第三章 石蜡制片实例

实验日程表(固定-包埋)
日期（日/月 ）
第一天 /
时间
上午任何时间 下午2:00-5:00
步骤 70%乙醇(4h)-85%乙醇(3h)-95%伊红乙醇（含伊红1%)(过夜)
第二天 / 上午8:00-11:30 无水乙醇(1.5h)-无水乙醇(2.5h)-1/5氯仿,12/5氯仿,3/5氯仿,每次吸出
五、子房纵切片制片法
目的：观察子房和胚珠的结构、大孢子发生、雌配子体发育、受 精过程、胚和胚乳发育。
材料：蚕豆子房（油菜子房、拟南芥子房也可以用此方法制片）。 染色方法：铁矶苏木精切片染色，1%伊红乙醇复染。
丝兰子房横切，
局部放大，示1个心皮中的2个胚珠；
丝兰胚珠的结构（摄影：冯燕妮）
第五天 / 第六天 /
上午8:00-11:30 下午2:00-5:00
蒸馏水过一遍，15%乙醇(3h)-30%乙醇(2h)-50%乙醇(2h)-70%乙醇(过夜)
上午8:00-11:30 下午12:30-4:00
85%乙醇(1h)-95%乙醇(1h)-无水乙醇(1h)-无水乙醇(1h)-1/5氯仿，2/5氛仿，3/5氯仿， 4/5氯仿，每次吸出一格溶液，加人一格纯氯仿(间隔0.5h)-吸出瓶内全部氯仿，加入新氯
制片效果：核紫红色，其余浅红色。
制片步骤
1.取样：12月至翌春2月采油菜苗剥除叶片，只留下极小的茎端，切取茎端约0.5〜0.6 cm长的部位，即 为被小的幼叶所包裹的花芽。 2.固定：FAA液中固定24 h，可保存其中备用。 3.整染：经70%、50%乙醇各2〜4 h，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木精原液1份+50%乙醇及乙酸各 半的混合液1份）中整染2〜3 d。 4.水洗、返蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色，再转入自来水，换1〜2次水，至样品由紫色变为深蓝 色为止，共需时约1 d。 5.脱水及复染：经30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇，每级3〜4 h。含0.5%〜%伊红的95%乙 醇中4〜6 h (可过夜），无水乙醇2次，每次2 h。 6.透明、加蜡：5级氯仿透明，每级2〜4 h，纯氯仿2次，每次2 h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1 d。 7.透蜡、包埋：经50%蜡、75%蜡各3 h，再经纯蜡A、B、C三杯各 1 h，包埋。 8.修蜡块、切片：纵切花芽，切片厚度8 μm。 9.展片、粘片、烘干：镜检选取花芽中轴的蜡片进行粘片，每张载玻片上粘1〜2 个蜡片。展片后将材 料平放在摊片盘上，放置36 ℃温箱中烘干。 10.脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各一次。 11.封片、烘片：加拿大树胶封片。封片后将材料平放在摊片盘上，36℃温箱内烤数天（或自然干燥）。
隔3h）
4/5氯仿,吸出一格溶液，加入一格纯氯仿(2h)-吸出 瓶内全部氯仿，再加入新氯仿(重复，间隔2h)-加碎
蜡（间隔1h)于新氯仿，置36℃温箱中(2-4d)
50%蜡置40〜42℃温箱中(3h)-75%蜡置48〜50℃温箱 中(3h)-纯蜡A杯/B杯/C杯置56〜58℃温箱中(间隔
1h)-纯蜡包埋
制片效果：细胞核紫蓝色，其余部分淡红色。
小麦子房纵切面 A.示孢原细胞； B.大孢子母细胞时期； C.大孢子四分体时期； D.四分体的3个大孢子退化,1 个继续发育 ；E.单核胚囊（大孢子）； F.二核胚囊； G.四核胚囊； H.示2个助细胞； I.示3个反足细胞； J.示 2个极核 ； K.成熟胚囊示1个卵细胞； L.成熟胚囊示反足细胞群（摄影：冯燕妮）
三、叶横切片制片法
用于一般根、茎、叶、花药、子房等切片 目的：观察双子叶植物叶的结构。 材料：棉花叶片（南瓜茎、菊芋茎也可以用此方法。 染色方法：苯胺番红、苯胺固绿双重染色。
制片效果：厚壁组织、导管、细胞核红色，其余部分为绿色。
制片步骤
