第三章突变的应用微生物遗传育种95页PPT

四、诱变育种工作中应注意的问题
安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用， 因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安 全和环境安全。
个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要 求不同防护方法，如γ-射线辐射防护要求较 高，uv要求较低，而化学诱变剂则要求不与 身体有关部位直接接触；
环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经 解毒或充分稀释才可以排放。
突变率/ %
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
试验号
乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果
1- 对照； 2-乙烯亚胺（浓度1:7000）； 3, 5, 7, 9-紫外线； 4, 6, 8, 10-乙烯亚胺加紫外线
紫外线的剂量（erg/mm2）： 3, 4-2000；5, 6-4000； 7, 8-6000；9, 10-10000
谢调控育种； 生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记
营养缺陷型突变株在代谢调控育种中的应用
阻断代谢途径，积累中间代谢产物
例：利用谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型积累鸟 氨酸
谷氨酸
N-乙酰 谷氨酸
鸟氨酸
瓜氨酸
精氨酰 琥珀酸
精氨酸
营养缺陷
反馈抑制
阻断分支代谢，积累另一终端代谢产物 例：利用XMP- 生产 AMP
经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来 激活；一次较高剂量的强诱变后，通常接着进行2~3次 较低剂量的温和诱变，以利于菌株遗传性状的稳定。
在一次诱变中，可以分别采用不同剂量处理出发菌株， 从中选出最佳剂量
诱变剂量的控制方法
化学诱变剂：诱变剂的浓度、处理时间和处理条件； 物理诱变剂：照射距离、照射时间和照射条件
突变菌株
突变型产量(mg/ml)来自钝齿棒杆菌 钝齿棒杆菌 钝齿棒杆菌
HseThr Thr - +Met -
17.93 2.33 2.00
钝齿棒杆菌 AECr
20.0
AECr, Hse-
50.0
北京棒杆菌 Hse-
36.6
Hse-,AECr
45.0
二、营养缺陷型的筛选
诱变处理：同前 后培养：在CM中进行，消除突变细胞的表型延
（二）诱变育种技术在育种工作的作用
提高目标产物的产量； 改善菌种特性，提高产品质量，简化工艺条件； 开发新产品； 给代谢调控育种提供技术手段
（三）高产菌株诱变育种的特点
产量是一种数量性状，数量性状的特性和基因 突变的特点决定了高产菌株的诱变选育一般具 有以下一些特点：
盲目性大； 筛选工作繁琐，工作量大； 工作效率低，周期长； 难以集合多个优良性状
不产孢子的真菌可以采用年幼的菌丝体进行诱 变处理（对尖端菌丝、单菌落边缘菌丝或小段 菌丝悬浮液进行诱变处理）
（三）菌悬液的制备
选择合适的介质：物理诱变常采用生理盐水作分
散介质，而化学诱变则需要用缓冲液作介质。
使细胞或孢子要处于良好的分散状态：利于与 诱变剂解除；便于筛选
玻璃株打散，脱脂棉或擦镜纸（双层）过滤
形态突变型 负突变型 正突变型
X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变 异的关系
紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株293#变异 的关系
3. 处理方法
单一诱变剂处理;
复合处理：两种或两种以上诱变剂同时处理、 不同的诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理 以及紫外线与光复活交替处理等( 注意！)
渗漏突变株(leakage mutant) ：一种遗传 障碍不完全的营养缺陷型，其特点是酶 的活力下降但不完全丧失，使其能少量 合成某一代谢产物，但产物的量又不造 成反馈抑制。
优点：不需要限量添加生长因子。
筛选： 营养缺陷型突变株→诱变→ 挑选 在MM上生长缓慢且菌落小的回复突变株
不同类型突变株积累L-赖氨酸的水平
3. 处理方法
