COS7细胞冻存和复苏传代培养
COS7细胞冻存和复苏传代培养
02
cos7细胞特性
cos7细胞的来源和特点
起源
cos7细胞来源于非洲绿猴的肾脏上皮 细胞，通过将SV40病毒转染而获得。
特点
cos7细胞具有无限增殖能力，常用于 基因表达和蛋白质生产等研究领域。
cos7细胞的应用领域
基因表达
cos7细胞是研究基因表达和蛋白质功能的常用工具，可 以通过转染技术将外源基因导入细胞，进行基因表达分析 和蛋白质表达纯化等实验。
细胞冻存操作步骤
细胞计数
重新调整细胞浓度为适合冻存 的密度。
细胞分装
将细胞悬液分装至冻存管中， 每管1~2ml。
标记冻存管
记录冻存日期、细胞种类等信 息，贴上标签。
冻存
将冻存管放入-80℃冰箱中，24 小时后转至液氮罐中保存。
04
cos7细胞复苏传代培养
细胞复苏前的准备
准备所需试剂
确保有足够的细胞培养基、胎牛血清、双抗 等细胞复苏所需的试剂。
加强与其他实验室的合作，共同开展 细胞冻存和复苏技术的交流与合作， 推动相关领域的发展。
THANKS
感谢观看
通过连续监测细胞的生长情况，绘制出cos7细胞的生长曲线。结果显示，经过 冻存和复苏的细胞在接种后的潜伏期、对数生长期和平台期均与对照组相似， 没有出现延迟或加速生长的现象。
细胞活力的测定
总结词
细胞活力测定结果显示，经过冻存和复苏后的cos7细胞活力较高，与对照组相比无显 著差异。
详细描述
采用MTT法测定细胞的相对活力，结果显示经过冻存和复苏的cos7细胞的相对活力为 95%左右，与对照组的98%相比虽略有降低，但差异不显著。这表明细胞的代谢活性
离心收集细胞
将消化后的细胞离心收集，去除 上清液。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养传代及冻存操作规程细胞培养、传代及冻存操作规程⼀、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊⼦、温⽔（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%⾎清、双抗、1.5ml 离⼼管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放⼊到培养板中并加⼊双抗，放⼊CO2培养箱中预热，然后取适量的冷⽔加⼊到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开⽔边⽤温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升⾄39℃为⽌（为防⽌在移动过程中温度降低可把温度调⾼1——2℃。
②⽤镊⼦将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放⼊提前准备好的温⽔中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后⽤移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液⼀起吸出放到1.5ml离⼼管中，5000rpm/min 离⼼2min，尽量的除掉上清，然后在加⼊500µl培养基反复吹打待混合均匀后放⼊到事先准备好的培养板中并注明名称、⽇期及操作⼈。
⼆、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加⼊相应体积的培养基之后放⼊培养箱中预热，添加培养基的⽅法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，⽤DPBS清洗两遍，在加⼊相应体积的0.25％胰蛋⽩酶，使板底细胞都浸⼊溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋⽩酶的体积如下表所⽰③消化时间完成后应⽴即终⽌消化，⼀是直接加⼊培养基，⼆是吸除胰蛋⽩酶之后在加培养基，加⼊培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停⽌吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放⼊培养箱24⼩时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的⽣长状态，以便于下⼀步实验的顺利进⾏。
其中有两点很重要，第⼀消化的时间，消化的时间并不是⼀成不变的，要根据细胞的状态随时终⽌消化，上⾯②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第⼆吹打的⼒度跟全⾯性，吹打的⼒度⼀定要适中，不能太⽤⼒避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边⾓的，那⾥会有很多细胞残留，需要提醒的是⼀定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可⽤枪头将其刮下在吹打。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。
紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。
然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心3分钟。
弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。
贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。
2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。
3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。
可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。
4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。
5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。
6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。
首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。
7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。
细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。
细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。
