异硫氰酸荧光素FITC
FITC-右旋糖酐内化实验
FITC-右旋糖酐内化实验FITC-右旋糖酐从嵌入细胞的纤维蛋白水凝胶中释放纤维蛋白水凝胶是组织工程和药物输送应用中的重要生物材料。
这样，纤维蛋白通常与靶向再生组织的细胞和生物分子结合。
先前的实验研究分析了纤维蛋白水凝胶中不同分子的释放。
但是，嵌入式细胞对释放曲线的影响尚待定量研究。
实验的重点是在48小时的观察期内从纤维蛋白水凝胶中释放250 kDa的异硫氰酸荧光素（FITC）-右旋糖酐（FD），该纤维蛋白水凝胶中含有不同浓度的成纤维细胞或内皮细胞。
与无细胞凝胶相比，在纤维蛋白凝胶中添加细胞可使总释放量降低一小部分（成纤维细胞降低7–15％，内皮细胞降低6–8％）。
释放曲线显示受多种细胞活动的调节，包括凝胶降解和扩散的物理阻碍。
未发现细胞产生的力和基质变形（即致密化和纤维排列）对释放曲线有显着影响。
通过启用预测和调节各种生物分子释放曲线的方法，预期该知识将改善纤维蛋白在组织工程和药物递送应用中的整合。
小分子右旋糖酐制剂（脉通注射液）连续注射可发生较严重蓄积症，特点为间歇性弛张高热。
蓄积主要在淋巴结，其次为肺、肝、蓄积和代谢是缓慢进行的，可长达一年左右。
连续给药总量在300克以上易产生蓄积症。
据本文推断蓄积症的间歇性弛张高热发病机理可能由于迟发超敏型变态反应，每一次发热则为一次速发型，故属于混合型变态反应性疾病。
右旋糖酐的蓄积部位有选择性，脾脏病变不明显原因尚不清楚。
医药上右旋糖酐的应用很普遍。
右旋糖酐胶体液具有扩充血容量、维持血压的功效供出血及外伤休克时急救用。
右旋糖酐在人体内水解后会转变成较低分子量的化合物与血浆具有相同的胶体特性，会迅速代谢成葡萄糖，可作为血浆代用品。
中分子量右旋糖酐的排出较慢，作用时间可达6h，是外伤、大量失血时急救用药；小分子及低分子右旋糖酐还能改善微循环，消除血管内红细胞聚集防止血栓形成及渗透利尿的作用，可用于治疗急性失血性休克、心肌梗塞、脑血栓、脑供血不足、周围血管病及防止弥散性血管内濒血和肾功能衰竭等功效。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
异硫氰酸荧光素标记亲和素使用说明
异硫氰酸荧光素标记亲和素使用说明
FITC-Avidin
货号：SF065
规格：0.5ml
保存：-20℃避光保存，有效期12个月。
产品组成：
1ml FITC-Avidin产品中含1mg高度亲和纯化Avidin，F/P==3/1；
缓冲剂成分：0.01M PBS,防腐剂。
其中Avidin经化学修饰，等电点由pH10降为pH6.5。
标记方法：
FITC标记采用Hijmans,W.,et al.所研究的方法。
（参考文献：Hijmans,W.,et al.Clin.Exp.Immunol.,4,457(1969)
使用说明：
FITC标记试剂稀释液：PBS或TBS缓冲液，加入试剂级BSA至1%。
使用上述稀释液，免疫荧光法按1：10-1:100稀释，具体的稀释度须自己预先确定。
稀释后溶液应于当天使用，未用完的应弃置。
若产品存在微量沉淀，可离心后使用。
相关试剂：
SP2-10兔IgG免疫球蛋白抗原
SPA8-1羊抗小鼠IgG(纯化)
SF8-0.3羊抗兔IgG-FITC
SE16-0.1兔抗猪IgG-HRP
A1820HRP标记的抗体稀释液。
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法中文名称：异硫氰酸荧光素酯中文别名：荧光素-5-异氰酸酯; 异硫氰酸荧光酯异构体; 异硫氰酸荧光橙红; 异硫氰酸荧光红; 异硫氰酸荧光黄; 异硫氰酸荧光素（同分异构体I）; 荧光素5-异硫氰酸盐,异构体1,95%; 异硫氰酸荧光素异构体1.95+%; 异硫氰酸荧光素英文名称：Fluorescein isothiocyanate isomer I英文别名：Fluorescein isothiocyanate, isomer 1; 5-FITC;5-Isothiocyanato fluorescein; FITC; FITC-CELITE(R); FITC ISOMER; FITC 'ISOMER I'; FITC, ISOMER I; FLUORESCEIN ISOMER I ISOTHIOCYANATE;2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-5-isothiocyanatobe nzoic acidCAS号：3326-32-7 EINECS号：222-042-0 分子式：C21H11NO5S分子量：389.3807InChI：InChI=1/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24 )3-6-16(19)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h 1-9,23H,(H,25,26)分子结构：密度： 1.46g/cm3熔点：360℃沸点：735.6°C at 760 mmHg闪点：398.7°C水溶性：practically insoluble蒸汽压： 1.02E-22mmHg at 25°C【FITC标记原理】当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
