度值
PBS
Phosphate Buffered Saline
磷酸盐缓冲液
PCR
Polymerase chain reaction
聚合酶链式反应