而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。
细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。
2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。
3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。
一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。
4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。
最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。
细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。
在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。
原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。
通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。
原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。
传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。
在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。
传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。
在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。
冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。
冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。
冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。
## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。
推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。
如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。
正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。
在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。
COS7细胞冻存和复苏传代培养
复苏操作步骤
从液氮罐或-80°C冰 箱中取出冻存的COS7 细胞，迅速放入37°C 水浴锅中，轻轻摇动 冻存管，使其在1分钟 内快速解冻。
在生物安全柜内打开 冻存管，将细胞悬液 转移至预先准备好的 离心管中，加入5倍体 积的完全培养基，轻 轻吹打混匀。
将离心管放入离心机 中，以1000rpm的速 度离心5分钟，弃去上 清液，法
我们采用胰蛋白酶消化法进行COS7细胞的传代培养。在细胞生长至80%汇合度时，弃去培养基，加入胰蛋白酶消化 液进行消化，然后加入新的培养基终止消化并将细胞吹打均匀。
传代后细胞生长情况
传代后的COS7细胞在培养箱中继续培养，观察发现细胞生长迅速，形态正常，折光性好。
传代后细胞增殖能力
细胞复苏
将冻存的COS7细胞复苏 ，恢复其生长和繁殖能力 ，以便进行后续实验。
传代培养
通过传代培养技术，将 COS7细胞进行扩增，以 获得足够的细胞数量用于 实验。
细胞培养的重要性
基础研究
COS7细胞是一种常用的 细胞系，广泛用于生物 学、医学等领域的基础
研究。
药物研发
COS7细胞可用于药物筛 选和药效评价，为新药
分装与标记
将细胞悬液分装至冻存管中， 每管1-1.5ml，标明细胞名称 、冻存日期等信息。
细胞消化
去除旧培养基，用PBS清洗细 胞，加入适量胰蛋白酶消化细 胞。
冻存液加入
将预先配制好的冻存液逐滴加 入细胞悬液中，边加边轻轻摇 晃。
程序降温
将冻存管放入程序降温盒中， -80℃冰箱过夜，次日转入液 氮罐中长期保存。
冻存后的保存与管理
液氮罐管理
定期检查液氮罐中液氮量，确保 细胞在低温环境下保存。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)
例如,配制1000ml的5%的稀盐酸,150ml的浓HCL加850ml的蒸馏水即 可。
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细胞计数
方法
吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和 计数板之间。 静置三分钟 镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数/ml= 四大格细胞总数/4 ×104个
细胞培养
1
一 原代培养（略）
2
二. 传 代 培 养
准备及注意事项 换液 传代 冻存 复苏 MTT
3
准备事项
1. 紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分 钟后方可进入实验室.
2. 穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 3. 带手套,并用酒精擦拭之. 4. 准备好实验必需用品. 5. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 6. 超净工作台内操作完成后，
20
RPMI1640培养基的配制：
1. 取一小袋1640培养粉，加高压过的三蒸水800ml， 在1000ml的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解；
2. 加碳酸氢钠2.0g，再加三蒸水定容至1000ml； 3. 加青霉素(100U/ml) ，链霉素（100µg/ml）； 4. 在超净工作台内过滤除菌，分装成180ml，-
15
MTT法
1.实验开始前，96孔板应在超净台紫外灯下照 射2个小时以上。
2.从培养箱中拿出培养瓶，观察，加PBS，加 胰酶消化，加培养基，计数。
（方法及步骤同传代1-13步。）
3.加培养基，调整细胞浓度为10000个/200µl.
4.加到96孔板内,每板6行8列共48孔,每孔
200µl.