异硫氰酸荧光素标记的方法
异硫氰酸荧光素标记的方法
异硫氰酸荧光素（FITC）标记的方法主要有两种：
1. 直接标记法：将待标记的抗体或蛋白与FITC溶液混合，按照一定的比例（通常是抗体/蛋白质：FITC=1mg:150μg）在4℃下反应8小时。
反应结束后，可以通过加入终止液来停止反应，并将标记物进行纯化。
2. 间接标记法：先将FITC与某种中间分子（如半乳糖、葡聚糖等）连接，再将中间分子与待标记的抗体或蛋白连接。
这种方法通常用于标记大分子物质，如细胞或组织切片。
需要注意的是，FITC标记过程中要保持避光，以避免荧光淬灭。
此外，标记反应的时间、温度和pH值等因素也会影响标记效果，需要进行优化和控制。
BSA-FITC
牛血清白蛋白（BSA）-FITC
Albumin Bovine Serum-FITC
【产品材料】
1、异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）
异构体I（IsomerI），Sigma F-7295，M.W：389.4
发射光谱（吸收光谱）493nm，荧光光谱550nm
2、牛血清白蛋白（BSA），Japan（分装），M.W：68000，纯度98%。
（Albumin Bovine Serum）
3、标记缓冲液：0.5MpH9.5C.B，洗脱液：0.01MpH7.2PBS
【标记方法】
直接标记法，RT2.5~3.0hs，离心后过Sephadex G-50，0.01MpH7.2PBS洗柱，洗脱液为0.01MpH7.2PBS。
【质量分析】
溶液为0.01MpH7.2PBS，蛋白浓度为 5.12mg/ml左右，FITC浓度为30~45ug/ml，含有2~5/万NaN3防腐，每支0.5ML。
【保存温度】
-20℃冻存一年以上。
【应用范围】
1、用于细菌、病毒、梅毒螺旋体、钩端螺旋体等微生物的抗原或抗体检查。
2、用于临床自身免疫病的多种自身抗体荧光检查，如抗核抗体，抗心肌抗体等。
3、细胞因子等检查的荧光流式细胞仪测定。
4、白细胞分型抗原的免疫荧光染色。
5、免疫组织及免疫病理中抗原，抗体检查，如各种肿瘤抗原检查。
FITC标记胰岛素的合成、纯化及表征
FITC标记胰岛素的合成、纯化及表征李铮;褚丽芸;郑爱萍【摘要】目的以异硫氰酸荧光素(FITC)标记胰岛素(INS)制备荧光探针FITC-INS,并对FITC-INS进行纯化,结构鉴定及活性分析.方法 FITC通过共价结合标记INS分子,投料比为3:1,采用Sephadex G-25凝胶滤过色谱柱分离和纯化FITC-INS,质谱法进行结构鉴定,通过测定血糖值评价FITC-INS的生物活性.结果荧光标志物FITC-INS纯度较高,与游离INS相比,FITC-INS降血糖效果无显著性差异,保留了INS的生物活性.结论本研究所制备的荧光探针FITC-INS纯度高且生物活性良好.【期刊名称】《中国医药指南》【年(卷),期】2011(009)016【总页数】3页(P8-10)【关键词】胰岛素;异硫氰酸荧光素;荧光标记【作者】李铮;褚丽芸;郑爱萍【作者单位】北京市药品审评中心,北京,100053;邯邢冶金矿山局总医院,河北,邯郸,056005;军事医学科学院毒物药物研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】R927胰岛素（insulin，INS）是一种由51个氨基酸组成的蛋白多肽类药物，是目前临床治疗糖尿病最主要、最有效的药物。
但由于胃酸的破坏、消化酶的降解以及难以跨越生物膜的机械屏障作用等使得该类药物口服无效，只能以注射的形式给药，且往往需要长期反复地频繁给药，为患者带来极大的不便，因此近十几年来开发口服给药系统的胰岛素纳米粒制剂已引起国内外药学工作者的广泛关注[1-3]。
INS相对分子质量大（相对分子质量约5800），并且由于强亲水性而使其难以跨越脂质膜吸收，为了改善和提高水溶性药物的口服吸收利用度，口服吸收机制的研究非常重要，其中以Caco-2细胞为模型，结合激光共聚焦技术和流式细胞技术，开展药物口服吸收机制的研究是一种常用的途径[4-8]。
本研究以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）作为荧光探针设计合成了荧光标记的INS （FITC-INS），此标志物可用于激光共聚焦显微镜的观察或流式细胞仪的检测，以探讨INS跨膜转运的吸收机制。
FITC标记多糖的研究进展