直接处理：在缓冲液或无菌生理盐水体系中 对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离 突变株；
生长过程处理：在摇瓶培养基或固体平板中 加入诱变剂，在菌体生长时进行诱变处理。 （适用？）
（五）后培养
后培养：将诱变处理过的细胞在营养丰富的 培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯 合并表达。 目的：消除表型延迟 后培养培养基：营养要求丰富，酪素水解 液(或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏 可提供各种生长因子。
工业与工程需求：发酵工业尤其是抗生素工业生 产菌株选育工作的需要；
理论与技术基础：Thom和Steinberg（1939）用X 射线在真菌中首次诱发基因突变成功；
问题探索与技术发展：Davis对各种诱变筛选程序 的统计学比较；Calam对各种诱变剂量下的产量 分步曲线的比较；Dahl等人对筛选工作可能误差 的分析；各种自动化和高通量筛选技术出现
第三章 突变的应用
第一节 诱变育种 第二节 营养缺陷型突变株的筛选与应用 第三节 抗反馈调节突变型的筛选及应用 第四节 其它类型突变株的筛选及应用 第五节 菌种退化及其防止
第一节 诱变育种
一、概述 二、诱变育种方案的设计 三、诱变育种的一般步骤 四、诱变育种中应注意的一些问题
一、概述
（一）诱变育种技术的产生与发展
与营养要求有关的三种遗传型
基本培养基MM
完全培养基CM 或补充培养基MM+A、MM+B
诱变
野生型[A+B+]
营养缺陷型[A+B-]或[A-B+]
原养型[A+B+]
回复突变或重组
（二）营养缺陷型突变株的应用
科研上： 研究代谢途径； 基因重组的遗传标记菌种； AA、碱基、维生素生物测定的试验菌种 生产上： 氨基酸，核苷酸等发酵产品生产菌种的代
复筛时量的矛盾已不突出，而对准确性有了更高的 要求，因此复筛一般要培养2~3瓶，分析方法一般 选用经典方法或标准方法，有时要进行几次复筛。
筛选的一般步骤
1株出发菌株 ↓诱变处理 400个单细胞菌株 ↓初筛每株1瓶 80株 ↓复筛每株三瓶 16株 ↓复筛，三种工艺条件，每株各三瓶 3株（对应于不同工艺条件） ↓ 供生产或再次诱变使用
三、诱变育种的一般步骤
出发菌株 ↓纯化、活化、前培养（同步培养） 培养液 ↓离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤） 单细胞或单孢子悬液 ↓活菌计数，诱变预备试验 诱变处理 ↓活细胞计数，致死率计算 后培养（中间培养） ↓ 平板分离 ↓变异率计算 初筛→复筛→ 保藏及扩大试验
（一）出发菌株的选择
迟（生理性延迟和分离延迟） 饥饿培养：洗涤后用无氮基本培养基培养4~6
作用后所造成的损伤能快速通过复制而形成突 变，可以获得较高的突变率。
前培养的培养基：嘌呤、嘧啶碱基含量要丰
富
（二）前培养
丝状真菌的前培养
产孢子真菌一般采用其孢子进行诱变，为提高 其对诱变剂敏感性，可以将其同步培养至孢子 刚萌发的高生理活性状态（芽管的长度相当于 孢子直径的0.5~1倍）；
尽量选择既往诱变史少的高产菌株： 由自然界分离获得的野生型菌株，突变 可能性较大;经自然分离的生产菌株，对 生产环境适应，又具野生型特性，也是 良好的出发菌株;经过诱变改造的菌株， 负突变可能性较大，可结合其它育种方 法改变其遗传保守性
（一）出发菌株的选择
挑选纯系（遗传纯）菌株：避免使用丝 状真菌菌丝体（异核体）；要尽量选择 单倍体单核细胞（孢子），以减少诱变 菌的分离延迟（结合诱变剂选择）
完全培养基 Complete Medium （CM）含有满 足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长 所需营养物质的天然或半合成培养基。
基本培养基Minimal Medium（MM）：不含生 长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要 的最低成分合成培养基。
补充培养基Supplemented Medium(SM)：补充 了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定 的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多 是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。
