八年制眼科 24章 眼病基因诊断与

该法优点：
不需提取核酸，故可完整保持组织 或细胞的形态，因而更能准确地反映组 织细胞的功能状态。
反转录PCR （Reverse transcription PCR，RT-PCR）
其原理是： 提取组织或细胞中的总RNA，以其中
的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或 随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA； 再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获 得目的基因或检测基因表达。
眼科学
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第二十四章 眼病基因诊断与
基因治疗（1）
第一节 基因诊断
1.概述 2.基因诊断的一般原则和基本方法 3.眼病的基因诊断
概述
定义： 利用分子生物学技术，通过检测基
因及基因表达产物的存在状态，对人 体疾病作出诊断的方法。基因诊断检 测的目标分子是DNA、RNA，也可以 是蛋白质或者多肽。
免疫印记分析（immunoblotting）
基本原理： 将经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）
分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例 如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共 价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离 的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为 抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与 酶或同位素标记的第二抗体起反应，经 过底物显色或放射自显影以检测电泳分 离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
生物芯片（biochip）
采用光导原位合成或微量点样等方法， 将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子 甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化 于支持物（如玻片、硅片、尼龙膜等载体） 的表面，组成密集的二维分子排列。
然后与已标记的待测生物样品中靶分 子杂交，通过特定的仪器（比如激光共聚 焦扫描仪）对杂交信号的强度进行快速、 并行、高效地检测分析，从而判断样品中 靶分子的数量。
1.芯片的制备
A G C T or Oligo probes
Gene probes （cDNA、DNA）
arrayer
substrate
Ready-to-use microarray
2. 基因表达谱双色标记
3.分子杂交
Apply sample
1） hybridize
2） rinse
SLeabharlann Baidunger法（双脱氧末端终止法）
①以待测DNA单链为模板，在DNA聚 合酶作用下，加入4种dNTP和4种 ddNTP（双脱氧核糖核酸） ②dNTP和ddNTP竞争参与DNA互补 链的合成
③当ddNTP取代dNTP的位置后，DNA 链的合成终止 ④电泳图谱分析，确定碱基顺序 ⑤图谱中读出的顺序是待测链的互补 碱基顺序
PCR技术原理示意图
限制性片段长度多态性（RFLP）
该方法可以用于检测已知点突变、微 小的缺失或者插入突变。
用同一限制性内切酶完全切割同一物种 的不同个体的基因组DNA，出现分子质量不 同的同源片段，这种由限制性内切酶酶切位 点变化导致的DNA片段差异，称限制性片段 长度多态性（RFLP）。
等位基因特异的寡核苷酸探针（ ASO）杂交
4.检测分析
5.图像处理
Detector 1
Detector 2
False-color differential image
6.图像分析
基因测序
是最直接、最确切的基因诊断方法。
• Maxam-Gilbert法（化学裂解法） • Sanger法（双脱氧末端终止法） • DNA自动测序法
蛋白质分析
免疫组织（细胞）染色
指带显色剂标记的特异性抗体在组织 细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的 呈色反应，对相应抗原进行定性、定位和 定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性和组织化学的 可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包 括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放 大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗 原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病 原体以及受体等）。
基因诊断检测的目标分子
DNA RNA 蛋白质或者多肽
基因 疾病
基因诊断的特点
针对性强 特异性高 灵敏度高
适应性强 早期诊断
基因诊断的一般原则 和基本方法
基因诊断的样本收集和保存
➢ 任何具有细胞核的细胞，均可以作为基 因诊断的送检样品
➢ 尽量保证每一份样品都被预先保留一部分 ➢ DNA样品可以长期保存于-20oC，而用于
原理： 已知基因突变部位和性质，合成基因特
异的核苷酸探针（20bp），标记后与受检者 DNA杂交诊断。（可与PCR联用：PCR-ASO）
方法：
1.合成两种探针： ① 已知突变位点的核苷酸序列（M） ② 正常基因碱基序列（N）
2.杂交实验结果：
M+ N- 受检者是突变基因的纯合子 M+ N+ 受检者是突变基因的杂合子 M- N+ 受检者是不存在突变基因 M- N受检者的缺陷基因可能是一种新的突变类型
弗雷德里克 桑格
化学裂解法（Maxam-Gilbert法）
基本原理 基于某些化学试剂可以使DNA链在1
个或2个碱基处发生专一性断裂的特性， 精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存 在于少数分子中，不同分子在不同位点断 裂，从而获得一系列大小不同的DNA片 段，将这些片段经电泳分离。
分析前，用同位素标记DNA的5´ 末端，经放射自显影即可在X胶片上读 出DNA链的序列。
RNA 诊断
Northern印迹
通过标记过的互补序列cDNA或RNA 探针与转移至硝酸纤维膜上的待测RNA 样品杂交，以确认特定的RNA改变。
原位杂交（in situ hybridization）
将标记探针与细胞或组织切片中的核 酸进行杂交，进而检测特异的RNA序列。
细胞原位杂交 组织切片原位杂交
分离制备RNA和蛋白质的样品必须保存 于-70 oC或者液氮中
根据检测对象不同，基因诊断可分为：
✓ DNA诊断 ✓ RNA诊断 ✓ 蛋白质诊断
Southern印迹
由英国人Southern （1975）发明， 将琼脂糖中的DNA转移到硝酸纤维膜或 尼龙膜上进行DNA分子杂交分析的方法。
聚合酶链反应（PCR）
原理： 利用体内DNA复制的原理和DNA变性
与复性的性质进行目的基因的大量扩增。
在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用 耐热的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的 DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、 引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤 的循环过程，实现对目的DNA的扩增。
PCR的基本反应步骤