基因打靶综述
基因打靶名词解释
基因打靶名词解释
基因打靶技术 (Gene Targeting) 是一种分子生物学技术，建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术的基础上。
它通过将目的基因和与细胞内靶基因同源的 DNA 片段重组到载体 (或质粒) 上，构建打靶载体 (基因表达载体),然后利用限制酶将打靶载体线性化，以提高重组率。
通过显微注射技术将打靶载体导入胚胎干细胞，这样打靶载体和与细胞内靶基因同源的区段就有机会发生同源重组。
为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷。
最后，通过 DNA 分子杂交技术鉴定同源重组的细胞，获得大量打靶成功的细胞。
这些细胞可以注射入小鼠囊胚，移植到同种、生理状态相同的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合体小鼠。
这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被修饰过的基因和未被修饰的基因。
如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被修饰过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被修饰过的小鼠。
基因打靶名词解释
基因打靶名词解释
基因打靶是一种基因工程技术，它利用特定的DNA序列，将外源基因精确地导入到一个特定的基因位点中。
这种技术可以用来研究基因功能、修复基因缺陷以及开发新的基因治疗方法。
基因打靶的过程包括两个主要步骤：识别和切割。
首先，研究人员使用特定的酶或蛋白质来识别目标基因的特定序列。
这些序列通常是一段短的DNA片段，称为“打靶位点”。
一旦打靶位点被识别，酶或蛋白质会结合到该位点，并启动下一步的切割。
接下来，酶或蛋白质会切割目标基因的DNA序列。
这个切割过程会导致DNA链的断裂，并触发细胞的DNA修复机制。
细胞会尝试修复这个断裂，但通常会出现错误的修复方式，导致插入或删除一些基因序列。
这些插入或删除的基因序列可以是研究人员提前设计好的，也可以是随机发生的。
基因打靶的最终目标是通过插入或删除特定的基因序列，改变目标基因的功能或修复基因缺陷。
例如，科学家可以使用基因打靶来修复一些遗传性疾病中的突变基因。
他们可以通过删除或替换这些突变基因来恢复正常的基因功能，从而治疗相关疾病。
此外，基因打靶还可以用于研究基因功能。
通过切割和修改特定的基
因序列，研究人员可以观察到这些基因对生物体的影响，并进一步理解基因在不同生物过程中的作用。
总而言之，基因打靶是一种精确编辑基因的技术，可以用于研究基因功能和开发基因治疗方法。
随着技术的不断发展，基因打靶有望成为一种重要的工具，用于治疗遗传性疾病和改善人类健康。
基因打靶技术及其应用前景
基因打靶技术及其应用前景摘要：基因打靶是近年来发展起来的对细胞基因组中的某一基因进行定点操作的生物技术。
综述了基因打靶的筛选系统，影响基因打靶效率的几个主要因素及其解决方法，总结了基因打靶在各个学科领域中的应用。
基因打靶是指外源DNA与受体细胞染色体 DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法。
它产生于70年代末和80年代初，最初应用于酵母细胞，80年代中期应用于培养的哺乳动物细胞。
此后，科学家将此技术与胚胎干细胞操作技术相结合，使其得到迅猛的发展，并在生物学、医学和畜牧学等学科领域的研究和应用中展现出广阔的前景。
基因打靶的原理和技术路线虽不复杂，但是，由于高等真核生物细胞内外源DNA与靶细胞DNA 序列发生同源重组的机率非常低，所以要把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来将是一种非常困难的工作，所以，筛选和富集中靶细胞就成为基因打靶技术中的关键一环。
基因打靶筛选系统选择标记基因定点突变的筛选以犹它大学Capecchi教授的实验为例，介绍选择标记基因定点突变的筛选方法。
首先，在HPrt 序列的第8外显子处插入一个新霉素抗性基因（neo r）作为选择标记，然后用电击转移法将打靶载体导人ES细胞中，通过G418和6-TG（6- thioguanine，6-巯基鸟嘌呤）两种药物的双筛选，得到了既抗G418又抗6-TG的细胞克隆。
从理论上推测，这些细胞克隆都应是对靶细胞Hprt基因进行了定点突变的克隆，因为如果外源基因没整合入靶细胞基因组，靶细胞（Neo--/Hprt+）在G418和6- TG的任何一种选择培养基中都将全部死亡；如果打靶载体只是随机整合入靶细胞基因组，则该 Neo+/Hprt+细胞在6-TG选择液中将全部死亡。
所以，只有通过同源重组，使Hprt位点发生了定点突变的克隆（Neo+/Hprt-）才能在两种选择培养基都存在的情况下存活。
正向选择法（positive lection）正向选择法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。
分子生物学综述论文(基因敲除技术)
现代分子生物学课程论文题目基因敲除技术班别生物技术10-2学号 *********** 姓名陈嘉杰成绩基因敲除技术的研究进展要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁•埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。