制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采用的 培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株； 每一步准备采用的分析方法等。
制定筛选方案时的一些基本原则
筛选菌株的量要根据实验室的人力物力条件而定；
初筛的目的是将大多数未变异菌株或负变菌株去除， 这时解决的主要是量的问题，因此每株菌培养时一 般只在一种培养条件下培养一瓶；培养条件一般沿 用出发菌株的培养条件，分析方法也选用适于处理 大量样本的、操作简便而快速的方法，如HPLC, GC， 比色法等（分析方法的精确性可以稍差一些）。
回复，染色体畸变、移码等不易回复 对一些既往诱变史少的低产或野生菌株，uv线往往
是首选；对于经多次诱变处理的菌株，常需要能诱 发染色体发生重排等较大损伤的强辐射进行处理。 结合细胞的透性和生理状态进行选择 经常变换诱变剂或复合处理
2.诱变剂量的选择
高产菌株在低剂量时效果较好，而对多核细胞、孢子、 低产菌株或质量性状处理剂量不宜过低。
要养成良好的工作习惯：如仔细观察细 微的形态变化、要详实记录菌株的诱变 史和诱变谱系。
诱变育种技术要和其他育种手段相结合。
诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的 不定向性，工作量十分大，因此要对整 个工作进行合理的设计并结合新技术提 高其工作效率。
第二节 营养缺陷型突变株的筛选与应用
代谢调控育种（推理育种 rational selection ）：是指利用 代谢调控知识指导筛选工作的育种技术。 工业与工程需求：克服诱变育种筛选盲目性大、效率低的 缺陷；氨基酸发酵工业的兴起 理论与技术基础：某些微生物中一些代谢产物的合成途径， 以及这些途径之间的关系和调控特点被揭示；诱变育种技 术已经成熟 问题探索与技术发展：对微生物代谢途径的研究不断深入， 越来越多的代谢途径和代谢调控方法被阐明
二、诱变育种方案的设计
制定明确的选育目标：一次诱变目标不可太高太 多；
建立可行的筛选方法：关键问题是确立一种测定 产物的方法；
确定诱变筛选流程：是诱变育种工作方案设计的 中心内容。对于既往诱变史较少的低产菌株，采 用一次高效法有利于提高育种工作的进度；而对 于已进行多次诱变处理的高产菌株，多步积累法 优于一次高效法。
SAMP
AMP
R-5-P B.subtilis
IMP
(2)
XMP
(1) AMP脱氨酶
GMP还原酶
(3)
GMP
(AK)
高丝氨酸脱氢酶
解除反馈抑制， 积累代谢产物
如：高丝氨酸营养 缺陷型突变株 (Hser-)条件解除 （Thr+Lys)对AK的 协同反馈抑制
C. glutamicum
应用渗漏突变株进行代谢调控育种
（六）变异菌株的分离及筛选
1.变异株的分离：多为平板分离，结合快速 检出法（平板预筛）
根据形态变异淘汰低产菌株或筛选高产菌 株；
根据平皿反应淘汰低产菌株或直接挑取高 产菌株
2.筛选：包括初筛，复筛和终筛等。
明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；产 量准备提高多少等；
一次诱变目标不要太高。
一、营养缺陷型及其应用
营养缺陷型（auxotroph）：是指丧失了合成一 种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在 补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。
野生型（wild type)：从自然界分离到的任何微 生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，均称 该微生物的野生型。
原养型（prototroph) ：营养缺陷型突变株经回 复突变或重组后产生的、其营养要求在表型上与 野生型相同的菌株。
选择对诱变剂敏感的菌株：选择一些增 变突变株
采用多出发菌株
更换出发菌株
具有特定生产性状的可能性：要确有特 定物的代谢途径
（二）前培养
前培养的目的：
对数中后期：生长旺盛，细胞浓度较高，对诱 变剂敏感；
同步培养物：诱变剂处理时，群体中变化一致； 细胞内应具有丰富的内源性碱基：DNA被诱变剂
调节适当的细胞或孢子密度
酵母细胞、霉菌孢子：106~107个/ml； 细菌细胞、放线菌孢子：108个/ml 估计：血球计数板计数或OD法 计数：平板菌落计数
（四）诱变处理
1.诱变剂的选择 在不影响诱变效果的前提下，尽量选择毒性小、易
于防护、安全性强的诱变剂； 尽量选择操作简便易行、便宜易得的诱变剂； 尽量选择不易发生回复突变的诱变剂：碱基置换易