异硫氰酸荧光素标记亲和素使用说明
fitc-异硫氰酸酯标记蛋白原步骤
fitc-异硫氰酸酯标记蛋白原步骤
FITC-异硫氰酸酯（FITC-isothiocyanate）标记蛋白原的步骤如下：
1. 准备所需材料：FITC-异硫氰酸酯、蛋白原、缓冲溶液、保护剂、质量控制溶液等。
2. 操作前准备：将FITC-异硫氰酸酯溶解在合适的溶剂中，制备FITC-异硫氰酸酯的工作溶液。
3. 蛋白原和FITC-异硫氰酸酯反应：将蛋白原加入含有FITC-异硫氰酸酯的工作溶液，使其反应一段时间（通常为1-2小时），在适当的条件下进行反应。
4. 反应终止：加入适当的保护剂或溶液终止反应，以保护蛋白原的活性和稳定。
5. 蛋白原的纯化：使用适当的方法将标记后的蛋白原从其他非特异性反应产物中纯化出来，常见的方法包括凝胶层析、亲和层析等。
6. 质量控制检测：使用质量控制溶液对标记后的蛋白原进行检测，以确保其标记效果和质量符合要求。
需要注意的是，具体的步骤会根据实验设计和蛋白原的特性而有所差异，以上仅为一般标记步骤的概述。
在进行实验前应仔
细阅读相关文献或标签试剂盒的说明书，并严格按照实验室的操作规范进行操作。
荧光标记在药物研究中的应用
荧光标记在药物研究中的应用范 雯,张燕玲3(天津医科大学医学检验系,天津 300203)摘要:荧光标记这种非放射性标记技术已成为现代分析检测中不可或缺的重要方法之一,然而将此技术应用于药物研究并不广泛。
荧光染料应用范围较为广泛,具有高灵敏度、高稳定性和高选择性等特点,目前新型荧光标记材料量子点的出现,克服了传统荧光染料的一些缺点,更有利于荧光标记技术在药物的药理活性、作用机制和动力学研究等领域的推广应用。
关键词:荧光标记;药物研究;量子点中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:100120971(2007)0120052205Appli ca ti on of fluorescen t l abeli n g i n drug researchF AN W en,Z HANG Yan 2ling(D epart m ent of M edical Exam ination,Tianjin M edical U niversity,Tianjin 300203,China )Abstract:The fluorescent labeling is one of the most i m portant methods of modern analysis as a non 2radi 2oactive labeling technique,however,it has not been widely app lied in drug research 1The fluorescent dye has wide range of app licati on,it is characterized by high sensitivity,stability and selectivity .Now the ne w type fluorescent dye quantu m dot has overcome the disadvantage of the organic ones,which makes it good use in the study of drugs in activities,reacti ons and dyna m ics 1Key words:fluorescent labeling;drug research;quantu m dot 收稿日期:2006204224 作者简介:范 雯,女,在读本科生,Tel:022*********,E 2mail:f w785883227@3通讯作者:张燕玲,女,教授,研究方向:荧光标记生物分子,Tel:022*********,E 2mail:zhwang@mail:zlnet 在生命科学及现代分子生物学领域里,研究和应用高灵敏度的非同位素检测方法一直是各国学者共同努力的方向。
异硫氰酸荧光素标记的方法
异硫氰酸荧光素标记的方法
异硫氰酸荧光素（FITC）标记的方法主要有两种：
1. 直接标记法：将待标记的抗体或蛋白与FITC溶液混合，按照一定的比例（通常是抗体/蛋白质：FITC=1mg:150μg）在4℃下反应8小时。
反应结束后，可以通过加入终止液来停止反应，并将标记物进行纯化。
2. 间接标记法：先将FITC与某种中间分子（如半乳糖、葡聚糖等）连接，再将中间分子与待标记的抗体或蛋白连接。
这种方法通常用于标记大分子物质，如细胞或组织切片。