本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组前言基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。
上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。
基因打靶
基因打靶基因打靶研究背景显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的。
可能导致下面几种情况出现：1导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺失；2导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；3外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；4导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。
解决办法：将外源基因导入预先确定的位点。
即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶。
什么是基因打靶基因打靶(gene targeting)技术也称为基因定点同源重组，是利用基因转移方法, 将外源DNA序列导入靶细胞后, 通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同源DNA序列间的重组, 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 或对某一预先确定的靶位点进行定点突变, 从而改变细胞遗传特性的方法。
它是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。
基因打靶原理生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。
同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。
ES细胞是一类具有在体外培养件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。
首先获得ES 细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES 细胞。
通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES 细胞引入受体胚胎内。
经过遗传修饰的ES 细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。
基因打靶 cre-loxp重组酶系统
基因打靶基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。
基本概念：1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。
2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。
3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。
ES 623和B6-IIIES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。
BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。
常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。
PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。
建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。
一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。
基因打靶实验报告
一、实验背景基因打靶技术是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内研究基因及基因组的功能。
近年来，基因打靶技术在生物学和医学研究领域取得了显著成果。
本实验旨在通过基因打靶技术，研究特定基因在细胞增殖、凋亡和信号传导等方面的功能。
二、实验目的1. 利用基因打靶技术构建基因敲除细胞系。
2. 研究敲除特定基因后，细胞在增殖、凋亡和信号传导等方面的变化。
3. 分析敲除特定基因后，细胞生物学特性的变化。
三、实验材料1. 细胞：人乳腺癌细胞系MCF-7。
2. 基因打靶载体：pT7-TET-OFF载体。
3. 试剂：质粒提取试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂、转染试剂等。
四、实验方法1. 构建基因打靶载体：将目的基因插入pT7-TET-OFF载体中，并使用限制性内切酶进行酶切，连接成重组质粒。
2. 细胞转染：将重组质粒转染MCF-7细胞，采用脂质体介导的转染方法。
3. 基因敲除细胞筛选：通过G418筛选阳性克隆，并进行PCR检测。
4. 细胞增殖实验：采用CCK-8法检测细胞增殖情况。
5. 细胞凋亡实验：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。