5.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微
4. 取出器皿，高压后，放烤箱上层，再次烘 干即可使用。
步骤不能再精细！细胞复苏、传代及冻存
步骤不能再精细！细胞复苏、传代及冻存细胞复苏、传代及冻存实验步骤:一复苏传代（ 1）准备无菌超净台，酒精灯，75%酒精喷壶，CO2培养箱，37℃水浴锅，离心机；培养瓶，含10%胎牛血清的完全培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液（提前放置超净台使平衡到室温），无菌工作服（白大褂），口罩，手套，记号笔（2）步骤1穿好无菌工作服，带上口罩和手套，快速从液氮里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻，注意冻存管的封口膜不要破裂，防止污染。
2 解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴，酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。
3 开超净台，点燃酒精灯燃烧片刻后（可提前准备），冻存管放超净台，换新手套，小心打开冻存管，避免污染，无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管，补加9ml基础培养基稀释，1000rpm，离心5min使细胞沉淀，弃上清。
4 加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml，轻轻混匀，用吸管将细胞移至25T培养瓶。
5平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。
6培养24小时后，显微镜观察细胞（贴壁细胞）贴壁后，小心更换培养基，继续培养，根据不同细胞的生长状态进行传代培养，培养瓶上标记：操作者，时间，细胞类型。
7有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染，但是这对于掌握细胞培养是非常不利的，不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。
一旦细胞出现污染，易于发现，一旦发现污染的细胞应立刻煮沸丢弃，以免污染同实验室其他细胞。
8细胞长满90%-100%即可传代，小心打开培养瓶，瓶口过酒精灯消毒，弃培养基。
9加入1mlPBS，润洗细胞，重复3次，弃PBS。
10加入4ml完全培养基，用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。
11转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶，各瓶补加完全培养基至4ml。
12小心封口，平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)
9.盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。
注意：
1.打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。
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传代
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在
3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。
4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；
5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将 塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。
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6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。
4. 取下盖子,烧瓶口;倒掉培养基,烧瓶口;
5. 拿出PBS液瓶子,烧瓶口和镊子;用镊子将 塞子取出,烧瓶口（至少10圈）。
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6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口， 来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。
7.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出， 烧瓶口（至少10圈）。
11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。
12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。
13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内， 用吸管吹打成单个细胞悬液。计数，分装 即可。
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冻存
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；
2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。
具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。
2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。
消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。
3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。
根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。
离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。
4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。
放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。
注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。
-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。
