农杆菌感受态细胞的制备方法
农杆菌感受态制备
版本一? 农杆菌感受态细胞的制备? ℃保存的E H A105于含50μg/m l链霉素平板划线，28℃培养。
? ℃振荡培养12-16h r。
? ℃220r p m振荡培养至O D600=。
??℃5000r p m离心5m i n，去上清。
??℃。
? .双元载体转化农杆菌E H A105? 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。
再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml K a n a m y c i n的Y M平板上。
28℃培养到形成单菌落。
其中 YM 可以用LB 代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（（） DTT）替代。
版本二?普通农杆菌感受态制备与转化：?1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
?2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于左右（4hr）。
?3. 5k rpm离心5分钟。
?4. 在10ml NaCl中悬浮细胞。
?5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
?如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。
?6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
?7. 液氮中冷冻1分钟。
?8. 37℃水浴溶化细胞。
?9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
?10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
?11. 涂板，28℃培养2-3天。
?版本三?农杆菌感受态细胞的制备?1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基 (含50mg/L STR)中，28℃、200r/mim培养过夜。
?2.取2ml培养物于LB液体培养基 (含50mg/L STR) 中继续培养，直至OD800 为左右。
农杆菌感受态细胞的制备与转化(PDF)
农杆菌感受态细胞的制备［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。
［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。
利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。
［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；4、加入1000µl 20mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；5、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500µl预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃保存备用。
质粒DNA直接导入农杆菌［实验原理］在低温下，外源DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收DNA。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态细胞的制备在科学的世界里，农杆菌这家伙可是个大明星，尤其是在植物基因工程中，简直就像是超级英雄一样的存在。
说到农杆菌，它是个很有趣的小家伙，特别是在我们想把新基因转移到植物里的时候，它的表现真是让人惊叹。
今天就来聊聊怎么准备感受态细胞，听起来有点高大上，其实就是让植物细胞准备好接受外来的基因，像小朋友期待新玩具一样，兴奋得不得了。
要准备的就是农杆菌的培养。
想象一下，咱们要给这些小家伙开个派对，当然要先让它们有个好环境。
选个合适的培养基，像是给它们铺一张舒适的床。
然后，温度、pH值、氧气这些条件也得一丝不苟，不能马虎。
温度太高，农杆菌可受不了，像人一样，热得直冒汗；温度太低，它们又会懒洋洋的，没精神。
要是培养基里的营养不够，嘿，那简直就是饿肚子的小朋友，没啥干劲。
就得让这些小家伙进入生长期，哈哈，听起来像在养宠物。
等它们长到合适的密度，咱们就准备好收割成果啦。
这时候，得小心翼翼地把它们从培养基里取出来，别把它们给弄伤了，像捧着刚出生的小宝宝一样。
取出的细胞要经过洗涤，洗去多余的培养基，确保它们干净得像新洗的衣服。
用生理盐水轻轻地重悬这些细胞，调成合适的浓度，让它们准备好迎接“客人”。
这里有个小窍门，嘿嘿，增加细胞的感受性。
可以用一些特殊的化合物，比如PEG，这玩意儿就像催化剂，能帮助细胞更好地接受外来的DNA。
想象一下，像是给小朋友加了点魔法，立马变得更加活泼，更有好奇心。
然后，得把想要转移的DNA和这些感受态细胞混合。
这个过程就像搭积木，得小心翼翼，别让它们散架。
把这个混合物在特定的条件下静置一段时间，让细胞慢慢适应，就像在等待一场盛大的聚会。
期间，要保持适宜的温度和环境，让它们尽情享受这个过程。
就要进行转化了。
这一步就像是给这些细胞送去了新玩具，兴奋得不得了。
把细胞和DNA一起放到农杆菌中，轻轻搅拌，别太猛，怕把小家伙们给搅晕了。
静置一段时间后，它们就会开始接受这些新基因，像在参加一场欢迎会一样。
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。
农杆菌感受态制备
