转基因实验

实验四、转基因大豆GTS-40-3-2的PCR检测

一、实验目的：利用PCR技术检测混合大豆样品中是否含有转基因大豆GTS-40-3-2成分。

二、实验原理：

1、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的反应动力学：PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大

多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR反应原理示意图

2、转基因抗草甘膦大豆GTS40-3-2(Roundup-Ready soybean)是美国孟山都公司研制的抗除草剂大豆，通过外源蛋白cp4-EPSPS表达抗除草剂的特性。近年来我国从国外进口的大豆绝大部分是这种转基因作物品种。

草甘膦(glyphosate，Monsanto公司生产的草甘膦商品名为Roundup)是一种施用于叶面的广谱的、非选择性的有机膦类除草剂。它对于一年生和多年生杂草都有极强的控制能力。草甘膦特异性地抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙酰转移酶(EPSPS)的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途径中的一个酶，它可逆地催化S3P(shikimate-3-phosphate)和PEP(phosphoenopyrate)缩合成EPSP和无机膦。Monsanto公司将具有抗草甘磷除草剂能力的Cp4-EPSPS基因转入农作物中，使这些作物具有抗草甘磷能力。

转基因抗草甘膦大豆转化事件40－3－2中所用的载体PV-GMGT04

包括遗传成分的质粒图谱

转基因抗草甘膦大豆转质粒图谱

3、本实验通过特异性的扩增大豆的内标准基因Lectin和外源35S-CTP的片段来鉴别转基因大豆GTS40-3-2和非转基因大豆。在转基因大豆GTS40-3-2中含有Lectin和35S-CTP的特异性片段，而在非转基因大豆中只含有Lectin的特异性片段，因此通过Lectin和35S-CTP特异性片段的PCR扩增进行混合大豆样品中转基因大豆GTS40-3-2成分的鉴定。

三、试验材料

转基因大豆GTS40-3-2

非转基因大豆

混合大豆样品A和B

四、实验试剂：

（一）植物DNA提取和纯化试剂盒（捷瑞公司“植物基因组提取试剂盒”）Taq DNA聚合酶

10 X PCR反应缓冲液

2 mM dNTPs溶液

重蒸水

PCR引物: Lectin gene:

Lectin 1F: 5’ GGGTGAGGATAGGGTTCTCTG 3’

Lectin 2R: 5’ GCGATCGAGTAGTGAGAGTCG 3’

扩增片段长度: 210 bp

GTS40-3-2:

GTS40-3-2 1F: 5’ AAGATTAAGCTTCAACATGTGAAGGA 3’

GTS40-3-2 2R: 5’ CAGAGAGAGAAAATGGACGTGG 3’

扩增片段长度: 301 bp

琼脂糖

0.5 X TBE溶液

DL2000 DNA分子量标记

酚－氯仿

五、实验仪器：

恒温水浴锅

恒温箱

微量移液器、枪头

离心机

离心管

PTC-100 PCR扩增仪

电泳仪、电泳槽

凝胶成像系统

六、实验步骤：

（二）大豆样品DNA的提取和纯化

（三）具体的实验操作步骤：

1、取适量样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约70mg～100

mg磨碎的样品转入1.5ml 的Eppendorf管中；

2、视材料量的多少，加入600～700μl Buffer A，轻轻混匀后，65℃水浴保温

10min；

3、在管中加入等体积酚/氯仿（600～700μl），上下颠倒充分混匀，抽提2min；

4、12000 g离心5min，吸取上清到一新的Eppendorf管中；