细胞冻存与复苏-注意事项
实验十一、细胞的冻存与复苏
实验十一、细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。
该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。
本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。
实验步骤：1. 细胞的收集和分装首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。
然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。
注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。
2. 冷冻将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。
然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。
3. 冻存的解除和复苏在复苏前，需要进行以下步骤：① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。
② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。
然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。
注意事项：1. 冷冻剂的熟练使用DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。
然而，DMSO也具有一定的毒性。
因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。
2. 细胞处理的无菌性细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。
在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。
3. 冷冻剂和液氮的注意事项冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。
在操作过程中，需要戴上手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。
同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的泄漏。
总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。
如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。
细胞学堂细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与细胞复苏，是细胞培养过程中的常见工作。
细胞冻存，是指将细胞贮存在超低温环境中，使细胞暂时“冬眠”的技术，在需要的时候再进行复苏。
细胞复苏，是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻，并使细胞重新恢复生长的技术。
本文将为大家介绍细胞冻存与复苏的技术要点和操作步骤。
细胞冻存篇冻存原则细胞冻存原则为“慢冻”，即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。
如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻，细胞会受到冷冻损伤而死亡。
在冻存液中添加的保护剂（如DMSO、甘油）和在冻存盒中添加的异丙醇，都起到程序性降温的作用。
DMSO使用注意事项DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。
需注意的是，DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。
另外，DMSO属于致癌物质，使用时应戴好手套，规范操作。
程序冻存液配方程序冻存液成分一般由基础培养基、胎牛血清、DMSO组成。
血清比例为10%~90%，DMSO比例为5%~10%。
根据普诺赛实验室细胞培养经验，推荐冻存液配比：55%基础培养基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，难养细胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO冻存。
细胞冻存密度细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。
提高冻存密度有助于提升细胞复苏存活率，推荐密度为100~300万细胞/mL。
冻存操作方法方法一：使用程序冻存盒使用程序降温盒是最常用的冻存方法。
市面上的降温盒有些需要添加异丙醇，有些则不需要。
降温盒须恢复室温后再使用。
根据普诺赛实验室细胞培养经验，使用程序冻存盒冻存效果良好，没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。
操作步骤步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~1.5mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记步骤4：冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱过夜（24h）步骤5：冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存▲ 使用冻存盒操作示意图方法二：使用无血清非程序冻存液无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液，无需自己配制，无需降温盒，大大提升了便捷性。
细胞生物操作规程(3篇)
第1篇一、引言细胞生物学实验是现代生物学研究的重要手段之一。
为了确保实验结果的准确性和可靠性，特制定本操作规程。
本规程适用于所有进行细胞生物学实验的人员。
二、实验前准备1. 实验室环境：实验室应保持整洁、安静、通风良好，实验台面清洁，无菌操作区域明确。
2. 实验材料：根据实验需求准备相应的细胞、试剂、仪器等，确保材料质量合格。
3. 实验设备：检查实验设备是否正常，如显微镜、离心机、培养箱、净化工作台等。
4. 实验操作人员：实验操作人员应具备一定的细胞生物学实验技能，熟悉实验操作规程。
