拟南芥转化

拟南芥转化

1农杆菌感受态细胞的制备

挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于5 ml含100 μg/ml利福平(Rifampicin)，50 μg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 μg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 μl接种于50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 μl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。

2.质粒转化农杆菌GV3101

将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化(冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：

1) 从-80℃冰箱中取出GV3101 感受态细胞(100 μl)，置于冰上解冻；

2) 加入5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴5 min；

3) 液氮冷冻8 min；

4) 37℃水浴热激5 min；

5) 加入900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏；

6) 复苏结束后于4000 r/min 室温离心5 min；

7) 吸去800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；

8) 28℃倒置培养2 d 直至长出阳性菌落；

9) 挑取单克隆菌落，经LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落(液) PCR验证，以确认是否成功转化。经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。

（3拟南芥的转化

在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5

天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。

转化时将拟南芥的花序倒扣在盛有菌悬液的容器中，浸泡10-30秒，转化完毕后，将小花盆侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，12-24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，按照正常的方法培育植株至结实，收获成熟种子

将已经转化的Tl代成熟种子收取后，37℃烘干后准备阳性植株的筛选。由于表达载体带有除草剂抗性标记基因，所以用Basta(l:1(XX〕)进行阳性植株的筛选。将Tl代种子在消毒之后均匀撒播在培养土的表面，罩上盖子，当种子出苗后3天，打开盖子，在幼苗生长到2礴片真叶后，喷洒Basta筛选阳性植株。)

3拟南芥培养和转化

3.1 拟南芥培养

首先是拟南芥种子消毒，将待播拟南芥种子(每管100 μL) 分装于1.5 mLEppendorf 离心管中，每管加入1 mL 70%乙醇，振荡器上充分混匀，放置2 min，微型离心机上离心后，用 1 mL 枪头吸去乙醇，然后加入1 mL 10%NaClO，振荡器上充分混匀，放置15 min，期间每隔5 min 可以轻微振荡一次，可以提高消毒效果，离心后，弃上清，用无菌水冲洗5-6 次，并于超净台上吹干，即可播种。

将种子撒播于MS 固体培养基上，也可用45℃MS 固体培养基播种，方法是将种子和MS 固体培养基充分混匀，倾倒于预先铺一薄层MS 固体培养基平皿中，轻微晃动平皿，使种子均匀平铺在培养皿中。平皿用封口膜封好后在4℃暗处理3 d。

置于拟南芥培养室培养( 培养条件：湿度60%；温度22℃；光周期16 h 光/8 h 暗；光照强度80－220 μmol m-2 sec-1) 培养一周左右，然后将其移栽至栽培介质(草炭土：蛭石：珍珠岩按5：4：1 的比例掺匀)，第一次移栽要用0.1%“花无缺”复合肥溶液浇灌渗透。

3.2 拟南芥转化

拟南芥转化采用Clough 等发明的活体蘸花法(Floral-dip)。具体步骤如下：

1) 转化前菌体准备：

挑取平板上生长良好的阳性菌落，接种于20 mL LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基中，28℃，250 r/min 振荡培养过夜。吸取2 mL 培养液，加入50 mL LB/ (Gen + Kan+ Rif) 液体培养基，28℃，250 r/min 振荡培养至浓度为OD600 = 0.5-0.8，然后4500 r/min 离心收集菌体，用20 ml 拟南芥转化Buffer (2.2 g/L MS 粉+ 5g/L 蔗糖+ 6-BA (1 mg/mL) +0.04%SILWET-77 (v/v)，pH 5.8；蒸馏水配制，现配现用。) 悬浮。

2) 转化：

选取生长一个月左右、生长状况良好的植株，在转化前一周掐除顶端花序，使待转化植株产生更多的花蕾，在转化前一天浇足水。将拟南芥花序浸入事先准备好的转化Buffer 中，并轻微晃动，约3－5 sec 取出，轻轻弹去多余的液体，用保鲜膜将整棵植株密封，暗培养16-24

h 后，揭去保鲜膜，给予正常光照和水分，直至种子成熟，收获。

3.3转基因植株抗生素筛选

将所收获种子消毒(条件同上) 后，播于MS/hyg 固体培养基上。暗培养4℃冷处理3 d，转移移至拟南芥培养室培养，并给予正常光照和水分。约两周后，将绿色抗性幼苗移栽至栽培介质中继续生长。按单株收获转基因株系并挂牌标识，待种子成熟后继续筛选，直至得到纯合株系。