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版本一 1.1 农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的 EHA105 于含 50μg/ml 链霉素平板划线，28℃培养。 1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM 液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养 12-16 hr。 1.1.3. 取 2ml 菌液转接于 100ml YM 液体培养基中，28℃220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。 1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心 5min,去上清液。 1.1.5. 加入 10ml 预冷的 0.1M 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置 20min。4℃5000rpm 离心 5min，去上清。 1.1.6. 加入 4ml 预冷的含 15%甘油的 0.1M 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮。 1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌 Eppendorf 管中，每管 200μl 冻存于-70℃。 1.2. 双元载体转化农杆菌 EHA105 取 1μg 左右的质粒 DNA 加入到 200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴 30min，-70℃放 置 10min 。再在 37℃水浴 5min 或 42℃水浴 1min，接着冰浴 2min，加入 800mlYM 液体培养 基 28℃，175rpm 摇培 3hr 后涂在含 50μg/ml Kanamycin 的 YM 平板上。28℃培养到形成单 菌落。 其中 YM 可以用 LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。 版本二 普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于 2ml YEP 培养基（含 Rif20mg/ml）中 28℃过夜活化。 2. 取 2ml 过夜菌液接种于 50ml YEP 培养基中 28℃生长至 OD600 约等于 0.5 左右（4hr）。 3. 5k rpm 离心 5 分钟。 4. 在 10ml 0.15M NaCl 中悬浮细胞。 5. 5 krpm 离心 5 分钟，悬浮细胞于 20ml 冰预冷的 CaCl2。 如不是马上使用，可以将之按 200ul 分装储存于-80℃待用。 6. 加 1ug DNA 于 200ul 感受态细胞中，冰上放置 30 分钟。 7. 液氮中冷冻 1 分钟。 8. 37℃水浴溶化细胞。 9. 加 1ml YEP 培养基，28℃摇床培养 2-4hr（低速）。 10. 离心 1 分钟，悬浮细胞在 100ul YEP 培养基中。 11. 涂板，28℃培养 2-3 天。
农杆菌感受态制备之欧阳体创编
版本一 1.1农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M 的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。
再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM 平板上。
28℃培养到形成单菌落。
其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。
版本二普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于2ml YEP 培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态制备和转化方法(一)普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。
6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
7. 液氮中冷冻1分钟。
8. 37℃水浴溶化细胞。
9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
11. 涂板，28℃培养2-3天。
(二)电转农杆菌感受态细胞制备与转化1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。
（如用5mlYEP，需培养36h）2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。
3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。
5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
6．重复4、5步骤2~3次。
7．用2ml冰浴的10%甘油重悬。
8．每管100µl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH 调pH至7.0，灭菌后待用。
注：HEPES需现用现配。
电击法转化农杆菌感受态细胞1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。
2．加2µl质粒DNA于100µl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
农杆菌的转化加入1mlyep培养基加入1mlyep培养基28慢摇培养24h28慢摇培养24h液氮中速冻1min迅速置于37水浴中5min取100?l农杆菌感受态加入约051?g质粒dna混匀后冰浴30min均匀涂布在含rif和kan的yep平板上28c温育48h至菌落出现离心去上清将细胞重悬于200?lyep培养基中载体分子带有抗生素抗性基因kan感受态受体细胞本身不具有抗生素的抗性没有导入载体的细胞在抗生素培养基上便不能生长
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然
后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
农杆菌感受态
感受态细胞（competent cell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA
的一种特殊生理状态. 重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特 殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分 子的状态，即成为感受态细胞。 电击法， CaCl2法。 不同的转化方法需制备不同的感受态。 CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶 液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞 呈现出感受态.