三、细胞培养1. 细胞复苏：将冻存的细胞按照细胞冻存和复苏标准操作规程进行复苏。
2. 细胞传代：根据细胞生长状态，定期进行细胞传代。
传代过程中，注意无菌操作，避免污染。
3. 细胞培养条件：保持细胞培养箱温度、湿度、CO2浓度等参数稳定，确保细胞生长良好。
4. 细胞观察：定期观察细胞生长状态，如细胞形态、密度等，必要时进行拍照记录。
四、细胞染色与观察1. 细胞染色：根据实验需求，选择合适的染色方法对细胞进行染色。
2. 显微镜观察：使用显微镜观察染色后的细胞，注意调整光圈、焦距等参数，确保观察效果。
3. 图像采集：使用图像采集系统对细胞进行拍照，记录实验结果。
五、细胞分离与纯化1. 细胞分离：根据实验需求，采用酶消化、离心等方法分离细胞。
2. 细胞纯化：通过流式细胞术、磁珠分离等方法对分离的细胞进行纯化。
六、细胞转染与表达1. 细胞转染：根据实验需求，选择合适的转染方法对细胞进行转染。
2. 转染效率检测：通过荧光素酶报告基因、荧光显微镜等方法检测转染效率。
3. 基因表达分析：通过RT-qPCR、Western blot等方法检测转染细胞的基因表达水平。
七、实验记录与报告1. 实验记录：详细记录实验过程、操作步骤、结果等，确保实验数据的真实性。
2. 实验报告：整理实验结果，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果、讨论等。
八、实验安全与环保1. 生物安全：严格遵守生物安全操作规程，避免生物危害。
细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则细胞冻存和复苏是一种先进的技术，可以将细胞保存在极低温下，并在需要时重新复苏。
它在医学和科学研究领域有着广泛的应用，包括细胞治疗、尸体保存和生物研究等。
然而，细胞冻存和复苏并不是一件简单的事情，它涉及到许多原则和技术。
本文将介绍细胞冻存和复苏的原则和一些常见的方法。
细胞冻存的原则主要包括细胞处理、冷冻保护剂和冷冻过程等。
1.细胞处理：在冻存细胞之前，需要进行适当的处理。
首先，需要确保细胞的纯度和活力。
通常使用细胞培养的方法，将细胞培养至富有生长活力的阶段，然后进行冷冻。
同时，还需要对细胞进行适当的处理，如细胞除膜、固定细胞骨架等，以增加细胞的抵抗力。
2.冷冻保护剂：冷冻保护剂是一种在冷冻过程中起到保护细胞的作用的物质。
常见的冷冻保护剂包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）和微生物发酵的液体。
这些保护剂可以减少细胞在冷冻过程中的损伤，防止冰晶的形成，从而保证细胞的完整性和功能。
在添加保护剂时，通常需要控制浓度和时间，以避免对细胞的毒性。
3.冷冻过程：冷冻过程是细胞冻存的核心环节。
一般来说，冷冻过程需要经历冷冻速率的调控、冷冻温度的选择和冷冻存储条件的维护等步骤。
细胞的冷冻速率是决定细胞成活率的一个重要因素，过快或过慢的冷冻速率都会导致细胞死亡。
冷冻温度的选择也非常重要，通常选择深度冷冻，即将细胞冰冻至极低温下，以防止细胞的新陈代谢和生物活动。
冷冻存储条件的维护是确保细胞冷冻的安全和稳定性的关键，包括低温保存、无菌保存和无氧保存等。
细胞复苏的原则主要包括解冻过程和恢复过程等。
1.解冻过程：解冻过程是将冷冻细胞重新回温至正常温度的过程。
在解冻过程中，需要控制解冻速率和解冻温度，以避免细胞的损伤。
解冻速率过快或温度过高都会导致冰晶的形成和细胞的破坏。
因此，解冻过程需要缓慢而温和，可以通过温水浴、离心和悬液稀释等方法进行。
2.恢复过程：细胞在解冻后需要进行恢复过程，以恢复其正常的生理和生化功能。
细胞冻存和复苏
细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。
细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
冻存和复苏的原则冻存细胞的理论基础当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
细胞冻存方法预先配制冻存液：20%血清培养基10%DMSO （二甲基亚砜）取对数生长期细胞1ml于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106—5×106细胞/ml)，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
慢冻程序标准程序（放哪里？）当温度在-25 ℃以上时，1-2 ℃/min当温度达-25 ℃以下时，5-10℃/min当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中简易程序将冻存管于4℃放置1小时，于-20℃放置1小时，通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70℃），放置1小时，后直接投入液氮中（-196℃）细胞复苏方法从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）注意防护（冻存管爆炸）！5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上低速离心10分钟去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
注意事项：在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。
高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。
在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)
例如,配制1000ml的5%的稀盐酸,150ml的浓HCL加850ml的蒸馏水即 可。
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细胞计数
方法
吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和 计数板之间。 静置三分钟 镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数/ml= 四大格细胞总数/4 ×104个
细胞培养
1
一 原代培养（略）
2
二. 传 代 培 养
准备及注意事项 换液 传代 冻存 复苏 MTT
3
准备事项
1. 紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分 钟后方可进入实验室.