6. 信号传导实验：采用Western blot法检测信号传导相关蛋白的表达。
五、实验结果1. 成功构建基因敲除细胞系：通过PCR检测，确认目的基因在细胞中成功敲除。
2. 基因敲除细胞增殖能力下降：CCK-8实验结果显示，基因敲除细胞增殖能力明显低于野生型细胞。
3. 基因敲除细胞凋亡率升高：Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示，基因敲除细胞凋亡率显著高于野生型细胞。
4. 信号传导实验结果显示，基因敲除细胞中信号传导相关蛋白表达降低。
六、实验讨论1. 本实验成功构建了基因敲除细胞系，为研究特定基因的功能提供了实验基础。
2. 基因敲除细胞增殖能力下降、凋亡率升高，提示该基因可能参与细胞增殖和凋亡调控。
基因打靶技术的研究进展
01 引言
目录
02 研究现状
03 传统基因打靶技术
04 新兴DNA纳米技术
05 应用领域
06 基因功能研究
07 疾病治疗
目录
08 研究方法
09 基因打靶效率的评估
010 挑战与展望
011 结论
引言
基因打靶技术是一种通过定向改造生物体基因组来实现基因功能研究与疾病 治疗的新兴技术。自20世纪80年代初以来，基因打靶技术不断发展，为科学研究 与医学实践提供了强有力的工具。本次演示将综述基因打靶技术的研究现状、应 用领域、研究方法以及挑战与展望，以期为相关领域的研究人员提供参考。
新兴DNA纳米技术
近年来，随着DNA纳米技术的不断发展，出现了一种基于DNA纳米结构的新型 基因打靶技术。该技术利用DNA自组装纳米结构，将基因打靶与纳米药物输送相 结合，具有更高的靶向性和细胞内活性。此外，DNA纳米技术还可用于基因编辑、 疫苗研发等领域，为基因打靶技术的发展开辟了新途径。
应用领域
挑战与展望
尽管基因打靶技术具有广泛的应用前景，但仍面临许多挑战和问题需要解决。 其中，靶向序列的设计和制备是关键的挑战之一。目前，靶向序列的设计主要依 赖于计算机辅助软件，但这些软件的准确性和可靠性仍有待提高。此外，制备高 质量、大规模的靶向序列仍是一个挑战。未来，研究人员需要开发更加高效和准 确的软件和方法，以提高靶向序列的设计和制备水平。
2、DNA疫苗
DNA疫苗是一种将外源抗原编码基因导入机体，通过机体细胞表达抗原蛋白， 诱导机体产生免疫应答的疫苗。基因打靶技术可应用于DNA疫苗的研发，将抗原 编码基因导入机体细胞，提高疫苗的免疫原性和保护效果。
3、基因治疗
基因打靶技术可用于基因治疗，通过将外源正常基因导入患者体内，补偿缺 陷基因的功能，达到治疗疾病的目的。例如，利用基因打靶技术将正常β-珠蛋 白基因导入贫血患者的造血干细胞，可有效治疗地中海贫血。
Gene targering 基因打靶
(四)外源基因的时间可控性表达：
实现了组织特异性基因打靶后，导入的外源基因表 达时间仍是无法控制的，因而仍无法确定外源基因的表 达在动物发育不同阶段中的作用。另外，由于外源基因 表达的时间不能控制，有时可造成转基因动物在胚胎期 死亡。为了解决这一问题，Mentzger等人(1995)用编码 Cre重组酶与人雌激素受体(estrogen receptor,ER)融合 蛋白的基因制备了Cre – ER转基因小鼠，给这种转基因 小鼠注射人雌激素，可诱导Cre – ER的大量表达。再用 插入两个反向loxP序列之间的基因制备另一种基因打靶 小鼠，并使该基因DNA序列与其上游的启动子方向相反， 则该基因必须依赖Cre重组酶调转方向后方能表达。
1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman 首先分离培养成功。
基因打靶的原理
基因打靶的结局有如下可能：
(1)基因击入(gene knock-in) 在受体细胞基因组中定点引入一个完全新 的基因。
(2)基因敲除(gene knock-out) 受体细胞内源靶基因被灭活,。
(3)基因替代(gene replacement) 靶基因被导入的外源基因替代，可以是以 正常基因替代突变的内源基因。
loxP位点 DNA序列方向相同(头一尾相对)，它们之间的
DNA序列连同一个loxP位点被切除；如果两个loxP位点的
DNA序列方向相反(头一头相对)，它们之间的DNA序列则
被调转方向。
Loxp 位点
两个loxp位点的方向相同
loxp
gene
loxp
Cre
两个loxp位点之间的基因被切除
两个loxp位点的方向相反
逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲 合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因 治疗方面具有较大的发展潜力。
第一章：基因打靶概述
在科学界，转基因动物被定义为“由于外源DNA导入动物基因组而产 生了可遗传的改变，这样的动物叫转基因动物”（陈永福，《转基因动 物》）。科学界对转基因动物的狭义定义主要指外源DNA被整合到生殖系 中（即可遗传），而不包括非生殖系整合的体组织基因导入。 具体含义： －转基因动物体内含有导入的外源DNA片段 －外源DNA必须整合到动物的基因组中 －动物的所有细胞基因组中都应含有导入的DNA －外源DNA可通过猪、鱼基因工程育种 “ 863”七五、八五计划, 转羊MT/猪GH基因:
转大马哈鱼和草鱼GH基因： 2. 乳腺生物反应器 “863”九五、十五计划重大专项,
3. 异种器官移植 “ 863”九五计划, 转hDAF基因：
猪(1989), 兔(1990) ， 绵羊(1991), 鱼(1986) （1995-2005）
二，什么是转基因动物（transgenic animal)