-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。
冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。
具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。
对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。
2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。
将冻存液预暖。
3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。
用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。
4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。
等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。
注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。
-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。
-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。
复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。
具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。
干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项
干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备：●细胞培养通风橱（即生物安全柜）●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）●离心机●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项:●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。
●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。
●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。
●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。
二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。
b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。
c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。
d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。
细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。
b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
（二）细胞传代培养具体操作1、细胞：贴壁细胞株2、操作步骤1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。
随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml 培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。
一般室温消化时间约为1-3分钟。
4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。
第二天观察贴壁生长情况。
细胞冻存1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。
3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。
吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。
4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。
5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。
细胞复苏1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。
细胞传代冻存复苏步骤
细胞传代冻存复苏步骤1.细胞培养首先，需要从细胞库中取出要冻存的细胞，并将其接种在适当的培养基上。
培养基应该包含适当的营养物质和生长因子，以确保细胞的正常生长和分裂。
2.细胞生长将培养皿置于恒温培养箱中，维持适当的温度、湿度和气体环境。
细胞需要在培养基中适当的时间内生长和扩增。
通常，培养时间为2-3天，视细胞类型而定。
3.细胞检查在细胞生长期间，必须定期对细胞进行检查，以确保其健康和无污染。
细胞检查可通过显微镜观察细胞形态和活力，或通过细胞培养基中的染料检测细胞活性。
4.细胞分离一旦细胞达到所需的数量，即可进行细胞分离。
使用适当的胰蛋白酶或其他消化酶来分离细胞。
细胞分离后，将其转移至新的培养皿中。
5.细胞计数使用血细胞计数板或其他形式的计数器来计数细胞数目。
细胞计数是决定细胞数量和密度的重要步骤，以确保在冻存过程中使用适当的细胞浓度。
6.冻存液制备冻存液是保护细胞冻存过程中的关键溶液。
常见的冻存液成分包括培养基和甘油、DMSO（二甲基亚砜）等保护剂。
这些成分具有保护细胞免受冻结和解冻过程中的损伤的作用。
7.细胞冻存将细胞和冻存液混合在一起，使用冷冻管或冻存管将其分装。
然后将冻存管放入冷冻容器中，使其逐渐冷却至极低温（通常为-80℃或液氮温度）。
8.细胞解冻在需要复苏细胞时，从冷冻容器中取出冻存管，快速解冻至37℃。
解冻时应非常小心，以免损伤或破坏细胞。
可选择将冻存管置于37℃水浴中解冻，或使用预先加热的介质进行解冻。
9.细胞复苏一旦细胞完全解冻，将其迅速转移到预先准备好的培养皿中。
加入适量的培养基和生长因子，为细胞提供所需的营养和环境条件。
将培养皿放入恒温培养箱中，并维持适当的生长条件。
10.细胞生长观察在细胞复苏后，定期观察细胞的生长和活性。
使用显微镜观察细胞形态和增殖情况，确保细胞正常生长。
如果发现任何细胞死亡或异常现象，可能需要采取相应的措施来解决。