需要注意的是，FITC标记过程中要保持避光，以避免荧光淬灭。
此外，标记反应的时间、温度和pH值等因素也会影响标记效果，需要进行优化和控制。
免疫组化
（一）酶桥法
过氧化物酶(HRP)
兔抗过氧化物酶抗体
羊抗兔IgG(二抗，桥抗体)
用特异性抗体与标本中抗原 兔抗人IgG （一抗）结合之后，将桥抗体结合于其
上，再将抗酶抗体结合于桥抗 组织中的抗原 体上，最后把酶结合在抗酶抗
体上，经过底物的呈色反应而 将抗原显示出来。
酶桥法的缺点：
（一）酶桥法
所用的抗酶抗体血清中含有低亲合力的抗 酶抗体分子，与酶的结合力较弱，容易洗脱 丢失，致方法的敏感性降低。
• 底物显色剂
DAB有致癌性， 应注意防护。
① DAB （ 二氨基联苯胺）：
阳性产物呈棕褐色；
② AEC （ 3-氨基 -9- 乙基-卡巴唑）：
阳性产物呈红色或紫红色。
（二）碱性磷酸酶(AP)
最佳反应pH值8.9-9.4。 AP在碱性环境下，可催化下列水解反应: α-磷酸萘酚酯十H2O→α-萘酚十磷酸盐 α-萘酚十偶氮染料→有色沉淀↓
组织抗原 二抗 一抗 酶 多聚化合物
特点： 1、敏感性高：每1个分子的复合物中约含10个分子
的HRP和10个分子的第二抗体，复合物中的 HRP的绝对 数量远高于其他复合物(如ABC)，本身已具备高度放大 作用。
2、特异性强：人体内不存在该多聚化合物，无非
特异性干扰，故背景染色浅。
此外，染色步骤为两步，且第二抗体孵育 时较短，使该方法更省时而简便。
(2)四甲基异硫氰酸若丹明（TRITC）：
易溶于水，最大激发光波长550nm，最大发 射光波长620nm，呈橙红色荧光，与蛋白质结合 方式同FITC。
Байду номын сангаас
(3)四乙基罗达明(RB200)：
不溶于水，溶于乙醇和丙酮。最大激发光波 长570nm，最大发射光波长595～600nm，呈明亮橙 红色荧光。
不同晶相的草酸钙晶体引起肾上皮细胞的毒性差异
不同晶相的草酸钙晶体引起肾上皮细胞的毒性差异孙新园;姚秀琼;余凯;欧阳健明【摘要】采用扫描电子显微镜(SEM)、激光共聚焦显微镜(LSM)、流式细胞仪、电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)等方法比较研究了尺寸约1.2 μm的一水草酸钙(COM)和二水草酸钙(COD)晶体对非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)的损伤差异.COM和COD均能引起Vero细胞的细胞活力和超氧化物歧化酶(SOD)活力降低、丙二醛(MDA)含量升高以及碘化丙啶(PI)红染细胞数目增多,且均呈现浓度依赖性.在相同晶体浓度时,COM的细胞毒性明显比COD强,引起细胞表面表达的粘附分子透明质酸(HA)比COD多,粘附量也显著增加.相比于COM晶体,Vero细胞更容易内吞COD晶体.COM与COD晶体对肾上皮细胞的毒性差异与晶面的离子密度以及细胞与晶体间的静电作用等因素密切相关.本文结果将有助于从分子水平上和细胞水平上阐释草酸钙结石的形成机理.【期刊名称】《无机化学学报》【年(卷),期】2016(032)005【总页数】9页(P818-826)【关键词】一水草酸钙;二水草酸钙;细胞毒性;浓度效应【作者】孙新园;姚秀琼;余凯;欧阳健明【作者单位】暨南大学生物矿化与结石病防治研究所,广州 510632;暨南大学生物矿化与结石病防治研究所,广州 510632;暨南大学生物矿化与结石病防治研究所,广州 510632;暨南大学生物矿化与结石病防治研究所,广州 510632【正文语种】中文【中图分类】R69;R329.2+8国家自然科学基金（No.21371077）资助项目。
＊通信联系人。
E-mail：*************.cn肾结石是一种临床常见的多发病，肾中结石的主要组分为草酸钙（CaOx）［1］，其中一水草酸钙（COM）的发生率约是二水草酸钙（COD）的2倍［2］。
COD 结石与高钙尿［3-4］，低枸橼酸水平［5］和高pH值［6］有密切的联系，而COM结石经常出现在正常尿钙情况下［7］。
FITC标记蛋白质的方法
FITC标记蛋白质的方法FITC（荧光异硫氰酸酯）是一种常用于标记蛋白质的荧光染料。
FITC 标记蛋白质的方法主要包括化学共价结合和生物亲和结合两种。
化学共价结合是FITC标记蛋白质最常用的方法之一、该方法利用FITC分子中的异硫氰基与蛋白质中的氨基酸侧链上的羟基、胺基、硫醇基等反应，形成稳定的共价键。
常用的化学共价结合方法有直接标记和间接标记两种。
直接标记方法是将FITC直接与蛋白质反应制备成FITC-蛋白质共价偶联物。
