羟基磷灰石的使用方法

羟基磷灰石的使用方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

羟基磷灰石填料

——纯化蛋白、多肽、核酸

分离机理：羟基磷灰石具有独特的分离机理，是唯一直接用于蛋白质和核酸纯化的无机层析填料，高度耐碱，生物安全性最高。其中磷酸离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换特性，可由NaCl浓度梯度或磷酸钠浓度梯度洗脱，其中的Ca2＋离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合，该结合方式对NaCl不敏感，可由磷酸钠浓度梯度洗脱。因此该填料既可以用磷酸钠单梯度洗脱，也可以采用NaCl梯度洗脱后以低浓度磷酸钠缓冲液平衡，再以磷酸钠浓度梯度洗脱的双梯度洗脱模型，以达到更高的分辨率。

羟基磷灰石类型选择：羟基磷灰石因陶瓷化工艺不同分为2种类型：I型和II 型，I型对蛋白质具有更大的保留，对普通蛋白质具有更大的动态载量，主要纯化大部分蛋白质（分子量一般在100kd一下）；II型由于孔径较I型大，因而对抗体和部分重组疫苗等大分子量蛋白质的动态载量更高，而对HSA几乎无保留，因而更适合于抗体的纯化，同时II型对核酸具有更大的保留，能够分辩单、双链、超螺旋等各种高级结构的DNA，因而也适合纯化核酸。

●高动态载量、高流速、高产率

●更好的化学稳定性和机械强度，更长的寿命

●刚性结构，保证了其在PH>的范围内使用，可用NaOH清洗

●良好的批次重现性，容易放大化

●可随意选用阳离子和金属螯合两个模式分离纯化蛋白或其他分子

●能用于层析系统、重力流柱、AcroPrep多孔板等

应用

●碱性蛋白的纯化（免疫球蛋白）

●抗体纯化

●酸性蛋白（白蛋白）

●去除DNA和内毒素

●纯化磷多肽

●分离纯化复杂的蛋白混合物

●纯化质粒

流动相：平衡液：5mM的磷酸钠缓冲液，PH=

洗脱液：的磷酸钠缓冲液，或2M的氯化钠缓冲液，PH=

使用步骤：建议使用干法填柱

Step 1:setup take a cell lysate and draw it into the syringe through the tubing tip Draw any residual sample into syringe

Attach syringe and tubing tip to a pre-equilibrated

Bio-canal column

步骤1：平衡安装

首先用至少5倍柱体积的平衡液预平衡柱子，将细胞裂解吸入注射器，并安装在柱头上。

Step 2:binding sample

Slowly load the lysate onto the column

The proteins will bind to the resin and non-proteins will flow through the column 步骤2：上样

将细胞裂解液慢慢注入柱子中，蛋白会结合在柱子中的填料中，非蛋白将会流出柱子

Step 3:washing column

After loading the column,add a syringe with wash buffer

Wash any remaining non-specifically bound proteins off the column with wash buffer

(collect fraction3 if needed)

步骤3：淋洗柱子

上样后，用淋洗液（一般为平衡液）将所有的非蛋白清洗分离出柱子。如果上样量超出柱子的载样量，如果需要，可以考虑收集。

Step 4:elution

Attach a syringe with elution buffer

Slowly elute your protein with elution buffer

This will allow you to capture>90% of your protein in the first elution fraction

步骤4：洗脱

选择合适的洗脱液，用注射器将目标蛋白洗脱并收集，如果需要，可以自行配制不同浓度梯度的洗脱液进行必要的梯度洗脱。

保存：长时间应保存在1MNaOH溶液中，至于室温密封保存

注意：长时间保存在1MNaOH溶液中的层析柱，上样前一定注意PH值，建议使用洗脱液将PH值洗下来，再使用平衡溶液平衡后上样。

建议使用标准层析设备（如AKTA）以达到更好的分离纯化效果