浅谈天然产物分离之柱层析

浅谈天然产物分离之柱层析

胡利红彭宣嘉

植物有效成分分离主要手段是柱色谱，其中包括：吸附性柱色谱；分配性柱色谱；离子交换柱色谱；凝胶过滤柱色谱；聚酰胺柱色谱以及大孔吸附树脂。

一、吸附性柱色谱

我们常用的以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱，即是吸附性柱色谱。本文重点介绍这种色谱方法。一般而言，氧化铝用于分离脂溶性成分，在天然产物中包括生物碱，甾体和挥发油等。而硅胶既可分离脂溶性成分，也可分离水溶性成分，根据需要可选用不同类型的硅胶，即正相硅胶或反相硅胶。

1、硅胶可以分为：正相色谱硅胶和键合相硅胶

正相色谱硅胶是我们在实验室经常接触的，它的使用范围非常广泛，一般极性和非极性的化合物都可以用于分离。硅胶的吸附能力取决于其结构中硅醇基的数目及含水量。一般硅胶中的含水量若超出12%，则其吸附力极若，只可作为分配色谱的载体。色谱硅胶应该是中性无色颗粒，由于在制备过程中接触强酸，常带有酸性，可用水洗至中性或用10%NaOH将其调至碱性，再在1100C下活化24小时用于来分离在酸性条件不稳定的化合物。有时也可向其中掺入某种试剂，改良吸附性能，提高分离效率。通常用硝酸银处理过的硅胶对不饱和烃类有很好的分离效果。

在键合相硅胶中，以C-18反相硅胶应用最为广泛，实验室中基本用的就是这种类型的反相材料，一般用于分离极性较大的化合物，可减少分离这类化合物时用正相硅胶吸附太大的缺点。在利用键合相硅胶进行反相色谱时，常用甲醇-水，乙醇-水或乙腈-水为洗脱剂。

2、柱子可以分为：加压，常压，减压

压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵。特别是在容易分解的样品的分离

中适用。

3、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好

柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，一般经验硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分Rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，也可以减小淋洗剂的极性等等。

4、关于湿法、干法上样

湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱，这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒。

5、溶剂的选择

当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了，不过因为极性很小，有时还是非它不可。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。

二、分配性柱层析

分配性柱层析主要是利用混合物在两相互不混溶中分配系数不同，而达到分离的一种柱层析方法。分配系数差异愈大，分离效果愈好。支持剂包括硅胶、硅藻土、纤维粉等，像上文中提过的硅胶中含水量超出12%就可用于分配色谱了，这种柱层析在实验室中并不常用。

三、离子交换柱层析

离子交换柱层析的原理是利用大分子树脂网状结构内存在的交换基团而进行的交换性柱层析方法。多用于分离植物中在水中具有一定溶解性的酸，碱及两性成分。影响离子交换的因素包括pH值，欲交换化合物的性质，欲交换化合物的浓度，温度，交换溶剂，交换流速，树脂用量等。

四、凝胶柱层析（Sephadex LH-20）

由葡聚糖凝胶Sephadex G-25交联亲脂性羟丙基而制备，是同时具备吸附层析、分配色谱和分子筛功能的独特层析介质，溶剂系统没有限制，包括水相缓冲液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和各种混合溶剂，大量文献证明它非常适合于天然产物纯化，特别是中草药有效成分如甙类、生物碱、黄酮、蒽醌、内酯、帖类、甾类、多酚的分离。其原理类似分子筛，分子的大小和形状吸附层析，被分离化合物与凝胶间的氢键分配层析，被分离化合物在流动相（溶剂）和固定相（凝胶）之间的分配等对分离都有一定影响。

在实验室中常用的型号是Sephadex LH-20可用于植物成分的粗分或是最后产物的精制。下面介绍一下常用的技巧。在装柱时是洗脱剂溶胀后悬浮液搅拌装柱，而一般用于凝胶柱层析分离的柱子也是细长的，需特制，比一般硅胶柱所用的柱子要长，一般一米左右的长柱可分离的样品量为50mg。上样时只需将要分离的样品溶于尽量少的适宜溶剂中湿法上样即可。洗脱剂选择主要取决于化合物的溶解性，如水溶性好的可用水或电解质溶液；水溶性差的可选用醇水或丙酮水体系，而极性较小可用丙酮、氯仿等。在实验室中最常用的就是丙酮、氯仿柱，若化合物在丙酮中溶解性好，就将样品溶于该溶剂中，上样后用丙酮常压洗脱即可。

例如，Sephadex LH-20层析成功了分离日本附子里的乌头碱，银杏黄酮甙，夏枯草中的夏枯草黄酮苷、皂苷，升麻中的酰胺苷，水蔓菁中的水蔓菁萜苷，鹿衔草中的鹿蹄草苷，淫羊霍中的羊霍苷，多种中草药中的芦丁芸香苷，红花中的槲皮素、芦丁、山柰酚、红色素等多种黄酮，麦冬中的麦冬黄酮，鹿蹄草中的儿茶素，紫草中的萘醌、多酚。

五、聚酰胺（Polyamide）柱色谱

聚酰胺柱色谱基本原理是氢键吸附原理，其是由酰胺键聚合而成的一类高分子化