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤
一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。
农杆菌感受态的制备方法
农杆菌感受态细胞制备第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。
注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。
挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。
第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。
注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。
第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。
注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。
摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。
4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。
6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。
7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。
注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。
8) 4℃，5000rpm 离心5min 。
9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。
10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。
注意：要用1ml 枪轻轻抽打。
11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。
农杆菌感受态制备
版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70 C保存的EHA105于含50用/ml链霉素平板划线，28 C培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM 液体培养基中，28 C 220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCI2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min °4C 5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendof管中，每管200 M冻存于-70 C。
1.2.双元载体转化农杆菌 EHA105取1⑷左右的质粒 DNA加入到200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴30min , -70 C放置10min。
再在37 C水浴5min或42 C水浴1min，接着冰浴 2min，加入800mlYM 液体培养基 28 C, 175rpm 摇培3hr后涂在含50旧/ml Kanamycin 的YM平板上。
28 C培养到形成单菌落。
其中 YM 可以用LB代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCI2 0.01Tris-HCI （7.0）0.01 DTT ）替代。
版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml ）中28 C过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于 50ml YEP培养基中28 C生长至 OD600约等于0.5左右（4hr ）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCI 中悬浮细胞。
5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于 20ml冰预冷的CaCI2。
农杆菌感受态细胞的制备与转化-精选文档
实验原理：
• 1. 农杆菌简介： 第一例转基因植物就是用 农杆菌介导法完成的。 • 菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属 革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在 某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
农杆菌转化
• ⑴ 将10l构建好的质粒DNA加入200 l 农 杆菌感受态细胞中，混匀； • ⑵ 冰浴30min，液氮迅速冷冻3-5min， 37℃水浴5 min； • ⑶ 加入1ml（无抗）YEB培养基，28℃振荡 培养4h（选作）； • ⑷ 5000 rpm离心3min，弃去部分上清，重 新悬浮细胞，涂布于YEB（Kan 100 mg/L 和 Rif 125 mg/L）培养基上，28℃培养2-3d。
统的构建的原理是Ti质粒 上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
双元表达载体
双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构
农杆菌感受态细胞的制备流程
⑴ 挑取农杆菌GV3101单菌落接种于3ml 的新鲜YEB（无 抗）液体培养基中，28℃ 200r/mim振荡培养过夜； ⑵ 按1：100的比例接种于50 ml YEB（利福平Rif 125 mg/L）的培养基中扩培，28℃继续培养至OD600=0.40.6。将菌液置于冰上30min； ⑶ 取1.4ml菌液，5,000 rpm，4℃离心5min，弃上清， 将菌体悬浮于1.0 ml（预冷） 0.15 mol/L NaCl中。 ⑷ 5,000 rpm, 4℃离心5min，弃上清； ⑸ 菌体用120µ l 预冷的20mmol/L CaCl2（4℃）轻轻悬浮 细胞，之后加80µ l 50%无菌甘油，无菌甘油的终浓度为 20%，液氮中速冻1 min，置-70℃保存备用或直接用于 转化。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
农杆菌感受态
感受态细胞（competent cell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态.
重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特 殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分 子的状态，即成为感受态细胞。
电击法， CaCl2法。 不同的转化方法需制备不同的感受态。 CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件 下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状 根。
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植 物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆 菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的TDNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后 通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体 D E • 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 F