该方法简单快速，但容易引起蛋白质的损伤和聚集，从而影响蛋白质的功能和结构。
间接标记方法则采用二步法，在第一步中，将FITC标记到与蛋白质特异结合的二抗上，形成FITC-二抗共价偶联物；在第二步中，该FITC-二抗与蛋白质发生特异性的抗原-抗体反应，从而实现FITC标记蛋白质的目的。
该方法操作简单，不容易损伤蛋白质的结构和功能，因此在很多领域中被广泛应用。
除了化学共价结合，生物亲和结合也常用于FITC标记蛋白质。
生物亲和结合方法利用具有亲和性的结合分子在非共价方式下结合FITC和蛋白质，形成等效标记。
常用的生物亲和结合方法有亲和标记系统、酶标记系统和金标记系统。
亲和标记系统是一种利用富含半化合金属离子的亲合树脂，在存在FITC和蛋白质的条件下实现FITC标记的方法。
该方法在选择亲合树脂时需要考虑其对蛋白质的亲和性、将FITC与蛋白质结合后的稳定性以及标记后的蛋白质能否保持其结构和功能。
酶标记系统是一种利用酶标记物将FITC标记到蛋白质上的方法。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和逆转录酶等。
该方法对于需要进一步进行酶活性检测或者需要与其他酶标记物共同使用的试验有很大的应用价值。
金标记系统是一种利用金纳米颗粒将FITC标记到蛋白质上的方法。
金纳米颗粒具有很高的表面增强拉曼散射（SERS）信号，可以增加FITC标记物的检测灵敏度。
该方法可以应用于免疫组化检测、免疫荧光显微镜等领域。
免疫检验重点
1.免疫防御功能异常可导致（感染、免疫缺陷）疾病。
2.抗原抗体反应的特点有（特异性、比例性、可逆性、阶段性）3•抗原抗体反应的温度一般以（15〜40 C）为宜，最适温度为（37 C）4•影响抗原抗体反应的环境因素主要有（电解质、pH、温度）5•某些特殊的抗原抗体反应对温度有一些特殊的要求，如冷凝集素在（4C）左右与红细胞结合最好，（20 C）以上反而解离。
6•抗原抗体的结合分子间的引力包括（静电引力、范德华引力、氢键引力和疏水作用力），其中作用最强的是（疏水作用力）1•间接凝集反应的类型包括（正向间接凝集、反向间接凝集反应、间接凝集抑制反应和协同凝集反应）四种类型。
2•参与凝集反应中的抗原称为（凝集原），抗体称为（凝集素），常用的直接凝集试验有（玻片法、试管法、玻片法）3•在间接凝集反应中正向凝集反应是用（抗原）致敏载体以检测标本中相应的（抗体），而反向间接凝集反应是用（抗体）致敏载体以检测标本中相应（抗原）4•间接抗球蛋白试验可用已知抗原型红细胞检测血清中的（不完全抗体）,可用于输血前的（交叉配血）试验。
1．免疫沉淀反应是（可溶性抗原）与（相应抗体）的特异性结合 2．棋盘格法（抗原）和（抗体）同时稀释，可一次完成（抗原）和（抗体）的滴定 3．单向琼脂扩散是待测抗原从含有定量（抗体）的（凝胶）内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在两者比例合适的部位，形成（沉淀环）。
4．Maneini 曲线适用于（大分子抗原）的测定，在一定范围内，沉淀环随时间延长而扩大，抗原浓度与（扩散环直径的平方）呈线性关系，常用（普通）坐标纸作图。
5．Fahey 曲线适用于（小分子抗原）的测定，在一定范围内，沉淀环随时间延长而扩大，沉淀环直径与（抗原浓度的对数）呈线性关系，常用（半对数）坐标纸作图。
6．双向琼脂扩散试验可对抗原或抗体的存在、含量和相对分子量进行分析，沉淀线靠近抗原孔指示（抗体含量较高）；靠近抗体孔则指示（抗原含量较高）；不出现沉淀线则表明（无对应的抗原和抗体）。
蛋白标记技术详解
蛋白标记技术详解蛋白质标记的主要目的是监测生物过程、辅助检测（例如化合物的可靠定量、蛋白质修饰的特异性检测）或者纯化蛋白及其结合对象。
蛋白质的标记能够提高检测灵敏度以及简化检测工作流程。
目前有多种蛋白质标记技术来帮助我们研究感兴趣的蛋白质的丰度、位置、相互作用、翻译后修饰、功能，乃至监测活细胞中的蛋白质运输等问题。
目前有多种类型的标记物和标记方式可供选择，但是针对特定的应用应当选择适合的标记策略。
1.代谢标记策略代谢标记策略是一种体内标记方法，在这种方法中，细胞被“喂养”了化学标记的营养物，然后这些标记物被掺入新合成的蛋白质、核酸或代谢物中。
然后，我们可以收集细胞并分离这些分子以获得细胞生物过程的全局视图。
蛋白同位素标记原理蛋白同位素标记是一种经典的蛋白示踪和蛋白组学定量技术，用天然同位素（轻型）或稳定同位素（重型）标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，这样细胞新合成的蛋白质可以在细胞生长期间通过掺入含有不同同位素的氨基酸进行标记。
