真菌药敏试验方法比较
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对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验同临床 治疗的相关性还有待进一步证实
体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内的 动力学和复杂的生物学作用
真菌体外药物敏感试验方法
NCCLSM27-A：常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法 E-test法 NCCLS M44-P纸片扩散法 (仅限氟康唑) 丹麦Rosco纸片扩散法(NCCLS未认可)
氏单位，孵育48小时， 光滑念珠菌也需孵育48小时读取抑菌环直径。
酵母菌纸片扩散法敏感试验
NCCLS M44-P. 2003 氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度
抑菌环直径 （mm)
MIC （ug/ml)
敏感（S)
>=19
<=8
剂量依赖性敏感 （SDD) 耐药（R)
15-18 <=14
16-32 >=64
真菌体外药敏用培养基
常量肉汤和微量肉汤法RPMI1640液制备：
RPMI
10.4g
MOPS（三氮吗啡啉丙磺酸）
34.53 g
蒸馏水900ml溶解后，用1M NaOH调节PH至7.0（25℃）， 用蒸馏水 溶至1000ml，
高压灭菌后，冷却至50 ℃
加入RPMI1640用0.22µm滤膜抽滤除菌，4℃保存。
（取0.2ml的生长对照菌液加入0.8mlRPMI液体培养基的菌液浓 度）
质控株
克柔念珠菌ATCC 6258 近平滑念珠菌ATCC 2Biblioteka Baidu019 白念珠菌ATCC 90028
白念珠菌ATCC 24433
微量肉汤法 氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为2×常量 法的浓度（即128µg/ml ），终浓度为0.25µg/ml 。
菌液制备 将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用 0.85%的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到0.5麦氏 比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。
常量稀释法：用RPMI1640液体稀释2000倍
接种浓度约为0.5~2.5×103CFU/ml
微量稀释法：用RPMI1640液体稀释1000倍
优点：有较好的重复性和稳定性
E-test法 0.5麦氏比浊液 （约为1~5×106CFU/ml）。
菌悬液均匀涂布于药敏板上
35 ℃培养24小时读取结果
光滑念珠菌 新型隐球菌 等生长较慢的菌种需适当延长培养时间。
E-test法评价
准确性高,且操作简便 E-test法得到的MIC值在某些菌种中要低于NCCLS推荐
S＝Susceptible SDD=Susceptible－Dose Dependent R=Resistant
酵母菌纸片扩散法敏感试验
NCCLS M44-P. 2003
氟康唑对标准菌株 24h抑菌环直径（mm)的质控允许范围
标准菌株
氟康唑25ug
沃尔康唑1ug
白念珠菌 ATCC90028 近平滑念珠菌 ATCC22019 热带念珠菌 ATCC750 克柔念珠菌 ATCC6258
PH7.2-7.4
优点：有较好的重复性和稳定性
操作简便，价廉
缺点：目前只限氟康唑
NCCLS纸片扩散法
0.5麦氏比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。
菌悬液均匀涂布于药敏板上 步骤同细菌敏感试验操作一致， 35～37℃孵育18～24小时， 对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需 调至1麦
接种浓度约为1～5×103CFU/ml
E-test法和NCCLS纸片扩散法：用菌液浊度为0.5麦氏单位。
Rosco纸片扩散法：
1. 念珠菌：
0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀
(1~5×105CFU/ml)
2. 隐球菌属：
1.0麦氏浊度
3. 其它酵母菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释
常量肉汤法(M27-A) 先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的RPMI1640液倍 比稀释，使其起始浓度为640µg/ml, 终末浓度为1.25µg/ml， 分装无菌洁净的12mm×75mm试管：
粘膜感染： 伊曲康唑
粘膜及系统性感染： 5-氟嘧啶
