细胞的冻存及复苏PPT课件
实验6_细胞冻存与复苏
『超低温冰箱』
制冷系统
基本采用复叠式制冷的工作原理，选用两台全封闭 压缩机作为高、低温级压缩机使用
外观
卧式，立式
-86℃超低温冰箱使用
使用90～95%能力，以延长机器寿命；设置使用温 度为-76℃
实验6 细胞冻存与复苏
1- 细胞冻存操作步骤
准备 冻存液（完全培养基配制的10%DMSO 溶液）配制 对数生长期细胞的吹打（消化）、收集、离心和计数（或估算）
1000rpm6min，去上清
用冻存液悬浮细胞使密度在～106/ml 左右 分装到冻存管
用记号笔在冻存管上加写标识（细胞株号+日期+操作者） 无菌分装到1.8ml 冻存管，装量0.5～1.0ml/支 冻存
重新悬浮 用5×体积的完全培养基悬浮细胞，铺放培养孔或培养瓶内，镜检
培养与观察 用记号笔加写标识，镜检观察 置CO2 培养箱内，培养18～24h后镜检细胞活性
3- 工作总结与评价
细胞冻存操作中影响细胞活性的因素分析 细胞复苏操作中影响细胞活性的因素分析 超低温冰箱使用与维护要点分析
影响保温的因素：门霜和冰块 使用过程中，温度升高到-60℃时必须关闭箱门
2- 细胞复苏操作步骤
准备 超净工作台消毒灭菌，无菌器材准备 准备37℃水浴 明确冻存细胞所在冻存管的存放位置，确认冻存18~24h以上
融化 在水浴中充分搅拌使在～1min 融化彻底
离心去除冻存液 无菌操作，10×体积的培养基稀释，1000rpm6miБайду номын сангаас，去上清，分 散沉淀
谢谢观赏
实验十一细胞的冻存与复苏 ppt课件
• 3. 低速离心，1000rpm，10分钟。 • 4. 去上清，加新鲜培养液3ml。 • 5. 将刚复苏的细胞转移至培养瓶中，C02培养箱，
37 ℃培养。
复苏要点
• 快速解冻
– 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水 浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全 部融化（不要超过3 分钟）
实验十一、细胞的冻存与复苏
一、实验目的
1.初步掌握冻存与复苏的原理及其操作过程 2. 继续强化细胞无菌操作理念
二、实验材料与用品
（一）材料：Hela细胞
（二）试剂 培养液：1640培养液+15%小牛血清；胰蛋白酶消 化液：0.25%；冻存液、液氮
三、实验原理
• 细胞冻存的原理：当细胞冷到零度以下，可以产 生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓 度升高，并在细胞内形成冰晶。
–细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通 过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长 培养液的培养瓶。
四、实验步骤
一、细胞冻存方法
• 1.预先配制冻存液： 含10-30%血清培养基，10% DMSO。 • 2.取对数生长期细胞，胰酶消化后，加全培养基终止消化，
1000rpm离心收集细胞，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成 细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) • 3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷 冻日期。 • 4.冷冻过程要缓慢。4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存
透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程， 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少 胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 • 常用细胞冷冻保存液 10％DMSO ＋ 20％血清＋基础培养液 10％甘油＋ 20％血清＋基础培养液
细胞的冻存及复苏
冷冻速率：慢冻
复苏速率：快融
冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降 温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
细胞冻存与复苏的关键因素
要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几 个问题：冷冻速率、复苏速率、冷冻保护剂，冷 冻保存温度。
细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
冷冻速率：降温的速度，直接关系到冷冻效果， 对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其 最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
细胞冻存与复苏ຫໍສະໝຸດ 细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
细胞的冻存和复苏 2.细胞复苏
在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保 存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。
细胞冻存与复苏的原理
• 为使细胞复苏时存活率最高 • 最佳的冻存条件： 尽可能地降低细胞内的晶体形
成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细 胞造成的损伤。 • A) 缓慢冷冻 • B) 用亲水的低温保护剂排除水分 • C)在尽可能低的温度保存细胞 • D)快速复苏
冷冻保存方法
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。
冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。
在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。
（二）方法1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。
给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。
2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。
3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。
4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。
5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。
6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。
7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。
8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。
（三）注意事项1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。
2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏一.实验原理体外培养的细胞随着传代次数的增加，在体外环境中生存时间的增长，其各种生物特性都将逐渐发生变化，且细胞的传代培养过程中，培养器具、培养液等都需大量的耗费，因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冻存通常指将细胞冷冻储存在-196℃的液氮中，理论上可以储存无限长的时间。
如果不加保护剂直接对细胞进行冷冻，会导致细胞内外的水份迅速形成冰晶，并对细胞的结构造成损害。
目前冻存细胞时多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，缓慢冷冻时可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成而造成的细胞损伤，且不会对细胞造成毒性。
细胞的复苏是指将冻存的细胞从液氮中取出融解，使其活力恢复的过程。
细胞复苏应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
二.试剂器材1.完全培养基2.PBS3.DMSO4.0.25%胰酶(贴壁细胞需要)5.0.4%台盼蓝溶液(取台盼蓝0.4g，溶于100ml生理盐水或PBS中，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml无菌离心管中，室温保存备用)6.冻存培养液(取完全培养基9.0ml，逐滴加入DMSO 1.0ml)7.细胞培养瓶8.15ml离心管9.冻存管10. 水浴锅其他器材：移液器、移液器吸头(10μl、100μl、1ml)、温度计、镊子、血球计数板、计数器、废液缸、离心管架、涡旋振荡器等。