2. 穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 3. 带手套,并用酒精擦拭之. 4. 准备好实验必需用品. 5. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 6. 超净工作台内操作完成后，
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RPMI1640培养基的配制：
1. 取一小袋1640培养粉，加高压过的三蒸水800ml， 在1000ml的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解；
2. 加碳酸氢钠2.0g，再加三蒸水定容至1000ml； 3. 加青霉素(100U/ml) ，链霉素（100µg/ml）； 4. 在超净工作台内过滤除菌，分装成180ml，-
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MTT法
1.实验开始前，96孔板应在超净台紫外灯下照 射2个小时以上。
2.从培养箱中拿出培养瓶，观察，加PBS，加 胰酶消化，加培养基，计数。
（方法及步骤同传代1-13步。）
3.加培养基，调整细胞浓度为10000个/200µl.
4.加到96孔板内,每板6行8列共48孔,每孔
200µl.
5.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微
4. 取出器皿，高压后，放烤箱上层，再次烘 干即可使用。
简述细胞复苏流程与注意事项
简述细胞复苏流程与注意事项
细胞复苏流程：
1、将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37°C的水浴中进行融化，轻柔晃动，加速融化，直到小瓶中只剩下一小块冰，时长应控制在1min 中；
2、用70%乙醇擦拭瓶外后转移无菌操作台中，打开瓶盖前，用酒精灯火焰对瓶口进行消毒；
3、将预加热的新鲜完全培养基滴入小瓶中。
缓慢用移液枪吸取瓶中液体至15ml离心管中，加入适量浓度和体积的完全培养基，轻柔混合均匀；
4、200 ×g左右细胞悬浮液离心5-10分钟。
实际的离心速度和持续时间因细胞类型而异。
弃掉上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞，并将其转移到适当的培养容器和推荐的培养环境中。
注意事项：
1、液氮温度低，小心低温对人造成的伤害，在液相中储存的冷冻瓶在解冻时存在爆炸的风险，因此，取出冻存管的时候，要做好个人防护。
2、通常细胞集中储藏在液氮中，取出时应迅速，避免温差对其他冻存
细胞造成影响。
3、复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融，将在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞(< 1分钟。
4、解冻时，冻存管先放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。
5、用预热过的培养基慢慢稀释解冻的细胞。
6、解冻细胞后，在培养皿中培养时，应尽量维持高密度，以提高细胞存活率。
7、注意无菌操作，避免细胞发生污染。
动物细胞冻存和复苏的原则
动物细胞冻存和复苏的原则动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。
下面将详细介绍动物细胞冻存和复苏的原则，主要包括以下几个方面：1.冻存前细胞状态在进行细胞冻存之前，首先要确保细胞处于最佳的生长状态。
一般来说，应该选择生长旺盛、形态正常的细胞进行冻存。
此外，为了获得更好的冻存效果，应该尽可能减少细胞的数量，避免细胞之间的相互影响。
2.冻存方法常用的动物细胞冻存方法有慢速冷冻和快速冷冻两种。
其中，慢速冷冻指的是将细胞悬液以较低的降温速率（约1℃/min）缓慢降温至-10℃左右，然后再快速降温至-196℃。
而快速冷冻则是将细胞悬液直接放入-196℃的液氮中。
两种方法均可有效地保存细胞，具体选择应根据实际情况和需要而定。
3.冻存温度动物细胞的冻存温度范围一般在-80℃至-196℃之间。
在这个温度范围内，细胞内的水分和酶活性被有效地抑制，从而避免了细胞的过度代谢和损伤。
常用的冻存容器有液氮罐、杜瓦瓶、干冰等。
4.复苏步骤细胞复苏是冻存细胞的逆过程，主要包括以下步骤：将冻存管从冻存设备中取出，迅速放入37℃水浴中融解；轻轻摇动冻存管，确保细胞完全融解；将融解的细胞悬液洗涤1-2次，以去除其中的DMSO等保护剂；加入新鲜的培养基，将细胞悬液转移至培养瓶中培养基加入；将培养瓶置于培养箱中进行培养，观察细胞生长状态。
5.细胞状态监测在细胞复苏后，应该及时对细胞的生长状态进行监测。
一般来说，可以通过观察细胞的形态、生长速率、细胞活性等方面来评估细胞的状态。
此外，还可以采用流式细胞术、免疫荧光等技术对细胞的特性进行检测和分析。
6.及时传代为了保持细胞的生长状态和稳定性，应该及时对复苏后的细胞进行传代。
传代过程中，应该选择适当的胰酶或EDTA等消化剂对细胞进行消化，控制消化时间，避免对细胞造成过度的损伤。
此外，传代过程中还应注意无菌操作，避免污染。
7.记录管理在进行细胞冻存和复苏过程中，应该建立完整的记录管理体系。
细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项
培养细胞的冷冻保存与复苏⏹概述✧冻存过程⏹冷冻保存与复苏的原理✧冻存结果♦冷冻速率✧讨论♦冷冻保存温度⏹冻存细胞的复苏♦复温速率♦非玻璃化冻存细胞的复苏♦冷冻保护剂✧主要材料⏹冷冻保存方法✧复苏过程♦非玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论✧冻存过程♦玻璃化冻存细胞的复苏✧冻存结果✧主要材料✧讨论✧复苏过程♦玻璃化冻存方法✧结果✧主要材料✧讨论⏹Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。
接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。
他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。
冷冻理论后来得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。
1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。
Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。
而且，用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。
目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。
返回页首⏹冷冻保存与复苏原理在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。
水在低于零度的条件下会结冰。
如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。
这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。
如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。
如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项《细胞复苏及冻存：一场细胞的“冰与火之歌”》在生物实验室这个奇妙的小世界里，细胞的复苏和冻存就像是操纵细胞命运的魔法步骤。
今天呀，我就来给大家唠唠这细胞复苏及冻存的那些事儿，这里面的门道可多着呢，就像走钢丝，容不得半点马虎。
一、细胞复苏的实验步骤和趣事儿步骤一：前期准备像打仗前的粮草筹备在细胞复苏之前，得把“战场”布置好。
