实验4 氨基酸

实验4 氨基酸、蛋白质的主要化学性质一、目的要求用实验方法验证氨基酸、蛋白质的主要化学性质，增强感性认识。

二、原理α-氨基酸和蛋白质均含有α-氨基酰基R—CH—C—的结构，故都能与水合| ||NH2 O茚三酮作用生成兰紫色物质。

OC O HCC O H O +R C H C O O HN H2OCC H O HCO+N H3pH5100℃+R C H O C O2++N H3O CC H O H C +OH O CCH O COOCC CO OCCCON+3H2OOCC CO OCCCNO N H4CCCOOCCCON-+（蓝紫色）水合茚三酮N H3脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应不释放氨而直接生成黄色化合物。

蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故在碱性环境中能与硫酸铜结合成紫红色的络合物，此反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中若存在含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸等，当其与浓硝酸共热时，则变成黄色，这就是黄蛋白反应，若再继续加碱则颜色转变成橘黄色。

若蛋白质分子中具有含硫氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸等，则与碱及醋酸铅共热时，分解而产生硫离子，后者遇铅盐即生成黑色硫化铅沉淀。

蛋白质胶体是亲水胶体，若除去其质点上的水膜和电荷，蛋白质粒子则凝聚析出，这就是蛋白质的沉淀作用，使蛋白质胶体沉淀的方法有多种，常用的有下列几种：1、盐析法：加中性盐或硫酸铵等电解质试剂于蛋白质溶液中，这些电解质离子的水化能力比蛋白质强，可以夺去蛋白质粒子外围的水膜，并且蛋白质粒子外围的双电层又受到了压缩，也就是使其所带的电荷削弱，蛋白质胶体粒子由于失去两种使自己稳定的因素而沉淀。

2、有机溶剂的沉淀作用：水溶性的有机溶剂如乙醇、丙酮等，它们与水的亲和力大于蛋白质，因此能破坏蛋白质粒子的水膜，而使其沉淀析出。

3、生物碱试剂的沉淀反应：生物碱沉淀剂如三氯醋酸、若味酸、鞣酸等都能与蛋白质阳离子结成不溶性的盐而沉淀析出。

4、重金属离子的沉淀作用：某些重金属离子，如Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等，能与蛋白质阴离子结合成不溶性盐类而沉淀析出。

三、器材与试剂（一）器材电炉、烧杯、试管。

（二）试剂1%甘氨酸、5%蛋白质溶液、0.25%茚三酮水溶液、10%NaOH、1%硫酸铜、浓硝酸、2%醋酸铅、饱和硫酸铵溶液、95%乙醇、10%鞣酸溶液、饱和苦味酸。

四、实验步骤1、茚三酮反应在两支试管中，分别加入甘氨酸1ml和5%蛋白质溶液1ml，然后各加入0.25%茚三酮水溶液10滴，将试管放入沸水中加热几分钟，观察现象。

2、双缩脲反应向存有1ml 5%蛋白质溶液的试管中，加入10% NaOH 10滴。

充分摇匀，逐滴加入1% CuSO4数滴，观察试管中的颜色变化。

注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色Cu(OH)2，防碍此颜色反应的观察。

3、黄蛋白反应向一支盛有0.5ml 5%蛋白质溶液的试管中加入浓硝酸4滴，并加热，观察有何现象出现？然后再加入10% NaOH 1ml，观察有何变化？4、蛋白质中硫的鉴定取头发几根或指甲少许，并加10%NaOH 2ml 于试管内，煮沸2分钟，冷却后加入3～4滴2%Pb(Ac)2溶液，观察其现象，说明头发或指甲中有什么样的结构存在。

5、盐析作用取5%蛋白质溶液1ml于试管中，加入饱和硫酸铵溶液2ml，有何现象产生？再向试管中加入6ml左右的蒸馏水，振荡后又有何变化？6、有机溶剂的沉淀作用取5%蛋白质溶液1ml于试管中，再加95%乙醇2ml，充分混合，观察有无沉淀析出。

7、生物碱试剂的沉淀作用取2支试管，各加5%蛋白质溶液1ml，分别滴加10%鞣酸溶液5滴，饱和苦味酸5滴，有何现象产生？8、重金属离子的沉淀作用取2支试管，各加5%蛋白质溶液1ml，分别加入2%Pb(Ac)2，1%CuSO4各5滴，观察现象。

五、思考题1、蛋白质和氨基酸共同具有哪种颜色反应？为什么？2、哪种颜色反应可以用来检验蛋白质是否完全水解？实验5 蛋白质的两性反应和等电点测定一、目的要求了解蛋白质的两性性质，初步学会测定蛋白质等电点的方法。

二、原理蛋白质是由氨基酸所组成的，虽然绝大多数氨基酸的氨基与羧基已结合成为肽键，但是，总有一定数量的自由氨基与自由羧基，以及酚基、巯基、胍基和咪唑基等酸碱基团。

因此，蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质，具有两性反应。

调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷与负电荷相等，以兼性离子状态存在。

在电场中，该蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点（以pI表示）。

C O O-P rN H2C O O-P rH3+C O O HP rN H3+ H+O H-H+O H-阴离子 兼性离子 阳离子pH>pI pH=pI pH<pI在电场中：向阳极移动 不移动 向阴极移动在等电点时，蛋白质溶解度最小（为什么？）容易沉淀析出。

若配制体积相等的一系列不同pH值的缓冲溶液，在其中各加入等量的某蛋白质溶液，混匀后静置一段时间，观察并比较各管的混浊度，可知最混浊的那个试管中溶液pH即是该蛋白质的等电点。