三.操作步骤细胞冻存冷冻前24-48hr更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期；配制含10%DMSO、10%小牛血清的冻存培养液置于4℃下待用；贴壁细胞：用胰蛋白酶把贴壁生长的细胞消化下来，制备成单细胞悬液，200-400g离心5min收集细胞；悬浮细胞：直接将细胞移至离心管中，200-400g离心5min收集细胞；弃去上清，用冻存液混悬起沉淀细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率；加冻存液调整细胞浓度至(1-10)×106/ml；将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5 ml，标明细胞的名称、冻存时间及操作者；将上述冻存管在4℃下放置30min；然后移入-20℃冰箱30min；置于-80℃冰箱过夜；再置于液氮罐中长期保存。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
细胞的冻存复苏和运输.ppt
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳 将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分 钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
Hale Waihona Puke 冻存和复苏的原则：慢冻快融
复苏方法
（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中， 使其融化（1分钟左右）。
冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细 胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞 损伤甚至死亡。
甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，可
使细胞内水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，结晶就大，大结 晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶
的重结晶。融化速度快，还可使迅速通过最易受损的-5－0度
冻存和复苏的原则：慢冻快融
冻存方法
1）预先配制冻存液： 含10%－20％血清的培养基＋ 10% DMSO或甘油
2）取对数生长期细胞，经胰酶消化（或离心）后， 加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液 （1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)
❖ 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。 ❖ 具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一
些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二 醇、乙酰胺、甲醇等，。 ❖ 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分 子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二 醇、羟乙基淀粉等。
（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速（800－1000rpm）离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。每日
细胞复苏学习幻灯
冻存细胞解冻学习幻灯
张永华 北京永泰免疫应用科技有限公司
冻存细胞解冻的原则
在实际操作中，冻存细胞要进行复苏， 在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再 培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。 培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。 以保证细胞外结晶快速融化， 以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速 融化水分渗入细胞内， 融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶 损胞冻存管从加有液氮的保温桶中用镊 子夹牢，快速在37度水浴锅中摆动，使冻 子夹牢，快速在37度水浴锅中摆动，使冻 存液迅速解冻融化。注意在这过程中尽量 使冻存管盖位于水面上。 待冻存管中大部分内容物已呈液态时，将 冻存管表面消毒后移入生物安全柜。
注意事项 在细胞复苏操作时， 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞 速度要快，可不时摇动冻存管， 速度要快，可不时摇动冻存管，使之尽快 通过最易受损的温度段（ ）。这 通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这 样复苏的冻存细胞存活率高， 样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态 良好。 良好。 从液氮罐中取出冻存管， 从液氮罐中取出冻存管，有时因冻存管未 封严，浸入了液氮， 封严，浸入了液氮，取出后因冻存管内液 氮迅速气化而发生爆炸， 氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护 眼睛和手套。 眼睛和手套。
细胞培养基本方法复苏、换液、传代、冻存课件 (一)
细胞培养基本方法复苏、换液、传代、冻存课件 (一)近年来，细胞培养技术在生物研究中得到了广泛的应用，但在应用的过程中，经常遇到细胞复苏、换液、传代、冻存等问题。
本文将对这些问题进行讲解。
一、细胞复苏细胞冻存是广泛应用的细胞存储方法。
由于在冻存过程中会损伤细胞，因此冻存后的细胞需要进行复苏才能够继续进行培养。
复苏的方法如下：1、取出细胞管，将管子快速放入37℃的预热水中，快速震动5秒钟，过度加热有危险，只需使水恒温为37℃即可。
2、马上将管子离水中，管口向外，用无菌的吸管粗略地抽取培养液，然后再将吸管插入细胞培养管管口，尽量避免空气进入细胞培养管。
3、使细胞含量达到有效水平（此种方法需配合不同种类细胞需要的培养基和生长条件）二、换液为了保证细胞的健康和正常生长，需要周期性地进行培养液的更换。
换液的方法如下：1、用无菌吸管将旧培养液吸出。
2、向细胞培养管中加入新的培养液。
3、培养之前搅拌均匀。
4、用生物安全柜消毒吸管和细胞培养箱户口。
三、传代传代的目的是使细胞继续生长和培养，同时避免暴增和变异。
传代的方法如下：1、用1:2、1:3、1:4等系数调节种子层数。
每次移植液可以不变，也可以加1倍因子。
2、对于一些细胞，如病毒感染易变异和新生成的细胞支原体感染易暴增、细胞周期等，直接移植的效果更佳。
3、传代前，检查培养基是否清晰，底物和细胞是否良好。
4、传代时需要更换新的培养基。
四、冻存为了保存优质的细胞株和把样本留在未来的使用中，冻存是非常重要的。
冻存的方法如下：1、将细胞悬液和10%含有环甲基丙环戊酮（DMSO）的培养基混合（1:1）。
2、转移冷冻管至冰缸中，迅速将前端放入-80°C的冰柜中小心，冷却30-60分钟后，将其转移到液氮罐中。
3、在恒温下用不同培养基和DMSO的比例来冻存不同种类的细胞，确保细胞存活和培养后表型的一致性。
总之，对于细胞培养技术中的基本方法，我们需要认真学习和实践。
只有熟练掌握这些基本技能，才能够更好地发挥细胞培养技术的应用价值。
细胞工程--C4.5 细胞的冻存、复苏和运输ppt课件
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4
慢冻程序
标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器 简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布 袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮 罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度， 在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直 接投人液氮中。
细胞复苏方法
1. 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
2. 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以 上。
3. 低速离心10分钟。 4. 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
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8
细胞运送
• 当前培养细胞既可在国内相互寄赠，也可 进行国际间的交流，为此要有运输细胞的 方法。