美国FDA：A transgenic animal is defined as an animal which is altered by the introduction of recombinant DNA through human intervention. This includes two classes of animals; those with heritable germline DNA alterations, and those with somatic nonheritable alterations. （转基因动物就是一种GE animal！）
第一章
基因打靶概述
第一节 基因打靶的概念
一，什么是基因修饰（或遗传修饰）（ Genetic Modification，GM)
8 15基因打靶
东北师范大学
基因打靶技术
gene targeting
用含已知序列的基因片段与受体细 胞基因发生同源重组，定点改变某 一特定基因的技术手段。 建立在胚胎干细胞和同源重组技术 基础上，定向改变活体遗传信息， 分为胚胎干细胞和体细胞打靶两类。
东北师范大学
2007年诺贝尔生理学或医学奖获得者
东北师范大学
打了就走策略 (Hit and Run )
Hit
同源序列 采用插入型载体
打入突变基因
先行正向筛选 染色体内同源重组
Run
再行负向筛选 清除筛选标志
东北师范大学
打了就走策略 (Hit and Run )
插入型载体
同源序列
G418正向筛选
染色体内同源重组
同源序列 更昔洛韦负向筛选
清除筛选标志
常 用 干 扰 型 突 变
东北师范大学
基因插入型载体
gene-insertion vector
正向选择标记在同源序列外侧，重组 结果是整个载体整合到靶位点上，从 而干扰目标基因的功能。功能性删除。
东北师范大学
基因治疗型载体
Vector in gene therapy
载体上有取代基因，对基因突变而丧 失正常功能基因的纠正。
东北师范大学
基因治疗临床试验
东北师范大学
基因治疗临床试验
东北师范大学
基因捕获gene trap
将报告基因随机插入基因组，通过内源 基因启动报告基因表示突变存在，建立 随机插入突变体的胚胎干细胞库。 在整合位点利用靶基因调控原件模仿靶 基因表达报告基因，而终止靶基因自身 表达，阐明靶基因的功能。 诱捕载体本身无启动子，需借助内源基 因的调控元启动Neo和lacZ等报告基因。
基因打靶技术及其应用2
应用实例：
Add Your Title
实验一
VBS（可见洞穴系统）实验：
Add Your Title
Approach: front and back（approach to the front or back of another animal ） Self-grooming： lick or rub self Allo-grooming： lick or rub with paws, another animal Huddle Alone
HSV-tk 胸苷激酶 标记基因 ← gangcyclovir （GCV） neor 新霉素抗性 基因→G418
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞
基因打靶的结局有如下可能：
(1)基因敲除(gene knock-out):靶基因被灭活 (2)基因替代:靶基因被导入的基因替代，可以是 以正常基因替代突变的基因。 (3)基因敲入(gene knock-in)：在受体细胞基因 组中定点引入一个原本不存在的完全新的基因
Wu R，Hendrix Lucas N. Cancer Cell，2007，1l(4)：321-333．
建立人类疾病的动物模型
基于基因同源重组原理的基因打靶技术的出现， 使转基因在体内的定点整合成为现实，因而产生 了去除特定基因的动物模型。 利用基因打靶技术建立了人类癌症、心血管疾病、 骨质疏松、神经退行性病变、免疫缺陷等疾病小 鼠模型，为疾病机理研究、新药研发和治疗方案 提供了宝贵的遗传资源。
实验结论
催产素受体基 因敲除的小鼠
社会交际 能力下降
VS 正常小鼠
展望
发展趋势： 通过条件基因打靶技术在时间和空间上对基因 剔除进行调控； 发展满足大规模基因功能研究需要的随机基因打 靶技术； 通过定位引入技术在基因组上引入精细突变以研 制精确模仿人类疾病的动物模型。
基因打靶技术研究进展
基因打靶技术研究进展(综述）建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因打靶技术(Gene targeting)是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段[1-3]。
通过对生物遗传信息的定向修饰，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因的功能，阐明生物体的遗传进化，疾病发生的分子机制，提供相关的疾病治疗药物、评价模型及新型预防、治疗疫苗等，是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段。
本文概述基因打靶的背景、原理、策略、生物学应用及问题与展望。
一、基因打靶研究的背景目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞内。