FITC标记多糖的研究进展孙檬檬;郝鲁江【摘要】多糖具有抗肿瘤、提高免疫力等多种生物学活性,是国内外研究的重要药物来源.由于多糖没有光吸收的基团,无法直接通过荧光分光光度计等设备检测,因而将多糖进行荧光标记成为检测多糖的重要方法.荧光标记技术分析多糖能够具有较高的灵敏度和选择性,其中异硫氰酸荧光素(FITC)在生化研究中应用较为广泛.目前关于FITC标记多糖的研究颇为丰富,本文对相关研究进展进行了综述.【期刊名称】《山东轻工业学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(032)005【总页数】5页(P22-26)【关键词】异硫氰酸荧光素;多糖;标记【作者】孙檬檬;郝鲁江【作者单位】齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物基材料与绿色造纸国家重点实验室,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物基材料与绿色造纸国家重点实验室,济南250353【正文语种】中文【中图分类】Q946多糖是高分子化合物,包括同多糖和杂多糖,多由10个以上单糖构成的糖单位重复组成。
多糖除了具有生活功能(如淀粉),还有免疫调节[1]、抗肿瘤[2]、抗衰老[3]、降血糖[4]、降血脂[5]等功能。
为了便于在研究过程中使用荧光分光光度计、流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜等设备的检测,将不携带光吸收基团的多糖进行荧光标记成为检测多糖的首要、关键技术难点。
荧光探针技术分析多糖灵敏度高、选择好,在化学和生物的研究分析中广泛应用[6-7],目前已逐渐代替了放射性同位素标记方法。
荧光素类、罗丹明类、氰染料等是较为常见的荧光染料。
其中,荧光素类染料又包括异硫氰酸荧光素、羟基荧光素(FAM)等。
这些染料可以与—OH、—SH、—NH2等基团结合,用于荧光探针检测和分析多糖。
荧光素类染料标记的方法较稳定、效率高；罗丹明类染料的活性部位可与待标记物的—NH2结合,常用的染料包括羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、四乙基罗丹明(RB200)等,其稳定性更好、标记效率更高；氰染料在光照下不稳定,但标记效率较高、光谱范围广,主要包括香豆素类、哌洛宁类等染料。
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于使最后免疫球蛋白浓度为再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，烧杯中，20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓。
绿色荧光FITC-PNA┃FITC标记花生凝集素用于生物化学、细胞生物学
绿色荧光FITC-PNA┃FITC标记花生凝集素用于生物化学、细胞生物学今天昊然小编分享绿色荧光FITC-PNA┃FITC标记花生凝集素用于生物化学、细胞生物学：花生凝集素（Peanut agglutinin，简称PNA）是一种植物来源的蛋白质，通常从花生（peanut）中提取得到。
它属于豆科植物（Fabaceae）中的一个类似凝集素（lectin）的蛋白质。
凝集素是一类特殊的蛋白质，具有特异性地结合到糖分子（糖基）的能力。
花生凝集素具有特定的糖基结构选择性，主要与糖蛋白（glycoproteins）和糖脂质（glycolipids）中的半乳糖（galactose）和N-乙酰半乳糖（N-acetylgalactosamine）结合。
由于它的特异性结合性质，花生凝集素在生物学研究中常被用作细胞表面糖基的探针。
花生凝集素通常用于生物化学、细胞生物学和免疫学研究中，用作特定糖基的检测和研究工具。
它的结合性质被广应用于生物标记、分离、纯化、细胞识别等领域，有助于研究人员了解细胞表面糖基的分布和功能。
所以荧光素-异硫氰酸酯（Fluorescein isothiocyanate，FITC）可以用于标记花生凝集素（Peanut agglutinin，PNA）。
FITC是一种荧光染料，通常呈现出明亮的黄绿色荧光。
它具有异硫氰酸酯官能团，可以与花生凝集素中的氨基残基发生共价结合，形成荧光标记的花生凝集素。
这种标记后的花生凝集素-FITC复合物可以在荧光显微镜下被观察和检测，用于细胞成像、免疫荧光染色、流式细胞仪分析等生物实验中。
注意：在进行FITC标记花生凝集素或其他蛋白质的实验时，研究人员需要选择适当的实验条件，以确保标记的效率和稳定性。
同时，也需要遵循实验室的安全操作规程，确保实验的安全进行。
以上来源于文献整理，如有侵权，请联系删除，RL2023.10。
异硫氰酸荧光素标记尿激酶的制备与性能研究
异硫氰酸荧光素标记尿激酶的制备与性能研究张雅娟;俞洁;张冬未;梁洪泽;梁明明;赵玲玲【摘要】Fluorescein labeled urokinase (FITC-uPA) is synthesized by the reaction of fluorescein isothiocyanate (FITC) with urokinase (uPA), a kind of protein drug for thrombolysis. The reaction is confirmed by1HNMR and FT-IR. The ratio (F/P) of fluorescein over protein is 0.45. The urokinase is found to possess good fluorescent property after fluorescein