第四章 细胞培养
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1
细胞培养
4.1 培养细胞的生物学特征 4.2 细胞培养液 4.3 细胞的基本培养技术 4.4 细胞系和细胞株的建立 4.5 细胞的冻存、复苏和运输
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2
细胞冻存和复苏
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少 入力、经费，减少污染，减少细胞生物 学特性变化。
• 2.妥善包装和运送；一般在不超过四五天到 达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响;
• 3.到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，
置37℃培养，次日完传整版代课件。
10
细胞培养的优缺点
优点：
缺点：
1. 可简化细胞的生长环境。 1. 体外培养的动物细胞对
2. 能够方便地控制实验因 营养的要求较高。
冷冻和复苏
青 衣
冷存主要材料
（1）仪器设备：普通冰箱、-30 ℃低温冰箱和-70 ℃ ～-80 ℃超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程 控降温仪等； （2）冻存管：容量为 1ml 或 1.5ml； （3）冷冻保护液：一般是以 9 份小牛血清或细胞培养液与 1 份 DMSO（二甲基亚砜） 混合而成。现配现用，或配 制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水 浴溶解； （4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。 青
冻存管 4~8℃ 约 40min -10~-20℃
普通冷藏室
约45min
普通冰箱
移入 液氮
-70~-80℃
-30℃
超低温冰箱
过夜
低温冰箱
约30min
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发 干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。 青 衣
3· 记录 记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中 降温的情况、冻存位置以及操作人员
青 衣
对照试验
在冷冻细胞被移入到液氮罐中一段时间后，取出一管细
胞复苏并进行培养以检测存活率。
青 衣
实验要点及说明：
1．严格遵守液氮操作规则(即戴上合适的手套和护目镜)，液态氮对眼 睛极为有害； 2．对一瓶细胞培养液要尽可能多分装几个冷冻管； 3．延长暴露在DMSO中的时间对细胞有害，因此冷冻和解冻操作要 尽可能快； 4．细胞可以暂时稳定保存在-80 ℃达数月；
衣
谢谢
青 衣
细胞冷冻和复苏
青 衣
原理
在低于-70 ℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反 应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材 料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老 死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时， 其内部的生化反应可恢复正常。
细胞冷冻与复苏
第8章细胞的冷冻保存复苏技术细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。
但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。
因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。
细胞冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。
第一节细胞的冻存一、概述目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。
胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。
如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
二、主要冷冻设备和材料常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。
使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。
液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。
（2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。
（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。
细胞的冻存和复苏
背景知识：细胞培育的传代及平时保持过程中，在培育用具、培育液及各样准备工作方面都需大批的耗资，并且细胞一旦走开活体开始原代培育，它的各样生物特征都将渐渐发生变化并跟着传代次数的增添和体外环境条件的变化而不停有新的变化。
所以实时进行细胞冻存十分必需。
细胞冻存及复苏的基来源则是慢冻快融，实考证明这样能够最大限度的保留细胞活力。
当前细胞冻存多采纳甘油或二甲基亚砜 (DMSO)作保护剂，这两种物质能提升细胞膜对水的通透性，加上迟缓冷冻可使细胞内的水分溢出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，进而减少因为冰晶形成造成的细胞损害。
复苏细胞应采纳快速消融的方法，这样能够保证细胞外结晶在很短的时间内即消融，防止因为迟缓消融使水分渗透细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。
细胞冻存操作步骤：1.配制含 6-10%DMSO的 10%小牛血清的冻存培育液，冰上预冷；2.取对数生长久的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15ml 离心管；3.离心 500rpm，5min；4.去除胰蛋白酶及旧的培育液，由慢至快，滴入配制好的冻存培育液，用吸管柔和吹打使细胞平均（在冰长进行）；一般一个小方瓶冻一支或许一个10cm培育皿冻 2支。
5.将细胞分装入冻存管中，每管 1ml（若冻存多于 1 支，则每支要平均分装）；6.在冻存管上注明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：放入装有异丙醇的程序降温盒中，-70 ℃冰箱中放 3 天左右，拿出冻存管，移入液氮容器内。
注意事项：1 ．从增殖期到形成致密的单层细胞从前的培育细胞都能够用于冻存，但最好为对数生长久细胞。
在冻存前一天最好换一次培育液；2．将冻存管放入液氮容器或从中拿出时，要做好防备工作，免得冻伤；3．冻存和复苏最好用新配制的培育液。
细胞复苏操作步骤：1.从液氮容器中拿出冻存管，快速浸入 37℃温水中，并时时摇动令其赶快融化；2.当最后一小块冰快消融时，将冻存管放在冰浴上。
细胞复苏、传代、冻存过程
细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。
细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。
下面将详细讨论这些过程。
细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。
2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。
3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。
4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。
5.定期观察细胞的生长情况。
细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。
3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。
4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。
5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。
冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。
3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。
4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。
5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。
6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。