但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种情况出现：①导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺如；②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；③外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；④导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。
为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。
即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在生物发育中的作用。
随着人类及四十多种微生物基因组测序的完成，发现了大量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。
因此，基因打靶就日益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。
二、基因打靶原理生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。
同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。
肿瘤基因诊断与靶向治疗新进展综述
肿瘤基因诊断与靶向治疗新进展综述近年来，随着科技的不断进步和研究的深入，肿瘤基因诊断与靶向治疗取得了许多新的进展。
肿瘤基因诊断是通过对肿瘤细胞中的基因进行检测和分析，以了解肿瘤的发生、发展以及患者的治疗反应，为个体化治疗提供指导。
而靶向治疗则是根据肿瘤细胞中特定的靶点进行针对性的治疗，以提高疗效和减少副作用。
本文将对肿瘤基因诊断与靶向治疗的新进展进行综述。
首先，基因检测技术的快速发展为肿瘤基因诊断提供了有力的支持。
常见的基因检测方法主要包括PCR、Sanger 测序、荧光原位杂交、基因芯片等。
这些技术的应用使得我们能够准确检测肿瘤细胞中的基因突变、融合基因、染色体异常等，对于肿瘤的诊断、分型和预后评估起到了关键作用。
例如，EGFR基因突变是肺癌中常见的靶向治疗标志物，EGFR-TKI药物的应用能够明显提高患者的生存期。
而BRAF基因突变则是黑色素瘤的预后评估指标，通过检测该基因的突变情况，可以判断患者的生存期和治疗反应。
其次，肿瘤基因诊断的进展促进了靶向治疗的发展。
根据肿瘤细胞中发现的特定基因突变或异常，我们可以选择合适的靶向药物进行治疗。
目前，许多靶向药物已经进入临床应用阶段，并取得了显著的疗效。
例如，针对HER2阳性乳腺癌的靶向治疗药物Trastuzumab，已经成为一线治疗的重要选择，显著改善了HER2阳性乳腺癌患者的预后。
另外，针对BRAF突变的肿瘤，BRAF抑制剂的应用也取得了一定的临床效果。
通过对肿瘤细胞中具体靶点的有效干预，靶向治疗可以降低治疗过程中的毒副作用，提高治疗效果。
除了上述的常见靶向治疗，近年来，越来越多的肿瘤的靶向治疗方法被研究和应用。
免疫治疗是其中的一大突破。
免疫治疗的基本原理是通过激活机体自身的免疫系统，从而抑制肿瘤的生长和扩散。
PD-1/PD-L1抑制剂是目前应用最广泛的免疫治疗药物，通过抑制肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1相互作用，使得T细胞对肿瘤细胞产生杀伤效应。
基因敲除技术
基因敲除技术研究进展综述摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。
这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。
关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型1．概述：基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。
是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。
基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）、82岁的美国人奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁•埃文斯（Martin Evans）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
2.基因敲出技术发展历史80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
基因打靶综述
基因打靶技术【摘要】基因打靶技术是建立在同源重组技术之上,可对基因组进行定位修饰的实验方法。
本文简述了基因敲除技术的基本原理、打靶策略、筛选机制,在动植物和微生物中常用的基因敲除方法以及基因打靶的应用。
基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法, 是后基因组时代的重要研究内容。
【关键词】基因打靶;同源重组;打靶策略;筛选机制一．前言发展历史：基因敲除（gene knockout）又称基因打靶（Gene targeting）是自20 世纪80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，。
早在80年代初,人们就开始研究在哺乳动物基因组中,存在使外源DNA与现存同源序列同源重组的可能性。
1985年, Smithies及其同事的研究使之得到确证。
