实验4 氨基酸

实验4 氨基酸、蛋白质的主要化学性质一、目的要求
用实验方法验证氨基酸、蛋白质的主要化学性质，增强感性认识。

二、原理
α-氨基酸和蛋白质均含有α-氨基酰基R—CH—C—的结构，故都能与水合
| ||
NH2 O
茚三酮作用生成兰紫色物质。

O
C O H
C
C O H O +R C H C O O H
N H
2
O
C
C H O H
C
O
+N H
3
pH5
100℃
+R C H O C O
2
+
+N H
3
O C
C H O H C +
O
H O C
C
H O C
O
O
C
C C
O O
C
C
C
O
N+3H2O
O
C
C C
O O
C
C
C
N
O N H
4
C
C
C
O
O
C
C
C
O
N
-+
（蓝紫色）
水合茚三酮
N H
3
脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应不释放氨而直接生成黄色化合物。

蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故在碱性环境中能与硫酸铜结合成紫红色的络合物，此反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中若存在含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸等，当其与浓硝酸共热时，则变成黄色，这就是黄蛋白反应，若再继续加碱则颜色转变成橘黄色。

若蛋白质分子中具有含硫氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸等，则与碱及醋酸铅共热时，分解而产生硫离子，后者遇铅盐即生成黑色硫化铅沉淀。

蛋白质胶体是亲水胶体，若除去其质点上的水膜和电荷，蛋白质粒子则凝聚析出，这就
是蛋白质的沉淀作用，使蛋白质胶体沉淀的方法有多种，常用的有下列几种：
1、盐析法：
加中性盐或硫酸铵等电解质试剂于蛋白质溶液中，这些电解质离子的水化能力比蛋白质强，可以夺去蛋白质粒子外围的水膜，并且蛋白质粒子外围的双电层又受到了压缩，也就是使其所带的电荷削弱，蛋白质胶体粒子由于失去两种使自己稳定的因素而沉淀。

2、有机溶剂的沉淀作用：
水溶性的有机溶剂如乙醇、丙酮等，它们与水的亲和力大于蛋白质，因此能破坏蛋白质粒子的水膜，而使其沉淀析出。

3、生物碱试剂的沉淀反应：
生物碱沉淀剂如三氯醋酸、若味酸、鞣酸等都能与蛋白质阳离子结成不溶性的盐而沉淀析出。

4、重金属离子的沉淀作用：
某些重金属离子，如Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等，能与蛋白质阴离子结合成不溶性盐类而沉淀析出。

三、器材与试剂
（一）器材
电炉、烧杯、试管。

（二）试剂
1%甘氨酸、5%蛋白质溶液、0.25%茚三酮水溶液、10%NaOH、1%硫酸铜、浓硝酸、2%醋酸铅、饱和硫酸铵溶液、95%乙醇、10%鞣酸溶液、饱和苦味酸。

四、实验步骤
1、茚三酮反应
在两支试管中，分别加入甘氨酸1ml和5%蛋白质溶液1ml，然后各加入0.25%茚三酮水溶液10滴，将试管放入沸水中加热几分钟，观察现象。

2、双缩脲反应
向存有1ml 5%蛋白质溶液的试管中，加入10% NaOH 10滴。

充分摇匀，逐滴加入1% CuSO4数滴，观察试管中的颜色变化。

注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色Cu(OH)2，防碍此颜色反应的观察。

3、黄蛋白反应
向一支盛有0.5ml 5%蛋白质溶液的试管中加入浓硝酸4滴，并加热，观察有何现象出现？然后再加入10% NaOH 1ml，观察有何变化？
4、蛋白质中硫的鉴定
取头发几根或指甲少许，并加10%NaOH 2ml 于试管内，煮沸2分钟，冷却后加入3～4滴2%Pb(Ac)2溶液，观察其现象，说明头发或指甲中有什么样的结构存在。

5、盐析作用
取5%蛋白质溶液1ml于试管中，加入饱和硫酸铵溶液2ml，有何现象产生？再向试管中加入6ml左右的蒸馏水，振荡后又有何变化？
6、有机溶剂的沉淀作用
取5%蛋白质溶液1ml于试管中，再加95%乙醇2ml，充分混合，观察有无沉淀析出。

7、生物碱试剂的沉淀作用
取2支试管，各加5%蛋白质溶液1ml，分别滴加10%鞣酸溶液5滴，饱和苦味酸5滴，有何现象产生？
8、重金属离子的沉淀作用
取2支试管，各加5%蛋白质溶液1ml，分别加入2%Pb(Ac)2，1%CuSO4各5滴，观察现象。

五、思考题
1、蛋白质和氨基酸共同具有哪种颜色反应？为什么？
2、哪种颜色反应可以用来检验蛋白质是否完全水解？
实验5 蛋白质的两性反应和等电点测定
一、目的要求
了解蛋白质的两性性质，初步学会测定蛋白质等电点的方法。