先把超净台用酒精仔仔细细地擦个遍，就像给它做个全面的SPA，确保里面一尘不染。
接着，打开水浴锅，把水温调到37℃，这温度可不能出差错，多一度细胞可能就像洗热水澡被烫着了，少一度就像是在冷水里打哆嗦，都不利于细胞恢复生机。
准备好相应的培养液，这就像是细胞的“营养套餐”，没它细胞可活不下去。
步骤二：复苏过程像是拯救冻僵的小生命从液氮罐里拿出冻存管的时候，感觉就像是从冰天雪地的极寒之地营救小生命。
那冻存管冻得直冰手，得迅速放到37℃的水浴锅里快速解冻，要不停地轻轻晃动，就像是在鼓励细胞：“小宝贝们，快快醒来啊！”这时候心里默默祈祷着，可别出啥岔子。
在小细胞们还迷糊着的时候，把它们转移到含有培养液的离心管里，离心的过程又像一场小小的筛选，把那些还没适应过来的杂质去除，留下顽强的细胞。
最后把细胞接种到培养瓶里，就像给它们安家落户啦，盼着它们在新家里茁壮成长。
二、细胞冻存的实验步骤和其中的小纠结步骤一：选择冻存液就像挑选合适的保护铠甲冻存液的配置可是个技术活。
一般是包括培养液、血清和保护剂（像是二甲基亚砜这类的神奇物质）。
血清就像保护层里的柔软衬里，给细胞温暖的呵护，而保护剂则像坚韧的外壳，防止细胞在冷冻过程中被冰晶刺破。
这三者的比例得拿捏得死死的，就像厨师做菜时放盐的量，多一点少一点都不行。
步骤二：缓缓降温像是送细胞进入冬眠把细胞放到冻存管里，标记好细胞类型、日期等信息，这就好比给细胞上户口，省得以后找不到“人”。
然后要进行程序降温。
想象细胞此时就像个准备冬眠的小动物，得一步步慢慢适应越来越冷的环境。
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。
具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。
2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。
消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。
3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。
根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。
离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。
4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。
放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。
注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。
-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。
-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。
冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。
具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。
对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。
2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。
将冻存液预暖。
3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。
用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。
4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。
等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。
注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。
-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。
-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。
复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。
具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。
干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项
干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备：●细胞培养通风橱（即生物安全柜）●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）●离心机●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项:●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。
●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。
●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。
●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。
二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。
b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。
c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。
d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。
细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。
b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。
细胞冻存与复苏
暨南大学医学院 生物化学教研室 费嘉
一、细胞冻存
• 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内、外 环境中的水都会形成冰晶，导致细胞内发生机械 损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、 蛋白变性等，引起细胞死亡。
• 在培养液中加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢 的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细 胞。
• 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）。
• DMSO的常用浓度为5%-10%。
• 添加DMSO保护剂的细胞在液氮中冻存1-2年，
存活率可达80%-90%。 • DMSO液需预先用培养液配好，避免因临时配 制产热而伤害细胞。
试剂和器材
• 器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻 存管或安瓿瓶，2 ml）、离心管、吸管、 离心机等 试剂：含保护剂的培养基（即冻存液）
→ 气态氮（30分钟）→ 液氮
• 注：本室降温程序：室温→ 4℃ 30分钟 →冰
水中 10分钟 → －20℃ 30分钟 → －80℃ 过
夜→ 液氮
注意事项：
• 1、冻存细胞的活力 • 2、避免冻伤 95%以上
