细胞冻存与复苏-注意事项

方法：

冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7）配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞：

1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次

2胰酶消化

3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止

4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存

悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤

注意事项：

1.错误的时机：

细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；

连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。

最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。

1.细胞太少：

冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。

解决：

离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。

1.盖子不紧：

冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。

解决：

选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。

1.单薄的冻存盒：

放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。

解决：

选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）

1.-80度太久：

放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：

尽快转入液氮。

1.液氮不足：

液面不能漫过所有细胞。

解决：

定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。

1.取错细胞：

找不到/拿错冻存管。

解决：

每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。

二、细胞复苏：

方法：

1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以

上培养液，混匀；

3.离心，1000rpm，5min；

4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，

37℃培养箱静置培养；

5.次日更换一次培养液，继续培养。

注意事项：

1.取错细胞：

拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170多度，冻手！）

解决：

（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。

（2）拿细胞时戴手套！

1.水浴时间太长：

2min还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）

解决：

（1）适当提高水浴温度（37度－40度）。

（2）要是冬天，就选用保温盒。

1.冰盒内时间太长：

复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）

解决：提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。

1.失去耐心：

复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）

解决：不要换液，耐心等待，两周后再做决定,英格恩