is labeled, and the detection limit of fluorescence is as low as 10-6 g·mL-1. There is obvious linear relationship between the fluorescein intensity and concentration of FITC-uPA within the concentration range of 1-100μg·mL-1, which can be used for qualitative/quantitative detection and tracking of micro/trace proteins. FITC-uPA has similar hydrodynamic diameter and thrombolysis efficiency with the unlabeled urokinase. Based on the study, it can be concluded that the fluorescein-label is a simple and effective method for thrombolysis drug labeling without affecting the biological active of urokinase.%用异硫氰酸荧光素(FITC)对溶栓蛋白药物尿激酶(uPA)进行了荧光标记，制备了荧光素标记的尿激酶(FITC-uPA)，经核磁谱及红外谱表征证实了反应能有效进行，其荧光素/蛋白值(F/P)值为0.45.尿激酶经荧光素标记后，具有良好的荧光性质，其荧光检测下限低达10-6 g·mL-1.在1~100g·mL-1范围内，荧光强度与溶液浓度具有很好的线性关系，可用于微/痕量蛋白质的定量/定性检测和跟踪标记.荧光素标记后的尿激酶，其流体力学直径与未标记的尿激酶基本一致，其体外溶栓能力也与未标记的尿激酶相当，说明FITC标记基本不影响尿激酶的生物活性，是一种简单、有效的溶栓药物标记方法.【期刊名称】《宁波大学学报（理工版）》【年(卷),期】2016(029)003【总页数】5页(P78-82)【关键词】异硫氰酸荧光素;荧光标记;尿激酶;溶栓【作者】张雅娟;俞洁;张冬未;梁洪泽;梁明明;赵玲玲【作者单位】宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波 315211;宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波 315211;宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波 315211;宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波 315211;马鞍山市人民医院，安徽马鞍山 243000;宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波315211【正文语种】中文【中图分类】TQ937尿激酶是我国最常用的溶栓药物，以其有效的溶栓作用和可接受的价格为广大脑卒中患者所接受. 尿激酶是从健康人尿中分离或从人肾组织中培养获得的一种蛋白酶，能催化裂解纤溶酶原成为纤溶酶，纤溶酶能降解纤维蛋白凝块，以及血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，从而发挥溶栓作用. 然而尿激酶的半衰期仅有8～15min，且没有血栓靶向特异性，溶栓的同时也增加了机体出血的风险. 另外，渗透到血管外的药物还可以参与血脑屏障破坏、水肿形成等反应过程，加重神经系统损伤［1］. 目前，研究者们为解决溶栓药物的弊端问题大多采取的策略主要包括药物的PEG化［2-3］、构筑药物释放体系［4-9］和结合纤维蛋白特定抗体［10-12］. 在这些方法策略中，需要定量检测尿激酶等溶栓药物的体外释放行为，以及溶栓药物体系的离体/体内血栓的靶向性、溶栓有效性、血栓渗透性、组织安全性等. 由于尿激酶等溶栓药物是纤溶酶原激活剂，在紫外可见光区没有强的特征吸收峰，不能采用常规的紫外、荧光等方法进行定量/定性检测，也不能进行体内的检测跟踪.文献报道尿激酶等溶栓药物大多数使用高效液相色谱（HPLC）和酶联免疫试剂盒（ELISA）进行定量检测分析［3，13］，但是HPLC需要专用的蛋白质分离色谱柱，其价格都非常昂贵； ELISA价格昂贵，步骤冗长繁琐，对操作人员要求较高，且受人为和环境影响比较大. 因此，发展一种简单的、常规的尿激酶检测方法十分必要.荧光素是一类具有光致荧光特性的染料，由于其较高的摩尔吸收率和量子产率、良好的水溶性等特性，在蛋白-蛋白相互作用、试样分析、DNA标签、基因表达和分析检测等生物分析领域具有广泛的应用［14-18］. 目前，常用于生物标记的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）、四甲基乙硫氰酸罗丹明（TRITC）、酶作用后产生荧光的物质如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷和镧系螯合物等［18-21］. 