7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存).ppt
镜下观察，标明名称，序号和日期。
16
6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，
用200µl的枪将孔内的培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200µl。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下
观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24 小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加MTT液20µl。
14.用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。
15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。
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16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在 冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多 个冻存管中，每管1.5ml。
10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞 变成单个圆形，则可进行传代。
11
11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。
12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。
13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。
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6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。
7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子 取出，烧瓶口（至少10圈）。
8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子；
9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然 后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 分钟后取出；
3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 4. 用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口； 5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已
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冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降
温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
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细胞冻存与复苏的关键因素
复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
9
细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保护剂
冷冻保护剂：可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般 多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
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细胞冻存与复苏的关键因素
保存温度
冷冻保存温度：能长期保存细胞的超低温度，在 此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但 经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和 功能。 液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。
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冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
细胞冻存与复苏
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细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
2
细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
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细胞的冻存和复苏 2.细胞复苏
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细胞复苏方法
1、液氮中取出冷冻管→27~38℃水浴中，约 1min融化 2、室温下5min，用25 ℃左右血清培养液稀释 至原体积的4倍。 3、500r / min，低速离心10min。 4、去上清液，加新鲜培养液培养。
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在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保 存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。
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细胞冻存与复苏的原理
• 为使细胞复苏时存活率最高 • 最佳的冻存条件： 尽可能地降低细胞内的晶体形
成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细 胞造成的损伤。
• A) 缓慢冷冻 • B) 用亲水的低温保护剂排除水分 • C)在尽可能低的温度保存细胞 • D)快速复苏
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冷冻保存方法
2．玻璃化冷冻 玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂 联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直 接投入液氮进行冻存的方法。以该种方法冻结的 细胞悬液没有冰晶的形成。 玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果， 不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可 使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛 应用，但很少应用于一般细胞的冻存。
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Байду номын сангаас
细胞冻存与复苏的关键因素
要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几 个问题：冷冻速率、复苏速率、冷冻保护剂，冷 冻保存温度。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
冷冻速率：降温的速度，直接关系到冷冻效果， 对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其 最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
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细胞冻存与复苏的关键因素
冷冻速率
不同的冷冻速率使细胞内发生不同的生理变化，也可以 产生不同的损伤。冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，超 过一定程度时即失去活性。同时引起细胞外溶液部分结 冰，未结冰的溶液中溶质浓度增高产生溶质损伤。当冷 冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成冰晶， 造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。