连接转化步骤

1.10 连接产物的转化

1.10.1 大肠杆菌（E. coli DH5α)感受态的制备

（1）将-70℃保存的DH5α甘油菌活化于LB培养基，37℃过夜培养。挑取DH5α单菌落至20 mL LB液体培养基中，37℃条件下，180 rpm振荡

过夜培养；

（2）吸取200 μL上述菌液按1%接种量加至20 mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养1-2 hr，直到菌液浓度达到OD600=0.2-0.5；

（3）吸取培养好的菌液移至50 mL的灭菌离心管中，5,000 rpm，4℃离心

10 min，弃尽上清；

（4）用5 mL冰浴的0.1 M CaCl2轻轻悬浮菌体，在冰上放置10 min；

（5）5,000 rpm，4℃离心10 min，弃上清，收集菌体；

（6）用2 mL冰浴的含10%甘油的0.1 M CaCl2重新悬浮菌体，并分装于冰浴的1.5 mL离心管中（每管装入100 μL），在4℃放置（48 hr内进行

转化效率最高），或者置于-70℃保存备用。

注：感受态的制备必须保证在低温条件下进行，操作过程尽量轻柔。可在制作完后，转工具性质粒，以验证感受态效率。

1.10.2 连接产物的热激转化

（1）吸取连接产物（体积≤10 μL）于50-100 µL感受态细胞中，轻轻混合均匀，在冰上放置30 min；

（2）将离心管放到42℃水浴中，热激90 s（严格控制热击时间），取出后迅速放于冰上，冷却1-2 min；

（3）向离心管中加入5倍体积的SOB(或LB)液体培养基，37℃振荡培养45-60 min；

（4）8,000 rpm离心30 s，去部分上清，留100 μL左右培养液，移液枪吸打均匀后，用三角涂布器涂布在选择性LB平板（含相应抗生素）上；

（5）倒置培养皿于37℃培养12-16 hr，待单菌落长出后，挑取单菌落于已加入相应抗生素的LB液体培养基中，37℃条件下，180 rpm振荡过夜

培养，提取质粒并进行酶切验证。

1.14 稻黄单胞菌感受态的制备

（1）挑取少量-70℃保存的PXO99A菌体在NA平板上划线，28℃培养2-3 d；

（2）挑单菌落接种于20 mL NB液体培养基中，28℃条件下，200 rpm振荡过夜培养；

（3）吸取培养好的菌液按1%的接种量接种入100 mL NB液体培养基中，200 rpm 28℃振荡培养至菌液浓度达到OD600=0.7-1.0；

（4）无菌条件下，将培养好的菌液转移至冷却的50 mL灭菌的离心管中，4℃，5,000 rpm离心10 min，收集菌体，弃去上清液；

（5）先加入少量灭菌水，轻轻将离心管底部的菌落打散，然后再继续加入灭菌水，但不能超过离心管容积的2/3，第二次离心，弃上清；

（6）加预先冰浴的10%的灭菌甘油，重复步骤5一次，弃上清；

（7）加入4-5 mL的10%甘油，轻轻将菌体打散，在冰上分装至1.5 mL的离心管中（每管装入50 μL），制备好的黄单胞感受态细胞要尽快用于

转化，或者放置于-70℃保存备用。

1.15 水稻黄单胞菌的电转化法以及直接转化法

1.15.1 电转化法

（1）取-70℃保存的感受态细胞置于冰上待其细胞解冻，然后加入5 μL的质粒DNA，轻轻混匀，冰上放置1 min；

（2）将加入DNA后的感受态细胞转入到预冷的电击杯中，置于冰上；

（3）打开电转化仪，设置程序，若使用0.2 mm电击杯，则程序设置为Ec2（电压为2.5 kV），若使用0.1 mm电击杯，程序设置为Ec1（电压为

1.8 kV）；把装好感受态细胞的电击杯外壁擦干，放在接应器上，把接

应器推至电极之间；用手指按住电击键，听见“吱”声后放手；

（4）立即取出电脉冲杯并加入600 μL SOB液体培养基，混合均匀后将混合物吸出放回到灭菌EP管中，28℃，150-200 rpm振荡培养1.5-2 hr；

（5）10,000 rpm离心30 s，去上清，留100 μL左右培养液，用200 μL的移液枪吸打均匀后涂布在选择性NA平板（本实验使用的是NA+Km

平板）上，28℃培养3-5 d。

1.15.2 直接转化法（冷冻转化法）（戴雷, 1995）

（1）挑取PXO99A单菌落于10 ml NB液体培养基中，28℃200 rpm振荡培养

24 hr；

（2）吸取1 mL培养好的菌液接入到100 mL NB液体培养基中，28℃200 rpm振荡培养6-8 hr，使细菌达到对数生长期（菌液浓度达到

OD600=0.7-1.0）；

（3）5,000 rpm离心10 min，收集菌体；

（4）用10 mM Tris-HCl（pH 7.4）洗涤两次，并用2 mL该溶液悬浮菌体；

（5）吸取200 μL 10 mM Tris-HCl悬浮的菌液于1.5 mL EP管中，加入100 μL 待转化的质粒DNA（质粒DNA用NB液体培养基稀释至浓度为5 μg/mL左右），混合均匀，置于液氮中冷冻1 min；

（6）取出冷冻的样品，置于37℃水浴30 min；

（7）10,000 rpm离心30 s，去部分上清，留200 μL左右培养液，用移液枪吸打均匀后涂布在选择性NA平板上，28℃培养3-5 d。