二、原理
蛋白质是由氨基酸所组成的，虽然绝大多数氨基酸的氨基与羧基已结合成为肽键，但是，总有一定数量的自由氨基与自由羧基，以及酚基、巯基、胍基和咪唑基等酸碱基团。

因此，蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质，具有两性反应。

调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷与负电荷相等，以兼性离子状态
存在。

在电场中，该蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点（以pI表示）。

C O O-P r
N H
2
C O O-
P r
H
3
+
C O O H
P r
N H
3
+ H+
O H-
H+
O H-
阴离子 兼性离子 阳离子
pH>pI pH=pI pH<pI
在电场中：
向阳极移动 不移动 向阴极移动
在等电点时，蛋白质溶解度最小（为什么？）容易沉淀析出。

若配制体积相等的一系列不同pH值的缓冲溶液，在其中各加入等量的某蛋白质溶液，混匀后静置一段时间，观察并比较各管的混浊度，可知最混浊的那个试管中溶液pH即是该蛋白质的等电点。

三、器材与试剂
（一）器材：
1、试管
2、试管架
3、移液管1ml 2ml 5ml
（二）试剂：
1、0.5%酪蛋白溶液（以0.01 mol·L-1 NaOH作溶剂）
2、0.04%溴甲酚绿指示剂，变色范围为pH3.8～5.4，酸式为黄色，碱式为兰色，中间
式为绿色。

3、0.02 mol·L-1盐酸
4、0.02 mol·L-1NaOH溶液。

5、0.5%酪蛋白的醋酸钠溶液，取纯酪蛋白0.25g置于50ml容量瓶中，加水约20ml及1 mol·L-1 NaOH 5ml，待酪蛋白完全溶解后，加入1 mol·L-1醋酸5ml，用水稀释到50ml，混匀，或将酪蛋白溶于0.1 mol·L-1 NaAc溶液中。

6、0.01 mol·L-1 HAc
7、0.10 mol·L-1 HAc
8、1.00 mol·L-1 HAc
四、实验步骤
（一）蛋白质的两性反应：
1、取一支试管，加0.5%酪蛋白溶液1ml 和0.04%溴甲酚绿指示剂5滴，混匀，溶液呈什么颜色？为什么？
2、用细滴管慢慢加入0.02 mol·L-1盐酸，随滴随摇，至有明显的大量沉淀产生时，这时溶液的pH值接近于酪蛋白的等电点，观察溶液颜色的变化。

3、继续滴加0.02 mol·L-1盐酸，有什么变化？为什么？溶液颜色有什么变化？说明什么？
4、再滴入0.02 mol·L-1的氢氧化钠将第3步加的盐酸中和时，为什么又会出现沉淀？继续滴入0.02 mol·L-1氢氧化钠，又有什么变化？溶液颜色又怎样变化？说明了什么？
（二）酪蛋白等电点的测定：
1、取直径相似的干燥试管5支，按下表准确加入各种试剂：
加毕摇匀，即配成不同氢离子浓度的缓冲液，各管内溶液的pH如表中所示。

静置约30分钟，观察各试管溶液的混浊度，以－、+、++、+++表示之。

注：该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确，实验中应严格按照定量分析的要求和操作进行。

根据实验观察结果，指出酪蛋白达到其等电点时溶液的pH值，并说明其原因。

五、思考题
1、溴甲酚绿指示剂在实验中起什么作用？
2、在蛋白质两性反应及酪蛋白等电点测定这两个实验中所用的酪蛋白溶液是不同的，它们有何区别？能否将它们对调使用？为什么？
实验6 茚三酮法测定赖氨酸的含量
一、目的要求
掌握用茚三酮简易快速地测定赖氨酸的方法。

二、原理
在pH 3以下，只有赖氨酸才能与茚三酮呈专一性显色反应，反应产物在475nm下有吸收峰，反应物颜色的深浅与赖氨酸的含量成正比。

采用这种比色方法可以快速简单地测定样品中的赖氨酸含量，测定范围在0.075～0.2mg/ml赖氨酸。

三、器材与试剂
（一）器材
721分光光度计、电炉、大试管10支
移液管5ml×1，2ml×3，1ml×2
（二）试剂
1、茚三酮试剂
称取茚三酮1.25g，加乙二醇甲醚94毫升。