• 3、避免液氮挥发干净
• 4、新复苏的细胞在72小时里最好不要更换培
养基，或传代。
• 5、 新引进的细胞株，应首先做好冻存备用。
五、细胞运输
• 1.长距离运输（几天）
• 2.短距离运输（几小时） • 3.细胞悬液空运 • 4.液氮冻存运输
四、血清灭活对细胞产生毒性作用 。
• 方法：56℃ 30 min
步骤：
-20 ℃
2-8℃部分溶解
56℃水浴热灭 活30 min
室温下全 部溶解
注意事项：血清溶解过程中必须规则地摇 晃均匀，才不会使产品质量受损。
细胞冻存和复苏的基本原则
细胞冻存和复苏的基本原则在科学的世界里，细胞就像我们的好朋友一样，既珍贵又脆弱。
想象一下，如果能把这些小家伙冷冻起来，等到需要的时候再把它们复苏，这简直是个梦吧！不过，冻存和复苏可不是随便一冻一热就能搞定的，今天咱们就来聊聊这背后的基本原则，让你轻松掌握这些小窍门。
1. 冻存的基本原则1.1 冻存前的准备首先，冻存之前可得好好准备。
这就像是出去旅行之前得收拾行李一样。
要确保细胞的健康状态，最好先让它们在适合的环境中“养精蓄锐”，这样才能确保它们的“战斗力”。
对了，培养基可别忘了换，培养环境也要保持稳定，不然细胞可受不了这种折腾，估计连个“自我保护”的机会都没有。
1.2 冻存剂的选择接下来，我们得选好冻存剂。
市面上有各种各样的冻存剂，最常用的就是二甲基亚砜（DMSO）和甘油。
这些东西就像是细胞的“保暖内衣”，能帮助它们抵御严寒。
用冻存剂的时候，记得浓度别太高，太浓了反而对细胞不好。
你想啊，就像喝酒一样，太烈了，谁受得了？所以，适量最重要。
1.3 冻存过程现在，到了最关键的环节，冻存过程。
这个时候，细胞需要缓慢降温，让它们适应冷冻的环境。
通常，咱们会用一个叫“程序化冷冻”的设备，把温度控制得稳稳的，像个温柔的妈妈，慢慢带着宝宝入睡。
记得，细胞在80°C或者液氮环境下存放，一年又一年，它们依然保持着“青春永驻”。
2. 复苏的基本原则2.1 复苏前的准备好了，冻存结束，接下来是复苏。
复苏可得快点，细胞在冰箱里待久了，可是受不了冷的，像是被冻住的小龙虾，急需解救！在复苏前，我们需要准备好复苏的培养基，确保它是温暖的，就像是冬天里的一杯热可可，温暖又舒心。
2.2 复苏过程复苏的时候，要小心翼翼，把冻存的细胞迅速放入37°C的水浴中，快速解冻。
这就像是在冰天雪地里给小家伙们来一场“温泉浴”，让它们感受到春天的气息。
解冻的时间可得掌握好，太长了会让细胞崩溃，太短了又不够，所以就像是调味料，恰到好处才是王道。
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。
这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。
步骤：1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。
2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。
3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。
4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。
复苏：1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。
2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。
观察细胞的生长和形态变化。
原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。
冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。
细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。
当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。
注意事项：1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。
2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。
3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。
通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。
4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。
不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。
5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。
细胞复苏,传代与冻存
一、目的：掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。
二、原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
三、步骤：（一）材料准备：1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。
2. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。
3. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。
4. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。
（二）细胞复苏步骤：1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。
3.离心，1 000 rpm，5 min。
4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。
5.次日更换一次培养液，继续培养。
四、注意事项：1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。
一、目的：学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。
二、原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞复苏、传代、冻存
细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。
3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。
细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。
2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。
1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。
3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。
细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。
细胞冻存和复苏标准操作规程
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油四、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
细胞冻存与复苏-注意事项
方法：冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7）配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。