三、器材与试剂（一）器材：1、试管2、试管架3、移液管1ml 2ml 5ml（二）试剂：1、0.5%酪蛋白溶液（以0.01 mol·L-1 NaOH作溶剂）2、0.04%溴甲酚绿指示剂，变色范围为pH3.8～5.4，酸式为黄色，碱式为兰色，中间式为绿色。

3、0.02 mol·L-1盐酸4、0.02 mol·L-1NaOH溶液。

5、0.5%酪蛋白的醋酸钠溶液，取纯酪蛋白0.25g置于50ml容量瓶中，加水约20ml及1 mol·L-1 NaOH 5ml，待酪蛋白完全溶解后，加入1 mol·L-1醋酸5ml，用水稀释到50ml，混匀，或将酪蛋白溶于0.1 mol·L-1 NaAc溶液中。

6、0.01 mol·L-1 HAc7、0.10 mol·L-1 HAc8、1.00 mol·L-1 HAc四、实验步骤（一）蛋白质的两性反应：1、取一支试管，加0.5%酪蛋白溶液1ml 和0.04%溴甲酚绿指示剂5滴，混匀，溶液呈什么颜色？为什么？2、用细滴管慢慢加入0.02 mol·L-1盐酸，随滴随摇，至有明显的大量沉淀产生时，这时溶液的pH值接近于酪蛋白的等电点，观察溶液颜色的变化。

3、继续滴加0.02 mol·L-1盐酸，有什么变化？为什么？溶液颜色有什么变化？说明什么？4、再滴入0.02 mol·L-1的氢氧化钠将第3步加的盐酸中和时，为什么又会出现沉淀？继续滴入0.02 mol·L-1氢氧化钠，又有什么变化？溶液颜色又怎样变化？说明了什么？（二）酪蛋白等电点的测定：1、取直径相似的干燥试管5支，按下表准确加入各种试剂：加毕摇匀，即配成不同氢离子浓度的缓冲液，各管内溶液的pH如表中所示。

静置约30分钟，观察各试管溶液的混浊度，以－、+、++、+++表示之。

注：该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确，实验中应严格按照定量分析的要求和操作进行。

根据实验观察结果，指出酪蛋白达到其等电点时溶液的pH值，并说明其原因。

五、思考题1、溴甲酚绿指示剂在实验中起什么作用？2、在蛋白质两性反应及酪蛋白等电点测定这两个实验中所用的酪蛋白溶液是不同的，它们有何区别？能否将它们对调使用？为什么？实验6 茚三酮法测定赖氨酸的含量一、目的要求掌握用茚三酮简易快速地测定赖氨酸的方法。

二、原理在pH 3以下，只有赖氨酸才能与茚三酮呈专一性显色反应，反应产物在475nm下有吸收峰，反应物颜色的深浅与赖氨酸的含量成正比。

采用这种比色方法可以快速简单地测定样品中的赖氨酸含量，测定范围在0.075～0.2mg/ml赖氨酸。

三、器材与试剂（一）器材721分光光度计、电炉、大试管10支移液管5ml×1，2ml×3，1ml×2（二）试剂1、茚三酮试剂称取茚三酮1.25g，加乙二醇甲醚94毫升。

1.7g CuCl2·2H2O溶于32ml 0.1mol/L柠檬酸，用HCl调至pH 1.3。

上述两种溶液混合后加蒸馏水至250ml。

2、标准赖氨酸母液（0.2mg/ml），称0.2g赖氨酸定容至1000ml。

四、实验步骤1、标准曲线的制作取7支试管，分别按下表加入各试剂管号赖氨酸含量（mg）标准赖氨酸母液（ml）H2O（ml）茚三酮试剂（ml）1 0 02 42 0.075 0.075 1.25 43 0.1 1.0 1 44 0.125 1.25 0.75 45 0.15 1.5 0.5 46 0.175 1.75 0.25 47 0.2 2.0 0 4沸水浴20分钟，使赖氨酸显色，冷却后用721分光光度计测定475nm处的光密度，以赖氨酸浓度为横座标，OD475nm为纵座标绘制标准曲线。

2、样品测定取两根试管分别加赖氨酸待测定（赖氨酸含量约为0.075~0.2mg/ml）2ml，加茚三酮试剂4ml，以后步骤同上，测得OD475nm，然后从标准曲线上查出赖氨酸的含量。

五、注意点该法是一个简单快速的测定方法，标准曲线不通过原点，在赖氨酸浓度为0.075～0.02mg/ml范围内有线性关系。

实验8 蛋白质浓度测定（二）Lowry蛋白质测定法一、目的要求1、学习和掌握Lowry蛋白质测定法的原理和操作方法。

2、进一步熟悉和掌握721分光光度计的使用方法。

二、原理Lowry法测定蛋白质浓度是目前应用最广泛的一种方法：该方法是双缩脲方法的发展，是结合了福林蛋白质定量法的敏锐性和双缩脲法的优点和改良法。

第一步是在碱性条件下，蛋白质-铜复合物的形成；第二步是这个复合物中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸等还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质，在一定条件下，蓝色强度与蛋白质含量成正比。

因此，利用一标准蛋白质配制成各种浓度，经Lowry反应后，在660nm测定各浓度下的颜色强度，然后以A660为纵坐标，以标准蛋白含量为横坐标，作出标准曲线，待测蛋白样品在相同条件下操作，根据A值从标准曲线查得蛋白质含量。

三、器材与试剂（一）器材1、结晶牛血清白蛋白（生化试剂）2、试管：1.5×15cm（×13）3、吸管：0.5ml（×1），1ml（×3），5ml（×1）4、721分光光度计（二）试剂1、标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白溶解于蒸馏水，浓度250微克/毫升。

2、试剂甲：（A）10克碳酸钠，2克氢氧化钠和0.25克酒石酸钾（或钠）溶解于500ml蒸馏水中。

（B）0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100克毫升蒸馏水中。