1.7g CuCl2·2H2O溶于32ml 0.1mol/L柠檬酸，用HCl调至pH 1.3。

上述两种溶液混合后加蒸馏水至250ml。

2、标准赖氨酸母液（0.2mg/ml），称0.2g赖氨酸定容至1000ml。

四、实验步骤
1、标准曲线的制作
取7支试管，分别按下表加入各试剂
管号赖氨酸含量（mg）标准赖氨酸母液（ml）H2O（ml）茚三酮试剂（ml）
1 0 0
2 4
2 0.075 0.075 1.25 4
3 0.1 1.0 1 4
4 0.12
5 1.25 0.75 4
5 0.15 1.5 0.5 4
6 0.175 1.75 0.25 4
7 0.2 2.0 0 4
沸水浴20分钟，使赖氨酸显色，冷却后用721分光光度计测定475nm处的光密度，以赖氨酸浓度为横座标，OD475nm为纵座标绘制标准曲线。

2、样品测定
取两根试管分别加赖氨酸待测定（赖氨酸含量约为0.075~0.2mg/ml）2ml，加茚三酮试
剂4ml，以后步骤同上，测得OD475nm，然后从标准曲线上查出赖氨酸的含量。

五、注意点
该法是一个简单快速的测定方法，标准曲线不通过原点，在赖氨酸浓度为0.075～0.02mg/ml范围内有线性关系。

实验8 蛋白质浓度测定（二）
Lowry蛋白质测定法
一、目的要求
1、学习和掌握Lowry蛋白质测定法的原理和操作方法。

2、进一步熟悉和掌握721分光光度计的使用方法。

二、原理
Lowry法测定蛋白质浓度是目前应用最广泛的一种方法：该方法是双缩脲方法的发展，是结合了福林蛋白质定量法的敏锐性和双缩脲法的优点和改良法。

第一步是在碱性条件下，蛋白质-铜复合物的形成；第二步是这个复合物中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸等还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质，在一定条件下，蓝色强度与蛋白质含量成正比。

因此，利用一标准蛋白质配制成各种浓度，经Lowry反应后，在660nm测定各浓度下的颜色强度，然后以A660为纵坐标，以标准蛋白含量为横坐标，作出标准曲线，待测蛋白样品在相同条件下操作，根据A值从标准曲线查得蛋白质含量。

三、器材与试剂
（一）器材
1、结晶牛血清白蛋白（生化试剂）
2、试管：1.5×15cm（×13）
3、吸管：0.5ml（×1），1ml（×3），5ml（×1）
4、721分光光度计
（二）试剂
1、标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白溶解于蒸馏水，浓度250微克/毫升。

2、试剂甲：
（A）10克碳酸钠，2克氢氧化钠和0.25克酒石酸钾（或钠）溶解于500ml蒸馏水中。

（B）0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100克毫升蒸馏水中。

每次使用前取（A）50份与（B）1份混合，即为试剂甲。

试剂乙：
在1.5升容积的磨口瓶中加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700ml蒸馏水，再加50ml 85%磷酸，100ml浓盐酸充分混合，接上回流冷凝管以小火回流10小时，回流结束后，加入150g硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色，微带绿色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。

稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用时用标准氢氧化钠滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（加水约1倍）使最终浓度为1N酸。

四、实验步骤
1、标准曲线制作
称取牛血清白蛋白2.5毫克溶解于10毫升蒸馏水中，使成250微克/毫升。

取6支试管，按下表顺序加入各试剂。

加入试剂甲5毫升，混合后室温放置10分钟，再加入0.5毫升试剂乙，并立即混合均匀（这一步混合速度要快，否则会使显色强度减弱）。

30分钟后以不含蛋白质但试剂量相同的1号管为空白，在721分光光度计上，测定A660。

以A660蛋白含量作标准曲线。

2、样品测定
取待测样品1.0ml（约含25~250μg蛋白质），按制作标准曲线的相同条件和步骤加入各试剂，然后测定样品的A660nm，由A660nm值查标准曲线，求得蛋白质含量，再乘以稀释倍数，即得样品的蛋白质含量值，以μg/ml表示。

样品测定同时做两份。

五、优、缺点及注意点
1、优点
操作简便，灵敏度高（为双缩脲法的100倍），可测定范围是25~250微克蛋白质。

2、缺点
有蛋白质特异性的影响，即不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度不同，标准曲线也不是严格的直线形式。

3、注意点
（1）干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如：Tris·Good缓冲剂，它们常常给予阳性呈色反应，各种硫醇存在容易得出错误结果。

（2）乙试剂（Folin酚试剂）显色反应的最适条件是在碱性条件下，但是，在这种pH
下，乙试剂是不稳定的，只有极短的时间有此反应，因此，即使搅拌数秒钟也会使显色性降低。

六、思考题
1、空白溶液的作用是什么？
2、加入乙试剂后为什么必须立即混合均匀？
3、如何正确使用721分光光度计？
实验9 蛋白质浓度测定（三）
考马斯亮蓝显色法
一、目的要求
1、学习和掌握考马斯亮蓝显色法测定蛋白质浓度的原理和操作方法。

2、进一步熟悉和掌握721分光光度计使用方法。

二、原理
考马斯亮蓝显色法是Bradford于1976年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法。