应用举例蛋白质组学研究方向流行的代谢标记方法是SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino acids inCell culture），即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记。
结合质谱技术，SILAC 通过使用重型氨基酸（例如，15N-或13C-赖氨酸）标记其中一组培养物或细胞系，而向另一组添加正常的轻型氨基酸，从而量化两种培养物或细胞系之间蛋白质丰度的差异。
然后将在这两种条件下生长的细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量，得到两种条件下蛋白质丰度差异的相对评估。
图1 SILAC的工作流程其他蛋白质代谢标记物原理如果不具备质谱实验条件，那么可以使用基于生物正交反应的代谢标记方法。
在生物正交系统中，细胞被“喂食”标记有一些对天然生物反应基团无反应的化学基团的分子结构单元。
荧光标记在药物研究中的应用
Ａ ｓａｔ Ｔｅ ｕｒｃ ｔ ｅｎ ｉｏｅｆｈ ｍｓｉｐｒｎｍｔ ｄ ｏｍｄｒａａｓ ａａ ｏ一ｄ ｂ ｒｃ： ｈ ｆｏ ｓ ｎｌ ｌｇｓｎ ｏｔ ｏ ｍ ｏａｔ ｅ ｏｓｆ ｏｅ ｎｌｉ ｓ ｎｎ ａｉ ｔ ｌ ｅｅ ａ ｉ ｂ ｅ ｔ ｔ ｈ ｎ ｙｓ ｒ－ ｏｃｖ ｌ ｅｎ ｔ ｈｉ ｅ ｈｗｖｒ ｉ ａ ｎｔｅｎ ｉ ｌａｐｅ ｉｄ ｇ ｓ ｒ ． ｈ ｆｏ ｓ ｎｄｅ ａ ｉ ａ ｌｇｅ ｎ ｕ，ｏｅｅ，ｔ ｓ ｏｂｅ ｗｄ ｙ ｐｌｄｎ ｒ ｒｅ ｈ Ｔｅ ｕｒｃ ｔｙ ｔｅ ｂ ｉ ｃ ｑ ｈ ｅ ｉ ｕ ｅ ａ ｃ ｌ ｅｅ ｈｓ ｉ ｒ ｇ ｏａｐｃ ｉ ，ｔｓ ｈｒ ｔ ｚ ｙ ｉ ｓ ｓｉｔ，ｔ ｉｙａｄｓｅｉｔ Ｎｗｔ ａ ｗ ｅ ｎｅ ｆ ｐｌａｏ ｉｉｃａ ｃ ｒｅ ｄａ ｉ ｎ ｔ ａｅ ｄｂ ｈ ｅ ｉ ｉ ｓｂｉ ｎ ｅ ｃｖｙ ｏ ｈ ｉ ｈ ｇ ｎｔ ｙ ａ ｌ ｖ ｔ ｌ ｔｉ． ｅ ｎｗｔ ｅ ｕｒ ｃ ｔｙ ｑａｔ ｏｈｓ ｖｒ ｍ ｔ ｄ ａｖｎ ｇ ｏｔ ｏ ａｉｏｅ， ｈ ｈ ａｅ ｉ ｅ ｙ ｆｏ ｓ ｎｄｅ ｕｎ ｍｄｔａ ｏ ｃ ｅｈ ｉｄａｔ ｅ ｆｈ ｒ ｎ ｎｓ ｗ ｉ ｍ ｋｓｔ ｐｌ ｅ ｅ ｕ ｅｏ ｅ ｓ ａ ｅ ｇ ｃ ｃ
药领域的 应用及发展［。 ’ 〕
收稿日 ２ ６ 一 期： 狈 ２ ０ ４ 作者简介： 雯， 在读本科生， ｌ ２一 ７２２ ，一ａ ： 范 女， ｅ ０ Ｔ ： ６７８ Ｅｍ ５ ｌ
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有机物质分子在吸收光能后， 分子从第 １ 单重激发 态的最低振动能级向基态跃迁时的发射光称为荧 光。利用荧光染料与被研究对象（ ／ 蛋白 多肤等） 吸 附或共价结合后其荧光特性发生改变， 从而反映有 关研究对象性能的信息。荧光标记技术起源于２ ０ 世纪４ 年代用荧光标记抗体来检测相应的抗原。 ０ 随着现代医学、 分子生物学和各种先进荧光检测仪 器及技术的应用， 荧光标记作为一种非放射性的标 记技术已应用于生命科学的各个研究领域， 并取得 了迅速的发展。荧光标记具有非放射性、 操作简便、 高稳定性、 高灵敏度和高选择性等特点， 且荧光标记 染料种类多、 方法灵活， 可应用于多种生物大分子及
核酸杂交课件
2）T4噬菌体多核苷酸激酶标记法 （polynucleofide kinase，PNK)
T4噬菌体多核苷酸激酶标记法示意图
（4）聚合酶链反应（PCR）标记DNA探针 （5）同位素标记RNA探针
1）SP6 RNA聚合酶体系 2）成对启动子系列
RNA探针标记
检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 DNA分子 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 RNA分子 检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放 的DNA分子 检测固定在膜上的DNA或RNA分子
检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
一、Southern印迹杂交
[原理]