1.取样：取完全成熟棉叶，用单面刀片沿主脉两侧各5〜6 mm处切开，将中央有叶脉的部分再横切成5 mm的小段。 2.固定：FAA液中固定24 h，并保存于固定液中。 3.脱水：70%/85%乙醇(各3~4h)，含0.5%〜1%伊红的95%乙醇 3〜4 h (可过夜），无水乙醇2次（各1〜2 h）。 4.透明、加蜡：5级氯仿透明(每级3〜4 h)，纯氯仿2次(每次2 h)，加碎蜡，置36 ℃温箱1〜2 d。 5.透蜡、包埋：50%蜡、75%蜡各3 h，纯蜡A、B、C三杯，每杯lh， 包埋时将叶片直立。 6.修块、切片：修蜡块时使叶片直立于台木上，并用单面刀片切除先端石蜡， 浸水软化后放在切片机上作叶的横 切面，切片厚度12 μm。 7.展片、粘片、烘干：切片先镜检，每张载玻片放2个蜡片，展片后平放在摊片盘上，36 ℃温箱中烘干。 8.脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。 9.染色（番红一固绿双重染色）：在已脱蜡的材料上滴注无水乙醇、95%乙醇、 85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、 30%乙醇、蒸馏水各约4〜5 s，苯胺番红染色5〜10 min，用蒸馏水洗去浮色。 10.脱水、透明：各级乙醇脱水（30%、50%、70%、85%、95%乙醇），苯胺固绿复染30〜40 s，再经95%乙醇， 无水乙醇、1/2无水乙醇+1/2 二甲苯、二甲苯（2次）各约4〜5s，最后置二甲苯缸中。 11.封片、烘片：加拿大树胶封片。封片后将材料平放在摊片盘上，36 ℃温箱内烤数天（或自然干燥）。 12.镜检。
南瓜茎导管、筛管纵切
南瓜茎导管、筛管横切 南瓜茎导管、筛管横切局部放大
制片效果：厚壁组织、导管、细胞核红色，其余部分绿色。
制片步骤
1.取样：锋利刀片将南瓜茎切成小段，横切:0.8cm，纵切:lcm，选髓腔较小样品，便于切片。 2.固定：FAA固定24 h，抽气，并保存于固定液中。 3.软化：经70%乙醇、50%乙醇2〜4 h降至蒸馏水，15%氢氟酸中软化10〜15 d。 4.水洗：自来水流水冲洗24 h，蒸馏水浸洗6 h。 5.整染：苯胺番红中染色48 h。 6.脱水：经30%-50%-70%-85%-95%乙醇，每级3〜4 h， 无水乙醇2次，每次1.5〜3 h。 7.透明、加蜡：5级氯仿透明(每级3〜4h)，纯氯仿2次(每次2h)，加碎蜡2次，置36℃温箱2〜4 d。 8.透蜡、包埋：50%/75%蜡各3 h，纯蜡A/B/C(每杯lh)。包埋时:横切样品竖放，纵切样品卧放。 9.修蜡块、切片：横切片厚度15 μm，纵切片厚度20μm，切前浸水软化。 10.展片、粘片、烘干：每张载玻片粘1个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘，36℃温箱中烘干。 11.脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。 12.复染、脱水及透明：滴注无水乙醇、95%乙醇各4〜5 s，苯胺固绿约0.5〜1 min,再经95%乙 醇、1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯（2次）各约4〜5s，最后置于二甲苯缸中。 13.封片、烘片：加拿大树胶封片后平放在摊片盘上，36℃温箱烤数天（自然干燥）。 14.镜检。
第三章 石蜡切片实例
常规石蜡切片步骤
•取材（新鲜、特定时期） •固定（FAA、卡诺固定，70%酒精长期保存） •脱水（不同梯度酒精） •透明（二甲苯、氯仿） •浸蜡（石蜡熔点不同，温箱浸蜡温度不同，二甲苯过渡） •包埋（包埋盒（快、准、一次到位）） •切片（修块、切片、捞片、展片、贴片，42~50℃水浴，37℃过夜） •脱蜡（脱蜡彻底，时间宁长勿短） •染色（每种2min, 大约15-20min）（60℃烤箱15min，脱色效果较好） •脱水（伊红染液，二甲苯等每种3-5min，） •透明 （二甲苯） •封片（加拿大树胶、中性树胶，胶量适宜） •显微观察
实验日程表(固定-包埋)
日期（日/月） 第一天 /
时间
第十一天 / 第十二天 / 第十五天 /
下午2:00-5:00 下午5:00
第十六天 / 第十七天 /
上午8:00-11:30 下午2:00-5:00 上午8:00-11:30 下午2:00-5:00
第十八天 / 上午8:00-11:30 下午2:00-4:30
下午2:00-5:00
一格溶液，加入一格纯氯仿，间隔3h,3/5氯仿过夜
第三天
/