敏感：
中介： 耐药：
敏感：
中介： 耐药：
敏感：
中介： 耐药：
≤ 8µg/ml
－ ≥64µg/ml
≤0.125µg/ml
－ ≥1µg/ml
≤4µg/ml
8~16µg/ml ≥32µg/ml
酵母菌E-test法
瑞典AB Biodisk MIC
氟康唑：1-10孔分别为 100ul 菌悬液：1-10孔分别为 100ul
。37。℃37℃
64 32 16 8 4 2 1 .5 .25 .125 ＋ －
35 ℃
新型隐球菌72小时 ，
200ul菌悬液 200ulRPMI汤
其余菌株 48小时读取MIC结果
酵母菌的NCCLS M27-A各药物折点
粘膜及系统性感染： 氟康唑（除克柔念珠菌）
的常量肉汤稀释法测得的MIC 20%浓度CO2的环境中，可使此方法的结果更真实反
映药物对致病菌的敏感性
缺点：1.价格太高 每片40-50元
2. 吡咯类MIC终点不好确定
酵母菌纸片扩散法敏感试验
NCCLS M44-P. 2003
培养基： Mueller-Hinton琼脂
补充 2％
Glucose
0.5ug/ml Methylene blue dye
64 32 16 8 4
2 1 0.5 .25 .125 ＋ －
前10管： 0.2ml氟康唑＋1.8ml菌液
念珠菌属 35 ℃孵育48小时
新型隐球菌 72小时 读取MIC结果
2ml菌液 1.8ml1640
常量稀释法 药敏结果判定
氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%抑制 其他唑类药物为80%抑制
真菌常用的体外药敏试 验方法比较
真菌药敏试验临床难以开展 的原因
1.按照NCCLS推荐的稀释法,操作繁琐
2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定
3.纸
片法试验未得到NCCLS 认可
4.E试验价钱太贵
5.药敏孵育时间因菌种而不同
体外敏感试验与临床治疗相 关性
真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关性 好
真菌体外药敏用培养基
E-test法 ：
在RPMI液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为2%。
NCCLS纸片扩散法 ：
Mueller-Hinton 琼脂 补充2%葡萄糖和0.5μg/ml美蓝
丹麦ROSCO纸片扩散法 ：
改良的SHADOMY（ PH7.0）培养基 主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。
体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内的 动力学和复杂的生物学作用
真菌体外药物敏感试验方法
NCCLSM27-A：常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法 E-test法 NCCLS M44-P纸片扩散法 (仅限氟康唑) 丹麦Rosco纸片扩散法(NCCLS未认可)
氏单位，孵育48小时， 光滑念珠菌也需孵育48小时读取抑菌环直径。
酵母菌纸片扩散法敏感试验
NCCLS M44-P. 2003 氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度
抑菌环直径 （mm)
MIC （ug/ml)
敏感（S)
>=19
<=8
剂量依赖性敏感 （SDD) 耐药（R)
15-18 <=14
16-32 >=64
真菌体外药敏用培养基
常量肉汤和微量肉汤法RPMI1640液制备：
RPMI
10.4g
MOPS（三氮吗啡啉丙磺酸）
34.53 g
蒸馏水900ml溶解后，用1M NaOH调节PH至7.0（25℃）， 用蒸馏水 溶至1000ml，
高压灭菌后，冷却至50 ℃
加入RPMI1640用0.22µm滤膜抽滤除菌，4℃保存。
（取0.2ml的生长对照菌液加入0.8mlRPMI液体培养基的菌液浓 度）
质控株
克柔念珠菌ATCC 6258 近平滑念珠菌ATCC 2Biblioteka Baidu019 白念珠菌ATCC 90028
白念珠菌ATCC 24433
微量肉汤法 氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为2×常量 法的浓度（即128µg/ml ），终浓度为0.25µg/ml 。
菌液制备 将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用 0.85%的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到0.5麦氏 比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。
常量稀释法：用RPMI1640液体稀释2000倍