11.细胞传代一旦细胞复苏并正常生长，可以进行细胞传代以扩增细胞数量。
细胞复苏、传代、冻存过程
细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。
细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。
下面将详细讨论这些过程。
细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。
2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。
3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。
4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。
5.定期观察细胞的生长情况。
细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。
3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。
4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。
5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。
冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。
3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。
4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。
5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。
6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。
7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。
细胞复苏、传代、冻存
细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。
3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。
细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。
2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。
1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。
3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。
细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。
细胞复苏,传代与冻存
一、目的：掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。
二、原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
三、步骤：（一）材料准备：1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。
2. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。
3. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。
4. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。
（二）细胞复苏步骤：1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。
3.离心，1 000 rpm，5 min。
4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。
5.次日更换一次培养液，继续培养。
四、注意事项：1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。
一、目的：学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。
二、原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞冻存、复苏及传代
细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。
细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。
4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。
细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。
2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。
3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。
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二 结果
1 复苏细胞：第1d,镜下观察复苏细 胞悬浮于培养液中 , 折光性强 , 胞体呈圆 形。第2d,复苏细胞镜下观察细胞大部分 贴壁。第3d,复苏细胞镜下观察细胞增殖 速度较快，折光性好。 5d 后可按比例传 代。
2 传代细胞：第1d,镜下观察传代细胞悬 浮于培养液中 , 折光性强 , 胞体呈圆形。 第2d,中,传代细胞镜下观察细胞已贴壁 , 折光性好 , 少数细胞出现伪足。第 3d, 传 代细胞培养液镜下观察大部分细胞已伸 出伪足,细胞轮廓清楚,折光性强,细胞数 量明显增多。
（一）实验材料 1 细胞株 cos7细胞株 2 试剂 RPMI-1640培养基‚小牛血清（NBS）‚N(2-羟乙基)-哌嗪-Ng-2（丙磺顺酸） （Hepes，Sigma公司产品）胰蛋白酶‚碳 酸氢钠以及链霉素和青霉素 3 实验准备
1 培养液的配置 1 (1) RPMI-1640液：1640粉2袋‚Hepes 2.14g‚碳酸氢钠4.0g加水至2000ml调至 PH=7.15，过滤。 1 (2) 1640完全培养液：10％小牛血清＋ 双抗（含链霉素、青霉素）的1640培养液， 4℃保存。 1 (3) 10%DMSO冻存液的配置：1份DMSO‚3 份小牛血清‚6份完全培养基 1 (4) 胰蛋白酶1.25g‚EDTA（乙二胺四乙 酸二钠）0.10g‚于烧杯中先用少许PBS调成 糊状，再补充PBS至500ml，搅拌混匀4小时 后用滤器过滤除菌，分装，低温保存。