其中， FITC呈明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛的荧光素，其最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，具有较高的稳定性和蛋白质结合力，常用于胰岛素、牛血清白蛋白（BSA）和抗体等的标记. 笔者使用FITC对尿激酶进行荧光标记，能够很方便地利用凝胶色谱进行分离纯化，其荧光强度与蛋白浓度在一定范围内呈线性关系，可用于蛋白的荧光定量检测.且相对于纯尿激酶而言， FITC标记尿激酶（FITC-uPA）具有相当的酶活性和体外溶栓能力，为研究者们针对溶栓药物的弊端问题进行的各类研究提供了极大的方便.1.1 原料尿激酶（uPA），丽珠医药集团股份有限公司；异硫氰酸荧光素（FITC），Sigma-Aldrich， St. Louis，US；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和甲醇购于国药集团化学试剂有限公司， AR；氯化铵购于宁波市化学试剂公司， AR.1.2 FITC标记尿激酶(FITC-uPA)的合成FITC标记尿激酶合成参考文献［14］FITC血清白蛋白的合成方法. 称取100mg uPA置于25mL单口瓶中，加入10mL PBS（0.01mol·L-1， pH 8.0）配成10mg·mL-1溶液. 将单口瓶放到4℃冰水混合浴中避光搅拌，滴加0.75mL FITC甲醇溶液（1mg· mL-1），反应8h后，加入氯化铵（终浓度50mmol·L-1）终止反应，继续搅拌2h后，混合物通过凝胶渗透色谱柱分离，将所得到的溶液冷冻干燥得到最终产物，保存于-20℃待用.1.3 产物的结构表征及性能测试1.3.1 核磁共振分析（NMR）称取约10 mg待测样品溶于氘代试剂中，采用Bruker AMX 400MHz核磁共振谱仪采集.1.3.2 红外光谱（FT-IR）分析将冷冻干燥样品与溴化钾混合研成粉末，压片，用Bruker Equinox 55 FT-IR红外光谱仪分析.1.3.3 粒径测试采用Brookhaven Zeta plus analyzer （Brookhaven Instruments Corporation，US）进行粒径及粒径分布测试，所有样品在测试前均用PVDF材质的微孔滤膜过滤，孔径0.8 μm.1.3.4 分子荧光光谱分析配置不同浓度的FITC-uPA PBS溶液，用Cary Eclipse荧光光谱仪（Varian，US）采集溶液的荧光发射光谱. 激发波长为495nm，发射波长范围为505～600nm，扫描速率2400nm·min-1，狭缝宽度为5.0 nm，记录520nm处的发射光强度I520，以I520对FITC-uPA样品浓度作图.1.3.5 计算FITC-uPA中FITC与uPA的摩尔比F/P配制1.0mg·mL-1uPA/PBS蛋白溶液，用UV-7504紫外可见分光光度计测其在280nm处的吸光系数E%0.1；配制1.0mg·mL-1FITC-uPA/PBS样品溶液，分别测其在280nm和495nm处的吸光系数A280和A495，依照相关公式计算FITC与uPA的摩尔比/FP［14］：其中，wM为蛋白质uPA的分子量.1.3.6 体外溶栓实验血栓的制备：标本供应者均为年龄在40～60岁的非血液病患者，入院前没有使用任何抗凝、抗血小板或者溶栓药物等. 入院后，肘前静脉抽取4mL左右静脉血，放入无抗凝剂红色真空管中，室温下将标本静止放置3h使其自然形成血栓，血栓成分分离待用. 从血液离体到形成血栓后开始溶栓的时间为5h左右. 每条血栓成长条圆柱状，长约3cm，滤纸将表面水分吸干，小刀尽量均分成4等份，用精确度1mg的分析天平称重每份并记录其值标记为M1，各组血栓间的干湿程度尽量一致.实验步骤：将每份标本处理完后等分成6块血栓，分别放入6只5 mL离心管中，将离心管下端固定在有机玻璃孔板上，分为PBS溶液组、uPA+PBS溶液、FITC-uPA+PBS溶液组. 分别向每只离心管中加入1mL的溶液，确保每只离心管内的尿激酶当量为3mg，放入37℃水浴缸中2h. 取出血栓，再次用滤纸吸干表面的水分，用分析天平称重. 标记为M2. 干预后的失重标记为M3， M3=M1-M2，溶栓率=M3/M1×100%.2.1 FITC标记尿激酶(FITC-uPA)的合成FITC标记尿激酶（FITC-uPA）是利用FITC上的异硫氰酸基与尿激酶的自由氨基反应，将荧光素连接到蛋白质分子上，其反应如图1所示.1HNMR谱上化学位移4.9附近羟基质子峰，以及3.2～3.7处-NH-上质子峰的出现说明反应的发生［16］（图2），如图3所示，红外光谱上1030cm-1处归属于FITC上C=S伸缩振动峰的出现也说明FITC成功连接到尿激酶上［18］. 经计算， FITC-uPA的/FP值为0.45，激光粒度仪测得其流体力学直径为7nm左右，与未经FITC标记的尿激酶粒径基本一致（图4），这也从侧面说明了FITC标记后对尿激酶的空间结构没有太大影响，对于保持尿激酶活性具有积极意义.2.2 FITC-uPA的荧光性质FITC标记赋予了尿激酶良好的荧光性质，激发波长为495nm时，其最大发射波长在520nm左右，与FITC的荧光光谱性质基本一致. 