因此又称为Bradford方法，该方法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250定量结合。

当考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm变为595nm。

在考马斯亮蓝G-250过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250从吸收峰为465nm的形式转变成吸收峰为595nm的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

长期以来，人们一直习惯用Lowry法来测定蛋白质浓度，但近年来，越来越多的人开始用考马斯亮蓝G-250显色法来测定蛋白质浓度，与Lowry法相比，该方法具有下列优点：①方法简单，只需一种显色液。

②反应迅速，只需一步反应，显色可在5 min之内完成。

③干扰少，许多被认为对Lorwy法有干扰的物质（如糖、缓冲液、还原剂和络合剂）不影响该方法。

尽管该方法有如此多的优点，但在实际应用中也有其缺点，如线性关系不很好，因此使用该方法测定蛋白质浓度时应特别注意。

三、器材与试剂
（一）器材
1、试管：15×1.5cm 13支
2、移液管：0.5ml 1支1ml 3支5ml 1支
721分光光度计
（二）试剂
1、标准蛋白质溶液：牛血清白蛋白溶解于蒸馏水，配成浓度为250mg/L。

2、考马斯亮蓝显色液的配制：0.12g考马斯亮蓝G-250溶解在100 ml 95%的乙醇中，
加少量蒸馏水后加100ml 85%的磷酸，然后用蒸馏水定容至1升，即为显色液。

四、实验步骤
1、标准曲线的制作
取6支洁净干燥的试管按下表顺加入试剂
管号加入H2O
的量（ml）
加入标准蛋
白溶液的量
(ml)
试管中的蛋
白质总量
(μg)
考马斯亮
蓝显色液
(ml)
Abs595nm
1 1.0 0 0 5
2 0.8 0.2 50 5
3 0.6 0.
4 100 5
4 0.4 0.6 150 5
5 0.2 0.8 200 5
6 0 1.0 250 5
所有试剂加入后混匀，可立即在721分光光度计上测定595nm处的吸光度（Abs595nm），以蛋白质浓度为横座标，Abs595nm为纵座标作图制作标准曲线。

2、样品测定
在做标准曲线的同时，取另一支试管加入1ml待测样品，然后加入5ml考马斯亮蓝显色液，混匀后测定Abs595nm。

由Abs595nm值从标准曲线中查出待测样品中的蛋白质浓度。

为了提高待测样品结果的准确性，可同时对待测样品做一重复。

实验10 蛋白质浓度测定（四）
紫外线吸收法
一、目的要求
1、了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。

2、了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。

二、原理
由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm处。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。

此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。

不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。

但可作为初步定量的依据。

三、器材与试剂
（一）器材
紫外分光光度计，试管和试管架，吸量管。

（二）试剂
（1）标准蛋白溶液：
准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/ml的溶液。

（2）待测蛋白溶液：配制成浓度约为1mg/ml的溶液。

四、实验步骤
（一）标准曲线法
1、标准曲线的绘制
按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。

选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm 波长处分别测定各管溶液的A280值。

以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2、样品测定
取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白质溶液（ml ）
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水（ml ） 4.0 3.5
3.0
2.5
2.0 1.5 1.0 0 蛋白质浓度（mg/ml ）
0 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.00 A 280
（二）其他方法
1、将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm 和280nm 处分别测出A 值，然后利用280nm 及260nm 下的吸收差求出蛋白质的浓度。

计算
蛋白质浓度（mg/ml ）=1.45 A 280-0.74 A 260
式中 A 280和A 260分别是蛋白质溶液在280nm 和260nm 波长下测得的光吸收值。

280260 此外，也可先计算出A 280/ A 260的比值后，从上表中查出校正因子“F”，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将“F”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。

1m g/m l)=F A 280N
d
⨯
⨯⨯蛋白质浓度（
式中A 280为该溶液在280nm 下测得的光吸收值；d 为石英比色杯的厚度（cm ）；N 为溶液的稀释倍数。

2、对于稀蛋白质溶液，还可用215nm 和225nm 的吸收差来测定浓度。

从吸收差ΔA 与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。

吸收差ΔA＝A215－A225
式中的A215和A225分别是蛋白质溶液在215nm和25nm波长下测得的光吸收值。

此法在蛋白质含量达20～100μg·L-1的范围内，是服从Beer定律的。

氯化钠、硫酸铵以及0.1mol·L-1磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。

但是0.1 mol·L-1乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm波长下的吸收较大，不能应用，必须应用紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与标准曲线制订时的pH一致。

3、如果已知某一蛋白质在280nm波长处的吸收值[A1cm1%]，则取该蛋白质溶液于280nm 处测定光吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。

五、思考题
1、本法与其它测定蛋白质含量法相比，有哪些优缺点？
2、若样品中含有干扰测定的杂质，应如何校正实验结果？。