细胞复苏、传代、冻存过程

一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）

进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。

1.细胞培养液的配制：

配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）

2.细胞复苏：

将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm, 离心3分钟。弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。）

3.细胞换液：

复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀，用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml 无菌的离心管中，1000rpm,3分钟去上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

4.细胞传代：

当细胞生长到80%-90%时，其的生长状态和细胞形态都比较好时，即只要判断细胞处于生长对数期，这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml %胰酶消化，放入孵箱，1-2分钟后取出，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时，喷上75%的乙醇，拿到超净台里，加入2ml培养基终止消化，用1ml无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打，尽量使

更多的细胞掉下来，吹打数次后转入15ml无菌的离心管，1000rpm,3分钟，然后弃去上清，一般细胞的传代比例为1传2或者1传3，如果要是1传2就用2ml新鲜培养基重悬，分别将重悬好的细胞分到2个T25瓶内，然后各取4ml新鲜培养基补齐。如果是1传3就用3ml 新鲜培养基重悬，分别将重悬好的细胞分到3个T25瓶内，然后各取4ml新鲜培养基补齐。喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下：将培养瓶内的培养液混匀，用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml无菌的离心管中，1000rpm,3分钟去上清，加入2ml或者3ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬，分别将重悬好的细胞分到2个或3个T25瓶内，然后各取4ml新鲜培养基补齐，喷上75%的乙醇，放入37℃5%CO2的孵箱内。

5.细胞冻存

当细胞生长到80%-90%时，其的生长状态和细胞形态都比较好时，即只要判断细胞处于生长对数期，这时就可以进行细胞冻存了。先按胎牛血清和二甲基亚砜（DMSO）为9:1的比例配细胞冻存液。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS 冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml %胰酶消化，放入孵箱，1-2分钟后取出，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时，喷上75%的乙醇，拿到超净台里，加入2ml培养基终止消化，用1ml无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打，尽量使更多的细胞掉下来，吹打数次后转入15ml无菌的离心管，1000rpm,3分钟，然后弃去上清，一般细胞的冻存比例为1冻1或者1冻2，如果要是1传1就用1ml新鲜配制的细胞冻存液重悬，将重悬好的细胞转移至准备好无菌的细胞冻存管内，然后用封口膜和美仑纸将瓶口包好。如果是1传2就用2ml 新鲜配制的细胞冻存液重悬，分别将重悬好的细胞分到2个准备好无菌的细胞冻存管内，然后用封口膜和美仑纸将瓶口包好。4℃ 30分钟，-20℃ 1小时，-80℃过夜然后转入液氮保存。悬浮生长的细胞具体过程如下：将培养瓶内的培养液混匀，用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml无菌的离心管中，1000rpm,3分钟去上清，加入1ml或者2ml新鲜配制的细胞冻存液使沉淀的细胞重悬，分别将重悬好的细胞转移至到1个或2个准备好无菌的细胞冻存管内，然后用封口膜和美仑纸将瓶口包好。4℃ 30分钟，-20℃ 1小时，-80℃过夜然后转入液氮保存。