7 本 室 探 讨 了 37℃ 、 CO2 条 件 为 培 养 Cos7 细胞的适宜环境。因为刚复苏细胞 增殖缓慢,自身调节pH的能力差的缘故， 显示复苏细胞要在 37℃、 5 ％ CO2 条件下 培养才能顺利传代并保持较好的生长状 态
参考文献 1 Gluzman Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell,1981,23:175～182. 2 Sambrook J, Fristch E F, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor, NY,1989 3 中山大学中山医学院分子医学研究中心. 常用细胞生物学试验技术原理 . 分子医学实验 技术培训班实验讲义 4 刘耳等，中国畜禽传染病，1989，6，45 5 马翠玲,李志强等,胰蛋白酶预处理在人角 质形成细胞传代培养中的应用. 第四军医大学 学报(JFourthMilMedUniv)2001;22(2)：177
6 cos7细胞生长分为3期：延缓期、增殖期和 停滞期.首次传代一般在Cos7细胞增殖早期,此 时细胞刚刚度过延缓期 ,脆弱易损,首次传代对 于 Cos7 细 胞 是 否 能 长 期 存 活 尤 为 重 要 . 而 在 Cos7细胞增殖后期,细胞贴壁紧密,消化时间不 足,细胞不易从瓶壁脱落,不仅传代细胞数量少, 影响实验的准确性 , 而且由于局部代谢物的积 累 , 细胞即进入停滞期 , 若消化时间过长 , 待细 胞完全从瓶壁脱落 ,则细胞膜已受损 ,死细胞增 多.胰蛋白酶是常用的消化液 ,可使细胞脱离附 着物表面和相互离散成单个细胞 , 但胰蛋白酶 对细胞也有损伤可影响细胞活性 [5]. 本文建议 采用0.25%胰蛋白酶在37℃,消化2min的参数。 这是因为在 37℃下胰蛋白酶活性最大 , 所需消 化时间最短 , 可避免胰蛋白酶长时间作用于细 胞造成细胞的损失。
3 Cos7细胞复苏 3 （1） 将加有小牛血清＋双抗的1640完全培 养液从冰箱取出，升至室温。 3 （2） 从液氮中取出冻存管，迅速投入 3738℃水浴中，摇晃使其在1分钟左右融化。 3 （3） 转至EP管，加1640完全培养液至1.5 ml左右，吹打，1200转/min，离心3分钟。 3 （4） 去上清，再加1640完全培养液至1.5 ml左右漂洗，离心3分钟。去上清，加新鲜培 养液吹打重悬浮细胞，转至培养瓶中加培养液 至总体积约4ml.，置温箱培养。
2 培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培 养，否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度 过大，导致营养不良而引起细胞衰老¸ 停止生长 ¸ 甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须 进行稀释再培养，即将培养瓶内的细胞分离¸ 稀 释¸ 接种到新培养瓶内继续扩大培养。首次传代 的细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新环 境，以利于细胞的生存和增殖，通常原代细胞 按1：2分种传代，细胞株按1：4分种传代
COS7细胞冻存和复苏传代培养 郭美琼
指导老师 陆家海 欧阳丽萍
研究目的
建立CoS-7细胞培养的方法 观察COS－7细胞培养的特点 了解COS－7细胞的用途
建立CoS-7细胞培养的方法
主要阐述CoS-7细胞培养的体系
观察COS－7细胞培养的特点
是贴壁细胞还是悬浮细胞？细胞培养过 程中形态的变化，分裂生长的形式等
3 传代细胞传至第6～8代仍保持增殖 状态，细胞生长速度未见减慢,能长满瓶 底。
三 讨论
1 养细胞维持传代以供实验用常遇到某 些困难。首先，细胞株在传代中其性质 发生变化。其次，在传代中有微生物污 染的危险。解决这些困难的办法就是将 细胞冻存。细胞冻存在液氮中，贮存时 间几乎是无限的（因为在-130℃以下， 所有的生化反应已停止，而液氮的温度 在-150～-160℃之间）
4 Cos7细胞传代 4 （1） 弃掉培养瓶内原来的培养液，加入5～ 7滴，轻轻转动培养瓶，让胰蛋白酶浸匀整个瓶 底，吸出胰蛋白酶。 4 （2） 再加入8～10滴0.25%胰蛋白酶，将培 养瓶置37℃、5％CO2孵箱2～3min，观察细胞胞 体回缩变圆,细胞接近脱离瓶壁时终止消化。 4 （3） 小心吸出并弃去胰酶，加入1～ 2ml1640完全培养液，用吸管吹打细胞，制成细 胞悬液，1∶4传代。各瓶加入培养液2ml，放入 37℃、5％CO2培养箱继续培养。
2 Cos7细胞冻存方法 2 （1） 取对数生长期的细胞，收集细胞前换液 一次。 2 （2） Cos7细胞培养物经胰蛋白酶消化后制成 细胞悬液，1200转/分离心1分钟，去上清。弹指 法分散沉淀细胞后，左手摇动离心管，右手逐滴 加入与细胞悬液等量的DMSO冻存液。 2 （3） 分装：细胞悬液分装在2 ml 冷冻管中， 密封后标记细胞名称和冷冻日期。 2 （4） 梯度降温冻存：冷冻管置-20℃、停留 1～2小时，再降至－70℃过夜，投入液氮。
5 细胞冻存复苏的基本原则是慢冻速融 ,可最大限度 的保存细胞活力。细胞直接冻存时 , 细胞内外的水分 会很快形成冰晶 , 引起一系列不良反应。因而在冻存 时尽可能地减少细胞内水分及冰晶形成 , 是保护细胞 减少损伤的关键。目前多采用甘油和二甲基亚砜 （DMSO）作保护剂,它们对细胞无明显毒性,分子量小, 溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降。通过缓慢冷 冻,使细胞内水分尽可能多的渗出细胞外 ,减少细胞内 冰晶形成。而复苏细胞时,采用快速融化,可保证细胞 外结晶在很短时间内融化 , 避免缓慢融化使水分渗入 细胞内形成细胞内再结晶。在本实验中 , 我们用二甲 基亚砜作保护剂 , 经过两个低温梯度、过夜后移入液 氮 ; 融化复苏时在 37℃、 2 分钟内完成 , 对细胞未造成 明显损伤 , 复苏后细胞存活率可达 90%, 细胞形态、生 长速率与未冻存细胞相比,未见明显差异
3 实验需严格遵守无菌操作规则，以减 少操作引起的污染。一切操作，都要在 火焰周围进行，瓶口、吸管等要经过火 焰消毒。但用于吸取细胞培养液、小牛 血清、酶液的吸管使用后不能在火焰上 消毒，因为残留在吸管中的培养液烧焦 炭化，再使用时会把有害炭化物带入培 养液中毒害细胞。
4 实验完毕，关闭超净台鼓风机和电源， 未使用器材放入饭盒内，用过的玻璃器 材投入清水中浸泡，用酒精棉球擦拭工 作台面。可减少培养液被微生物污染。
了解7细胞的用途
COS-7细胞的来源、特性及生命医学用途：
小结
COS7细胞(猴细胞的一种细胞系)为重组病毒 的宿主细胞，是表达 SV40 大 T 抗原的非洲绿 猴肾细胞株，能支持部分突变型 SV40 和含 SV40 ori 的质粒载体的复制 , 可高水平表达 外源基因，常作为瞬时表达宿主。故本实验 建立COS7细胞的冻存和复苏传代方法。