上午8:00-11:30 4/5氯仿,吸出一格，加入一格纯氯仿(2h)-纯氯仿,吸出瓶内全部氯仿，再 下午2:00-30 4:30 加入新氯仿(重复，间隔2h)-加碎蜡（间隔1h)于新氯仿，置36℃温箱中
第五天 /
上午8:30-11:30 下午2:00-4:30
50%蜡置40〜42℃温箱中(3h)-75%蜡置48〜50℃温箱中(3h)-纯蜡A杯/B杯 /C杯置56〜58℃温箱中(间隔1h)-纯蜡包埋
植物双受精示意图
四、花芽纵切片制片法
目的：观察花芽分化过程中各期的形态特征。 材料：油菜花芽（桃花芽、拟南芥花芽也可以用此方法制片）。 染色方法：爱氏苏木精整体染色，伊红复染。
上午8:00-11:30 下午2:00-4:30 第二十天 /
步骤 样品取材、固定，转至蒸馏水，入15%氢氟酸软化
10-15 d
流水冲洗除酸液
蒸馏水换数次（0.5h）、苯胺番红整染
30%乙醇 50%乙醇(2.5h)-70%乙醇(2.5h)-85%乙醇(2.5h)-95%
乙醇 无水乙醇(1.5h)-无水乙醇(1.5h)-1/5氯仿,2/5氯仿 ,3/5氯仿(每次吸出一格溶液，加人一格纯氯仿，间
仿(重复，间隔30min)-加碎蜡（重复，间隔30min）置36℃温箱中
第七天
Leabharlann Baidu
/
上午8:00-11: 00
50%蜡置40〜42℃温箱(1h)-75%蜡置48〜50℃温箱中(0.5h)-纯蜡A杯/B杯/C杯置56〜58℃ 温箱中(间隔0.5h)，纯蜡包埋
二、茎的纵、横切片制片法
目的：观察茎的结构、各种组织的特征及维管束的组成。 材料：南瓜茎、禾本科植物茎。 染色方法：苯胺番红整染—苯胺固绿复染。
一、根尖纵切片制片法
目的：观察根尖分区细胞的特征及细胞有丝分裂过程。 材料：洋葱根尖。 染色方法：爱氏苏木精整染。
制片效果：核仁与染色质为深蓝色，其余浅蓝色。
制片步骤
1.取样：9〜10月中旬培养/取样，将洋葱鱗茎搁置盛满自来水的玻璃瓶口上，基部接触水面，室温24 h即可生根， 根长至1. 5〜2 cm时切取根尖约0. 8cm固定。每天取根后换水，直至洋葱鳞茎不再发新根。 2.固定：铬酸乙酸液固定24 h。 3.保存：经固定的根尖换入蒸馏水浸洗约24 h，勤换水，以去尽酸液。后经15%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70% 乙醇脱水，每级2〜4 h，并保存于70%乙醇中备用。 4. 整染：50%乙醇2〜4 h，入爱氏苏木精稀释液（原液1份+50%乙醇与乙酸等量混合液1份）整染2〜3 d。 5. 水洗、返蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色，再换入自来水1〜2 次，至根尖由紫色变为深蓝色，约24 h。 6.镜检及分色：取一根尖置载玻片上用刀片切碎后，加1滴水，覆以盖玻片，进行镜检，要求染色体、核仁清晰。 如果发现染色过度，如细胞核为一团深蓝色，则需以 1%盐酸或45%乙酸分色至适度，再用水洗净。 7.脱水：经15%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇，每级2〜4 h。 8.透明、加碎蜡：5级氯仿透明，每级l h，最后纯氯仿2次，每次30 min。加碎蜡，所加石蜡量约占透明剂的一半， 然后放入36 ℃温箱中1 d。 9.透蜡、包埋：经50%蜡、75%蜡各30 min，纯蜡A、B、C三杯，每杯30 min，包埋。 10.修蜡块、切片：根尖纵切，切片厚度为8 μm。 11.展片、粘片、烘干：经镜检后选取根尖中轴部位、生长点及根冠分界清晰的蜡片，如果目的是观察有丝分裂 过程，则需注意所切蜡带有无分裂相，每张载玻片上放2 个蜡片，展片后平放摊片盘上，36 ℃温箱中烘干。 12.脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各一次。 13.封片、烘片：加拿大树胶封片。封片后平放摊片盘上，36 ℃温箱内烤数天（或自然干燥）。 14.镜检。
实验日程表(固定-包埋)
日期（日/月）
时间
步骤
第一天 / 上午8:00-11:30
50%乙醇 爱氏苏木精稀释液（原液1份加50%乙醇及乙酸等量混合液1份）
第四天 / 上午8:00 下午2:00
蒸馏水浸洗，勤换水，至水中无浮色，镜检。 如需分色则以45%乙酸分色至适度，自来水浸洗，换水数次至根尖变蓝。