Sourthern印迹杂交是分析DNA的一种方 法，从细胞或组织中提取高分子量的DNA，用 一种或多种限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝 胶电泳按大小分离所得片段，从凝胶中按原来 位置和顺序吸印转移到固相支持膜（硝酸纤维 素膜或尼龙膜）上，然后再与同位素或非同位 素标记探针杂交，最后经放射自显影或显色反 应进行检测。
杂交过程中须注意的问题：
（1）探针的浓度 （2）探针的长度 ：50～100bp （3）杂交的温度和时间：Tm-25℃，3h
5.杂交后处理
洗涤的条件包括盐溶液的浓度、温度、 洗涤次数和时间，一般遵循的原则是盐溶液 浓度由高到低而温度由低到高。值得注意的 是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥，否则 反而会增强背景染色。
2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
组织细胞中的核酸都以核蛋白复合体 的形式存在于细胞浆或细胞核中，经过固 定过程后，胞浆或胞核内生物大分子交联 形成网络结构，影响探针的穿透和杂交体 的形成。因此需要使用去污剂和蛋白酶对 组织细胞蛋白进行水解以去除核酸表面蛋 白。
fitc标记ova方法
fitc标记ova方法
OVA方法是一种用于标记FITC（荧光异硫氰酸酯染料）
的广泛使用的技术。
FITC是一种绿色荧光染料，常用于免疫
组化和细胞标记实验中。
此技术的名称中的"OVA"代表"Ovalbumin"（卵清蛋白），是一种常用的蛋白质标记物。
在FITC标记OVA方法中，首先需要将FITC与目标蛋白
质OVA进行化学反应，以将FITC分子共价结合到OVA分子上。
这可以通过在特定条件下，例如在碳酸氢钠缓冲液中的碳酸氢钠盐的存在下进行。
该反应产生的FITC-OVA复合物具
有荧光性质，可以用于标记和检测目标蛋白质。
FITC标记OVA方法具有许多优点。
首先，FITC是一种常
用的荧光染料，在许多实验室中广泛可得。
其次，FITC标记
的蛋白质可以通过荧光显微镜和流式细胞术等技术进行可视化和定量分析。
这种方法还可以用于研究蛋白质的定位、相互作用以及细胞内分布等方面。
然而，FITC标记OVA方法也存在一些限制。
首先，FITC
在某些条件下可能表现出光淬灭和光漂白的现象，这可能会降低标记的稳定性。
此外，某些细胞类型可能对FITC敏感，这
可能导致试验结果的误差。
FITC标记OVA方法是一种常用的荧光标记技术，适用于
各种免疫组化和细胞标记实验。
使用此方法可以实现对目标蛋白质的定位和定量分析。
然而，研究人员需要在实验设计和条件优化方面进行谨慎考虑，以确保获得可靠和准确的实验结果。
单抗标记
1. 酶标记
（1） 辣根过氧化物酶（HRP）标记
辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。
抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料或放射性碘的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。链霉亲和素及亲和素与生物素的亲和力非常高(Ka1015L／mo1)，并且二者间的相互作用实质上是不可逆的。由于链霉亲和素的等电点（pI）更适宜故其更常用，背量也因此较低。
根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。
2. 荧光素标记
（1） 异硫氰酸荧光素（FITC）标记
FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下：
C. 加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液（含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS）。
免疫组织化学检验技术
（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物 （三）方法评价
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三、非标记抗体酶免疫组化染色法 （一）原理
该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合形成复 合物，然后利用第二抗体（Ab2）作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与结合在组织抗原 上的第一抗体（Ab1）的Fc段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对抗原的检测。