当FITC-uPA的质量浓度低至10-6g·mL-1时，在所设测试条件下，其荧光发射光谱图仍然很平滑，最大荧光强度为16.8（图5），说明FITC-uPA具有良好的荧光性质，可用于尿激酶的微/痕量定性检测和体内/外标记. 在文中测试范围1～100μg·mL-1内， FITC-uPA的荧光强度与其浓度具有较好线性关系（图6），其线性方程为y=24.27x-0.013，相关系数为0.999，可用于微/痕量蛋白质的定量检测.2.3 FITC-uPA的蛋白活性用荧光素对尿激酶进行标记的目的是便于跟踪检测蛋白质在体内外的位置及含量，其前提是要最大可能地保持蛋白质的活性，即在不丧失尿激酶作为溶栓药物性能的基础上对其进行修饰.用体外溶栓实验对FITC-uPA的蛋白药物活性进行了评估，以PBS溶液和未标记的当量尿激酶作为参照. 结果表明，在本文实验条件下，未经荧光素标记的尿激酶溶栓率为80.4%（图7），而FITC-uPA的溶栓率为76.8%，是尿激酶的95.5%. 尿激酶经FITC标记后，保持了较高的活性，蛋白活性的极小部分损失可能是由于荧光素修饰后引起的微小蛋白空间结构变化所引起的，有待于进一步的研究［3，22］. 然而从体外溶栓实验结果来看， FITC-uPA仍具有与尿激酶相当的溶栓效果，有较好的溶栓能力. 因此荧光素标记作为一种简单可行的蛋白质标记方法，对尿激酶的活性基本无影响，可用于下一步的溶栓药物体系离体/体内血栓的靶向性、溶栓有效性、血栓渗透性、组织安全性等研究.用异硫氰酸荧光素对溶栓蛋白药物尿激酶进行了荧光标记，制备了荧光素标记的尿激酶FITC-uPA，经核磁、红外表征证实了反应的有效进行，其荧光素/蛋白值（/FP）值为0.45. 尿激酶经荧光素标记后，具有良好荧光性质，其荧光检测下限低达10-6g·mL-1，荧光强度与溶液质量浓度在1～100 μg·mL-1范围内具有很好的线性关系，可用于微/痕量蛋白质的定量/定性检测和跟踪标记. 荧光素标记对尿激酶的分子结构和蛋白活性没有明显影响，FITC-uPA的粒径约为7nm，与未标记的尿激酶基本一致，体外溶栓实验表明FITC-uPA的溶栓能力与纯尿激酶相当，很好地保持了尿激酶的蛋白活性. 异硫氰酸荧光素标记是一种简单、有效、可行的尿激酶标记方法，为尿激酶的常规测试提供了极大的便利.【相关文献】［1］Marler J R. 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常用荧光基团的名称及颜色
常用荧光基团的名称及颜色
荧光基团是一类能够在紫外或可见光激发下发射荧光的化学基团。
以下是一些常用的荧光基团及其典型的荧光颜色：
荧光素（Fluorescein）：激发波长约为494纳米，发射波长约为521纳米，呈现黄绿色荧光。
罗丹明B（Rhodamine B）：激发波长约为540纳米，发射波长约为625纳米，呈现红色荧光。
荧光染料Cy5：激发波长约为650纳米，发射波长约为670纳米，呈现红色荧光。
荧光染料Cy3：激发波长约为550纳米，发射波长约为570纳米，呈现橙红色荧光。
亚甲基蓝（Methylene Blue）：激发波长约为664纳米，发射波长约为690纳米，呈现红色荧光。
荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC，Fluorescein Isothiocyanate）：激发波长约为495纳米，发射波长约为520纳米，呈现黄绿色荧光。
吲哚橙（Acridine Orange）：激发波长约为502纳米，发射波长约为525纳米，呈现橙黄色荧光。
荧光素-5-醋酸酯（CFSE，Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester）：激发波长约为488纳米，发射波长约为520纳米，呈现黄绿色荧光。
这些荧光基团被广泛应用于生物医学、生物化学和材料科学等领域，用于标记和追踪生物分子，以及在荧光显微镜等技术中应用。
值得注意的是，荧光颜色可能因化合物的环境和浓度而有所变化。
1。
单抗标记
1. 酶标记
（1） 辣根过氧化物酶（HRP）标记
辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。
抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料或放射性碘的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。链霉亲和素及亲和素与生物素的亲和力非常高(Ka1015L／mo1)，并且二者间的相互作用实质上是不可逆的。由于链霉亲和素的等电点（pI）更适宜故其更常用，背量也因此较低。
根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。
2. 荧光素标记
（1） 异硫氰酸荧光素（FITC）标记
FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下：