• 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µl/管，24 h内使用或液氮速冻 G 后-70 °C保存
感受态细胞制备及转化中出现的问题
感受态长期保存要进行速冻，立即用-80 ℃冰箱或液氮速冻，而在使用 时，用37 ℃水浴或手掌体温进行速融，避免冰晶形成过程对细胞造成的 伤害，导致细胞破损不能存活。 感受态细胞不能反复冻融。 涂板后时间过长会有假阳性转化子的出现，抗生素在37℃过夜后失活， 抗生素作用是抑制未转化的感受态细胞生长，而不能将这些细胞杀死， 所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
农杆菌感受态制备之欧阳美创编
版本一 1.1农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
4℃5000rpm 离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。
再在37℃水浴5min 或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。
28℃培养到形成单菌落。
其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。
版本二普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml 过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。
农杆菌感受态细胞的制备方法
农杆菌感受态细胞的制备方法实验一农杆菌感受态细胞的制备［目的及要求］了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl 2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。
［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。
利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。
［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；4、加入1000μl 20mM CaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；25、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500μl预冷的20mMCaCl，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃2保存备用。
实验五农杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
感受态细胞制备的原理
• 感受态细胞制备的原理是细菌在低温和低 渗氯化钠溶液中，菌细胞壁通透性增加。
实验原理
• 转化方法：电击法、 CaCl2、 NaCl等化 学试剂法 • 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性 发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通 过时细胞的状态。 • 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子 的受体细胞( TransfoKan培养基
影响转化率的因素
• • • • 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验试剂
农杆菌LBA4404 YM培养基， 0.1mol/LNaCl溶液（预冷） 20mM CaCl2溶液（预冷） 卡那霉素（50mg/ml） 质粒DNA （上周日提取）
2.挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基（硫酸链 霉素，25mg/ml）中，28℃条件下，250rpm悬 浮培养12-20小时。
3．在超净工作台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管 中，4℃ ，5000×rpm离心8min。 4．在超净工作台上弃上清，用100mM NaCl （4℃ 预冷）重悬农杆菌，4℃， 5000×rpm离心8min。 5．在超净工作台上弃上清，加入原始农杆菌菌液 1/50体积（800ml）的20mM CaCl2溶液重悬菌体， 并分装成500ml/管。 6．将分装后的离心管置于液氮中10秒，-80℃保存。
农杆菌感受态细胞的制备
1.将农杆菌LBA4404（抗硫酸链霉素，25mg/ml）接 种在YM平板上，26-28℃ 培养48小时。
YM培养基的配方：酵母提取物0.4g/L；甘露醇 10g/L；NaCl 0.1g/L；MgSO4 0.1g/L； K2HPO4 0.5g/L；琼脂粉 15g/L pH：7.2-7.4
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实验一农杆菌感受态细胞的制备［目的及要求］了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。
［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。
利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。
［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；4、加入1000µl 20mM CaCl25、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500µl预冷的20mMCaCl，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃2保存备用。
实验二质粒DNA直接导入农杆菌［目的及要求］了解和掌握质粒DNA转化农杆菌细胞的原理和方法，获得能用于植物转化的工程菌。
［实验原理］在低温下，外源DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收DNA。
（加入热激原理）转化了质粒DNA的农杆菌随后28℃恢复培养，可使质粒上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的农杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。
植物真核表达载体pCAMBIA1300图谱［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式离心机，水浴锅，高压灭菌锅，-70℃超低温冰箱，培养皿，微量进样器及吸头。
材料：根癌农杆菌LBA4404（或EHA105）感受态细胞，质粒pCAMBAI1300+SPR植物表达载体二、试剂：液氮YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4•7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。
YEB固体培养基：每升YEB液体培养基加15g琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：50mg/ml利福平（Rif）储液：50mg/mlYEB固体培养基平板（Kan抗性）：灭菌后的YEB固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度分别为100µg/ml和50µg/ml，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