人民卫生出版社
二、SPA法
人民卫生出版社
人民卫生出版社
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3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物， 在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏感性。
4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP）法，简 称APAAP法。技术要点与PAP法相似。
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免疫组化的检测原理
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免疫组化的检测原理
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第一节 免疫组化检验技术基本知识
人民卫生出版社
免疫组化全过程
人民卫生出版社
一、标本制作
•
标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分析的保障，良好的细胞和组织学结构将有助于抗
原的准确显示和定位。
（一）标本的主要来源
主要有：
在一起，形成亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC复合物），当其与检测反应体系中的
最新免疫组化与原位杂交
3）浸蜡：组织经二甲苯（xylene）处理后石蜡介入的过程，时间 长短取决于组织快的大小。温度应控制在56 - 60℃。
4）包埋：用模具使组织块包于石蜡中成型的过程。
4%多聚甲醛（paraformaldehyde）：以磷酸盐缓冲液配制的 4%多聚甲醛溶液。
2）复合固定剂
Bouin氏液：含苦味酸（nitroxanthic acid）和冰醋酸 （glacial acetic acid）的甲醛溶液。
Zamboni氏液：含苦味酸和冰醋酸多聚甲醛溶液。
PLP（periodate-lysine-paraformaldehyde）：含过碘酸和 赖
氨酸的多聚甲醛溶液，多用于需预固定的冰冻组织切片。
2.固定方法：必须用预冷（4℃）的固定液固定，并保持低温持 续固定至所需时间。
1）灌注固定（perfusion fixation）：最好的固定方法，尤其适 用于神经组织如脑、脊髓和视网膜。灌注固定后应迅速切取 所需组织，在预冷的固定液中继续浸泡固定至所需时间。
分子量为389，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波 长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛 的荧光素。 2.四甲基异硫氰酸罗达明 （tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）
分子量为444，最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为 620nm，呈现橙红色荧光。
5）修快：将包有组织的蜡块用刀切去多余的部分，修成一定形状 的过程。
6）切片：将包有组织的蜡块安装在切片机上进行切割的过程。一 般切3–6μm。
免疫组化技术及注意事项
4、免疫组化阳性结果的统计
Image-Pro Plus的主要用途是分析测量图象
照片中的黄色部 分是免疫组化染 色的阳性表达成 分。处理目标是 通过测量图片中 黄色部分的"黄" 度来反映相应蛋 白表达的的"量"
4.1 校正光密度
图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致
计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度”为零，其 灰度gray=0；纯白点的“亮度”为255，其灰度 gray=255
单克隆抗体技术
1.3 抗体的保存
抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定， 易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白 蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防 腐剂以延长保存时间。
酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3， 否则会抑制酶的活性。
抗体浓缩液-20℃保存两年，融解后抗体于2-8℃ 可以保存一个月，稀释抗体在4℃下可存放1-3天， 超过7天效价显著降低。
替代对照
PVN中Fos表达
3、免疫组化正式实验
3.1 步骤
组织 固定
脱水 透明 封片
冰冻 切片
阻断内 源性酶
显色 复染
二抗 处理
封闭 处理
一抗 处理
3.2 注意事项
组织固定 保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性
固定液的选择 ：免疫组化技术成功与否的基础。 不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差 异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的 固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouin’s 液、Zanboni’s液、Karnovsky’s液
AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片 以水性封片剂为主，染色切片不能久存。
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法中文名称：异硫氰酸荧光素酯中文别名：荧光素-5-异氰酸酯; 异硫氰酸荧光酯异构体; 异硫氰酸荧光橙红; 异硫氰酸荧光红; 异硫氰酸荧光黄; 异硫氰酸荧光素（同分异构体I）; 荧光素5-异硫氰酸盐,异构体1,95%; 异硫氰酸荧光素异构体1.95+%; 异硫氰酸荧光素英文名称：Fluorescein isothiocyanate isomer I英文别名：Fluorescein isothiocyanate, isomer 1; 5-FITC;5-Isothiocyanato fluorescein; FITC; FITC-CELITE(R); FITC ISOMER; FITC 'ISOMER I'; FITC, ISOMER I; FLUORESCEIN ISOMER I ISOTHIOCYANATE;2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-5-isothiocyanatobe nzoic acidCAS号：3326-32-7 EINECS号：222-042-0 分子式：C21H11NO5S分子量：389.3807InChI：InChI=1/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24 )3-6-16(19)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h 1-9,23H,(H,25,26)分子结构：密度： 1.46g/cm3熔点：360℃沸点：735.6°C at 760 mmHg闪点：398.7°C水溶性：practically insoluble蒸汽压： 1.02E-22mmHg at 25°C【FITC标记原理】当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
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异硫氰酸荧光素标记亲和素使用说明
FITC-Avidin
货号：SF065
规格：0.5ml
保存：-20℃避光保存，有效期12个月。
产品组成：
1ml FITC-Avidin产品中含1mg高度亲和纯化Avidin，F/P==3/1；
缓冲剂成分：0.01M PBS,防腐剂。
其中Avidin经化学修饰，等电点由pH10降为pH6.5。
标记方法：
FITC标记采用Hijmans,W.,et al.所研究的方法。
（参考文献：Hijmans,W.,et al.Clin.Exp.Immunol.,4,457(1969)
使用说明：
FITC标记试剂稀释液：PBS或TBS缓冲液，加入试剂级BSA至1%。
使用上述稀释液，免疫荧光法按1：10-1:100稀释，具体的稀释度须自己预先确定。
稀释后溶液应于当天使用，未用完的应弃置。
若产品存在微量沉淀，可离心后使用。
相关试剂：
SP2-10兔IgG免疫球蛋白抗原
SPA8-1羊抗小鼠IgG(纯化)
SF8-0.3羊抗兔IgG-FITC
SE16-0.1兔抗猪IgG-HRP
A1820HRP标记的抗体稀释液。