C. 加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液（含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS）。
荧光免疫技术练习题
荧光免疫技术练习题一、A11、目前应用最广泛的荧光素为A、异硫氰酸荧光素FITCB、四乙基罗丹明RB200C、四甲基异硫氰酸罗丹明D、镧系螯合物E、藻红蛋白R-BE2、FITC的吸收波长为A、495nmB、520nmC、570nmD、450nmE、360nm3、作为荧光抗体标记的荧光素必须具备的条件中，可以提高观察效果的是A、必须具有化学上的活性基团能与蛋白稳定结合B、性质稳定不会影响抗体的活性C、荧光效率高，荧光与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合的方法简便快速E、与蛋白质的结合物稳定4、异硫氰酸荧光素的英文缩写是A、RB200B、FITCC、TRITCD、HRPE、TMB5、纯化荧光素标记抗体时，去除游离荧光素可采用的方法是A、盐析法B、离子交换层析C、亲和层析D、透析法E、活性炭吸附6、下列有关直接法荧光抗体染色技术的叙述，错误的是A、简单易行，特异性好B、敏感性较间接法差C、可对抗原或抗体作检测D、检测一种抗原需要制备一种荧光抗体E、结果直观，易于判断7、荧光效率的决定因素是A、荧光素本身特性B、激发光波长C、激发光强度D、环境因素E、温度8、要使荧光强度与荧光物质的浓度成正比，应使A、激发光必须很强B、样品浓度应适中C、待测物吸光系数必须很大D、光源与检测器应与样品在同一线上E、液槽厚度要足够厚9、荧光抗体试验所没有的类型是A、直接法B、间接法C、补体结合法D、间接抑制法E、双标记法10、荧光素发射荧光属于A、光照发光B、化学发光C、生物发光D、电化学发光E、偏振光11、荧光效率是指A、荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、荧光色素产生荧光的强度C、接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、物质产生荧光的效率12、免疫荧光显微技术中，特异性最高，非特异性荧光染色因素最少的方法是A、直接法B、间接法C、补体结合法D、双标记法E、多标记法。
常用荧光探针小结
四、罗丹明200
AC41323-0010
RB200，也称丽丝胺罗丹明B 无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精 和丙酮，性质稳定，可长期保存，最大吸收光谱为570nm，呈明亮的橙色荧 光，因与FITC的黄绿色有明显区别，故被广泛用于对比染色或用于两种不同 颜色的荧光抗体的双重染色。
标 记 方 法 方法：取1g RB200及五氯化磷（PCL5）2g放乳钵中研磨5min （在毒气操作橱中），加10ml无水丙酮，放置5min，随时搅拌，过滤，用所 得溶液进行结合。将每亳升血清用1ml生理盐水及1ml碳酸盐缓冲液 （0.5mol/L，pH9.5）稀释，逐滴加入0.1ml RB200溶液，随加随搅拌，在04℃继续搅拌 12-18h。
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五பைடு நூலகம்溴化乙锭
详见第四节“应用于核酸检测的荧光探针技术”
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六、DAPI （ 4‘,6-diamidino-2-phenylindole）
DAPI was first synthesised in as part of a search for drugs to treat trypanosomiasis. Although it was unsuccessful as a drug, further investigation indicated it bound strongly to DNA and became more fluorescent when bound. When bound to double-stranded DNA DAPI has an absorption maximum at a wavelength of 358 nm (ultraviolet) and its emission maximum is at 461 nm (blue). Therefore for fluorescence microscopy DAPI is excited with ultraviolet light and is detected through a blue/cyan filter. The emission peak is fairly broad DAPI will also bind to RNA, though it is not as strongly fluorescent. Its emission shifts to around 500 nm when bound to RNA.