［实验步骤］1、在200µl感受态细胞中加入2－6µl质粒（pBI121）DNA，冰浴5min，液氮中速冻5min；2、迅速转入37℃水浴中，热激5min；3、加入1ml YEB液体培养基，28℃慢速振荡培养2－4小时；4、3000rpm离心4min，去一部分上清，留取200µl菌液涂布于含有50µg/ml Kan和50µg/ml Rif的YEB平板；5、放置约0.5h，待水份干后，28℃培养约24小时至长出菌落。
实验三农杆菌转化子的鉴定［目的及要求］掌握农杆菌质粒DNA的提取方法。
将从农杆菌提取的质粒与对照质粒同时电泳，通过比较确定获得了农杆菌转化子。
［实验原理］经改造的Ti质粒（只含有帮助T-DNA跳到植物染色体上的Vir区）存在于农杆菌工程菌株中，含有T-DNA的双元载体（Binory Vectors）完成重组后可以在大肠杆菌中扩增，再转入农杆菌中。
从抗性培养基上筛选得到的农杆菌转化子中应携带转入的重组质粒，而对照菌株则没有。
碱裂解法是一种应用最为广泛的质粒DNA提取方法，该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。
提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而使其分离。
当细胞在NaOH 和SDS溶液中裂解时，在pH高达12.6的碱性条件下，蛋白质和染色体DNA发生变性，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋结构解开，而质粒DNA虽大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当加入中和液醋酸钾或醋酸钠高盐缓冲液时，质粒DNA恢复原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，通过离心，染色体DNA、蛋白质-SDS复合物随细胞碎片等沉淀下来，质粒DNA则留在上清中。
［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：台式高速离心机，高压灭菌锅，恒温摇床，恒温水浴，电泳仪及电泳槽，紫外灯，加样器（pipettor），小离心管（eppendorf tube），吸头（tip），三角瓶，牙签。
二、材料：含质粒的农杆菌LBA4404（或EHA105），农杆菌LBA4404或EHA105）三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。
溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA（pH8.0），高压灭菌（6.895×104Pa），4℃保存溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH ，1％ SDS先分别配成浓度0.4M NaOH（灭菌）及2％ SDS，用前等体积混合。
溶液Ⅲ：3mol/L NaAc/KAc（pH4.8）105mol/L NaAc/KAc 60ml（灭菌）HAc 11.5mlO 28.5ml（灭菌），三者混合H2EB：贮液浓度为10mg/mL，工作浓度为0.5µg/mlTAE：40mmol/L Tris-HAc，2mmol/L EDTA，pH8.0，Tris饱和酚、氯仿、无水乙醇、RNase A［实验步骤］1、质粒DNA的提取（1）挑取一个单菌落接种于3ml含相应抗生素的YEB（50mg/L Km）液体培养基中，28℃剧烈振荡过夜；（2）收集1.5ml过夜培养物于1.5ml离心管中，10000rpm离心30sec收集菌体，尽可能除尽培养基；（3）向细胞沉淀中加入100µl 预冷的溶液Ⅰ，剧烈振荡，使菌体充分悬浮；（4）加入200μl 溶液Ⅱ，立即温和颠倒离心管4-10次，避免剧烈振荡；（5）加入150μl 溶液Ⅲ，温和颠倒离心管4-10次，将离心管置冰浴5min；（6）于室温12000g离心15min，将上清液转入新的离心管中（尽量避免吸取沉淀）；（7）加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀；（8）12000g离心10min，弃上清液，加入400μl 70%乙醇，12000g离心8min，弃上清，在真空抽干或在超净工作台中吹干；（9）加入10µl含20µg/ml RNase A的TE或重蒸水溶解DNA，37°C温育30min；（10）-20℃保存。
2、用琼脂糖电泳检测质粒DNA（或用PCR进行检测）用1×TAE配制0.8％的琼脂糖凝胶，取所提取的质粒DNA溶液2-5µl进行电泳，50-100v约0.5-1hr，紫外灯下观察结果。
实验四烟草遗传转化实验[实验目的与意义]烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。
本实验以烟草为实验材料，使同学们了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
[实验器材]摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。
[实验药品]MS培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、无菌水、6-BA、NAA、0.1%升汞、70%乙醇。
烟草愈伤诱导或分化培养基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)烟草生根培养基：MS+ NAA(0.1mg/L)烟草选择培养基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)+75mg/L Km+500mg/L 羧卞青霉素（Cb）[实验步骤]1.受体材料的准备与预培养（1）取自田间栽培烟草植株，用蒸馏水冲洗1遍后，以70%乙醇清洗45s，再以0.1%的升汞消毒6-8min，无菌水冲洗5遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）用灭过菌的打孔器将无菌烟草叶片凿成6mm的叶盘（或用手术刀切成5－10mm方形叶片。
（3）将叶盘或叶片接种在烟草愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，预培养2－3天，材料切口处刚刚开始彭大时备用。
2.根癌农杆菌培养（1）从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素（卡那霉素）的YEB为0.6~0.8（约液体培养基中，在恒温摇床上，于28℃下以180r/min培养至OD600需17h）。
（2）OD为0.6~0.8的菌液，按1%~2%的比例，转入新配制的无抗生素的YEB 600液体培养基中，可同时加入100~500µmol/L的乙酰丁香酮。
在上述相同的条件下再培养6h左右，待OD为0.2~0.5时即可用于转化。
6003.浸染在超净工作台上，将菌液倒入无菌三角瓶中，从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（5~30min）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
4.共培养将浸染过的外植体接种在烟草愈伤组织诱导或分化培养基上，在28℃暗培养条件下共培养2~4天。
5.选择培养将经过共培养的外植体移到加有选择压的烟草愈伤组织诱导或分化培养基（附加500mg/L的羧苄青霉素，抑制根癌农标菌生长）上，在光照为2000~10000lx、25℃条件下进行选择培养。
6.继代选择培养选择培养2－3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的生长或分化培养基中使其生长或诱导生化。