取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞：1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次2胰酶消化3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤注意事项：1.错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。
最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。
1.细胞太少：冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。
（复苏很难成功）。
解决：离心后调整细胞浓度。
（不要重新洗细胞）。
1.盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。
解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。
1.单薄的冻存盒：放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。
解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。
（冻存的原则：缓降！）1.-80度太久：放在－80度冰箱的时间超过半年。
（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：尽快转入液氮。
1.液氮不足：液面不能漫过所有细胞。
解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。
1.取错细胞：找不到/拿错冻存管。
解决：每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。
二、细胞复苏：方法：1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3.离心，1000rpm，5min；4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5.次日更换一次培养液，继续培养。
细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则
1.保护细胞膜：细胞膜是细胞内部和外部环境之间的重要屏障，保护
细胞膜是冻存和复苏的关键。
冻存前，必须将细胞放入适当的保护剂中，
例如甘油、DMSO等，保护细胞膜免受冷冻过程中的损伤。
在复苏过程中，使用适当的解冻缓冲液缓慢地回温，避免细胞膜急剧收缩或破裂。
2. 控制冷冻速度：细胞冷冻的速度必须缓慢，以避免冻结引起的细
胞破坏。
最佳的冷冻速度取决于细胞类型和冷冻条件，通常应在-
1°C/min以下。
可以使用特殊的冷冻器进行控制，或通过降低温度梯度
来减缓细胞的冷冻速度。
3.恢复培养环境：在冻存的细胞复苏过程中，必须立即将细胞恢复到
培养环境中。
这包括向培养基中添加适当的营养物，例如葡萄糖、氨基酸、维生素等，在适宜的温度、氧气和二氧化碳条件下培养。
4.检测细胞的活力和质量：冷冻和复苏过程都会对细胞产生损伤，因
此必须定期检测细胞的活力和质量。
这可以通过测量细胞增殖率、形态、
细胞周期及细胞凋亡等生化和形态指标来评估。
总之，一个成功的细胞冻存和复苏过程需要考虑多个因素，包括保护
细胞膜、控制冷冻速度、恢复培养环境和检测细胞活力和质量。
只有通过
精心设计和执行这些步骤，才能最大限度地减小细胞冻存和复苏过程中的
损伤和质量损失。
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方法：
冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7）配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。
取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞：
1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次
2胰酶消化
3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止
4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存
悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤
注意事项：
1.错误的时机：
细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；
连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。
最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。
1.细胞太少：
冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。
（复苏很难成功）。
解决：
离心后调整细胞浓度。
（不要重新洗细胞）。
1.盖子不紧：
冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。
解决：
选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。
1.单薄的冻存盒：
放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。
解决：
选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。
（冻存的原则：缓降！）
1.-80度太久：
放在－80度冰箱的时间超过半年。
（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：
尽快转入液氮。
1.液氮不足：
液面不能漫过所有细胞。
解决：
定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。
1.取错细胞：
找不到/拿错冻存管。
解决：
每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。
二、细胞复苏：
方法：
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以
上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，
37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
注意事项：
1.取错细胞：
拿错冻存管。
（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170多度，冻手！）
解决：
（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。
（2）拿细胞时戴手套！
1.水浴时间太长：
2min还没融化。
（冻存管的壁较厚，隔热）
解决：
（1）适当提高水浴温度（37度－40度）。
（2）要是冬天，就选用保温盒。
1.冰盒内时间太长：
复苏1h后，还没有加入新的培养液。
（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
解决：提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。
1.失去耐心：
复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。
（有些细胞复苏后一星期，才有起色）
解决：不要换液，耐心等待，两周后再做决定,英格恩。