接种浓度约为0.5~2.5×103CFU/ml
微量稀释法：用RPMI1640液体稀释1000倍
优点：有较好的重复性和稳定性
E-test法 0.5麦氏比浊液 （约为1~5×106CFU/ml）。
菌悬液均匀涂布于药敏板上
35 ℃培养24小时读取结果
光滑念珠菌 新型隐球菌 等生长较慢的菌种需适当延长培养时间。
E-test法评价
准确性高,且操作简便 E-test法得到的MIC值在某些菌种中要低于NCCLS推荐
S＝Susceptible SDD=Susceptible－Dose Dependent R=Resistant
酵母菌纸片扩散法敏感试验
NCCLS M44-P. 2003
氟康唑对标准菌株 24h抑菌环直径（mm)的质控允许范围
标准菌株
氟康唑25ug
沃尔康唑1ug
白念珠菌 ATCC90028 近平滑念珠菌 ATCC22019 热带念珠菌 ATCC750 克柔念珠菌 ATCC6258
PH7.2-7.4
优点：有较好的重复性和稳定性
操作简便，价廉
缺点：目前只限氟康唑
NCCLS纸片扩散法
0.5麦氏比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。
菌悬液均匀涂布于药敏板上 步骤同细菌敏感试验操作一致， 35～37℃孵育18～24小时， 对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需 调至1麦
接种浓度约为1～5×103CFU/ml
E-test法和NCCLS纸片扩散法：用菌液浊度为0.5麦氏单位。
Rosco纸片扩散法：
1. 念珠菌：
0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀
(1~5×105CFU/ml)
2. 隐球菌属：
1.0麦氏浊度
3. 其它酵母菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释
常量肉汤法(M27-A) 先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的RPMI1640液倍 比稀释，使其起始浓度为640µg/ml, 终末浓度为1.25µg/ml， 分装无菌洁净的12mm×75mm试管：
粘膜感染： 伊曲康唑
粘膜及系统性感染： 5-氟嘧啶
敏感：
中介： 耐药：
敏感：
中介： 耐药：
敏感：
中介： 耐药：
≤ 8µg/ml
－ ≥64µg/ml
≤0.125µg/ml
－ ≥1µg/ml
≤4µg/ml
8~16µg/ml ≥32µg/ml
酵母菌E-test法
瑞典AB Biodisk MIC
氟康唑：1-10孔分别为 100ul 菌悬液：1-10孔分别为 100ul
。37。℃37℃
64 32 16 8 4 2 1 .5 .25 .125 ＋ －
35 ℃
新型隐球菌72小时 ，
200ul菌悬液 200ulRPMI汤
其余菌株 48小时读取MIC结果
酵母菌的NCCLS M27-A各药物折点
粘膜及系统性感染： 氟康唑（除克柔念珠菌）
的常量肉汤稀释法测得的MIC 20%浓度CO2的环境中，可使此方法的结果更真实反
映药物对致病菌的敏感性
缺点：1.价格太高 每片40-50元
2. 吡咯类MIC终点不好确定
酵母菌纸片扩散法敏感试验
NCCLS M44-P. 2003
培养基： Mueller-Hinton琼脂
补充 2％
Glucose
0.5ug/ml Methylene blue dye
64 32 16 8 4
2 1 0.5 .25 .125 ＋ －
前10管： 0.2ml氟康唑＋1.8ml菌液
念珠菌属 35 ℃孵育48小时
新型隐球菌 72小时 读取MIC结果
2ml菌液 1.8ml1640
常量稀释法 药敏结果判定
氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%抑制 其他唑类药物为80%抑制
真菌常用的体外药敏试 验方法比较
真菌药敏试验临床难以开展 的原因
1.按照NCCLS推荐的稀释法,操作繁琐
2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定
3.纸
片法试验未得到NCCLS 认可
4.E试验价钱太贵
5.药敏孵育时间因菌种而不同
体外敏感试验与临床治疗相 关性
真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关性 好
真菌体外药敏用培养基
E-test法 ：
在RPMI液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为2%。
NCCLS纸片扩散法 ：
Mueller-Hinton 琼脂 补充2%葡萄糖和0.5μg/ml美蓝
丹麦ROSCO纸片扩散法 ：
改良的SHADOMY（ PH7.0）培养基 主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。