最新免疫组化与原位杂交
3）浸蜡：组织经二甲苯（xylene）处理后石蜡介入的过程，时间 长短取决于组织快的大小。温度应控制在56 - 60℃。
4）包埋：用模具使组织块包于石蜡中成型的过程。
4%多聚甲醛（paraformaldehyde）：以磷酸盐缓冲液配制的 4%多聚甲醛溶液。
2）复合固定剂
Bouin氏液：含苦味酸（nitroxanthic acid）和冰醋酸 （glacial acetic acid）的甲醛溶液。
Zamboni氏液：含苦味酸和冰醋酸多聚甲醛溶液。
PLP（periodate-lysine-paraformaldehyde）：含过碘酸和 赖
氨酸的多聚甲醛溶液，多用于需预固定的冰冻组织切片。
2.固定方法：必须用预冷（4℃）的固定液固定，并保持低温持 续固定至所需时间。
1）灌注固定（perfusion fixation）：最好的固定方法，尤其适 用于神经组织如脑、脊髓和视网膜。灌注固定后应迅速切取 所需组织，在预冷的固定液中继续浸泡固定至所需时间。
分子量为389，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波 长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛 的荧光素。 2.四甲基异硫氰酸罗达明 （tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）
分子量为444，最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为 620nm，呈现橙红色荧光。
5）修快：将包有组织的蜡块用刀切去多余的部分，修成一定形状 的过程。
6）切片：将包有组织的蜡块安装在切片机上进行切割的过程。一 般切3–6μm。
免疫荧光技术
荧光分子的辐射能力在受到激发光较长 时间的照射后会减弱甚至猝灭，一些化合物对 荧光有猝灭作用，因此荧光物质的保存应注意 避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他 化合物的接触。
荧光抗体的制备
作为标记的荧光素应符合以下要求：
①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团， 与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及 其降解产物易于清除。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性 ②酶促反应专一性，保证特异性 ③底物反应放大作用，提高敏感性 ④酶标试剂保存稳定 ⑤操作简便，安全易行
主要试剂的制备与要求
一、酶与酶作用底物
（一）用于标记酶的要求： • 酶活性高 • 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原
与抗体的免疫反应性 • 酶催化底物后信号易判定或测定 • 酶活性不受样品中其他成分的影响 • 酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安
标记抗体的纯化：透析法 层析分离法
荧光抗体的鉴定
F/P比率： 将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0，分别
测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素 的特异吸收峰
F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光 素越多，反之则越少。一般用于固定标本的 荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色
的以F/P＝2.4为宜。
于自动化，最常用。
2.微颗粒 结合容量大，反应迅速，逐
渐普遍用于自动化分析。
3.膜载体 硝酸纤维素膜（NC）、尼龙
膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定 量的斑点ELISA。
四、免疫吸附剂
• 免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅 毒特异性诊断常用方法之一。
• 用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情 况。
• 在寄生虫感染诊断中，间接免疫荧光试验 （IFAT）是当前公认的最有效的检测疟疾 抗体的方法。
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异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)
FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
FITC是一种常用的绿色荧光探针。
FITC的吸收(激发)和发射峰参见下表。
Fluorophore Absorption Peak(nm) Emission Peak(nm)
FITC 492 520
当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法
(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol ／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20) d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。
结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。
⑤过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。
洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml标记全球蛋
白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1．7倍左右)。
2．Chadwick法
(1)试剂和材料抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。
(2)方法及步骤①抗体准备用o～4~C的pH8。
0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。
②荧光色素准备按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0．01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解。
③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~C冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h。
④透析和柱层析方法同Marsshall法。
3．改良法
(1)试剂和材料①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。
NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸馏水
②0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。
③3％碳酸钠水溶液配法称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
④其他试剂和材料l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。
(2)方法及步骤①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol／LNaCl)及缓冲液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。
②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C
下电磁搅拌12～14h。
③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。
④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o．01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可达2年以上。
4．透析标记法
此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。
(1)试剂和材料试剂和材料同改良法。
(2)方法及步骤①用0．025mol／L碳酸盐缓冲液pH9．0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度，装入透析袋中。
②用同一缓冲液将FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC 稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。
③容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。
取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4℃中。