同期的相关研究证明了鼠多能干细胞系具有诱发小鼠产生种系组织的能力,甚至在长期培养后仍存在,导入这些细胞器系的突变可以传给后代。
其传统概念是指同源重组敲除技术即利用DNA 转化技术，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA 序列与靶细胞内染色体上同源DNA 序列间的重组，将载体DNA 定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或与靶细胞基因组上某一确定片段置换，从而达到基因敲除的目的[5]。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。
所以，基因敲除的基本原理是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生物学技术。
二．主题1基因打靶的基本原理绝大多数的基因打靶策略都是基于同源重组( homologous recombination)的机制。
同源重组是指发生在非姐妹染色单体( sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合,普遍存在于噬菌体、细菌和真核生物中。
基因敲除的操作步骤基因敲除的一般流程见图1, 基本程序是: 用PCR 技术扩增目的基因序列, 在体外插入卡拉霉素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记, 使目的基因失活,再将失活的目的基因构建至一环状载体上, 用电转化、显微注射等方法将构建好的载体转化入受体细胞内, 以抗性标记初步筛选阳性菌或进行目的基因功能的失活检测, 再以PCR, southern杂交等做进一步验证。
基因打靶技术
loxP (locus of crossing over (x),P1)位点是由 34对核苷酸为基本单位组成的DNA重复序列。来自 P1噬菌体的Cre (causes recombination)重组酶可 特异地识别loxP位点而使两个位点之间的DNA序列 发生重组，其机制是Cre重组酶可在loxP位点中切开 DNA序列而造成粘性末端。如果两个loxP位点 DNA 序列方向相同(头一尾相对)，它们之间的DNA序列连 同一个loxP位点被切除；如果两个loxP位点的DNA 序列方向相反(头一头相对)，它们之间的DNA序列则 被调转方向。
(一)基因打靶的原理
基因打靶(gene targeting)是根据 DNA同源重组的原理而设计的一项技术。 在这一技术中，体内细胞基因组的某一段 DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建 的欲导入的外源基因DNA序列被视为 “弹头”，这样导入的外源基因进入受体 细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚 准“靶子”进行准确的定点整合。
G418
GANC
打靶ES细胞的鉴定与扩增
筛选出G418R/GANCR的细胞克隆后再用PCR方 法进一步鉴定，鉴定后的ES细胞克隆与囊胚体外 共孵育或用显微注射的方法注入囊胚的胚泡中，再 将囊胚植入假孕母鼠的子宫中发育。
3.基因打靶小鼠的繁育(breeding)
用基因打靶的方法产生的第一代子鼠为嵌合 体(chimera)小鼠，即小鼠由囊胚的细胞及经基 因打靶的ES细胞共同发育而来。因此并非小鼠的 全部细胞中都整合有导入的外源基因。为获得纯 合子的转基因小鼠，还需要用打靶后出生的雄性 小鼠与提供囊胚的正常雌鼠交配，即回交(back– cross)。回交后出生的子代鼠中有野生型的小鼠 (-/-),即完全不携带有外源基因。也有杂合子的小 鼠(-/+)。再用杂合子小鼠互交（intercross）， 从出生的子代鼠中可鉴定、筛选出纯合子的基因 打靶小鼠。再经繁育可建立转基因小鼠品系，其 实验流程见下图 。
基因打靶
基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
基因打靶技术将广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面。
原理首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。
通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。
经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。
获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。
目前，在ES细胞进行同源重组已经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。
通过基因打靶获得的突变小鼠已经超过千种(相关数据库参见文献)，并正以每年数百种的速度增加。
通过对这些突变小鼠的表型分析，许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明，并直接导致了现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展。
特点基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。
基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。
基因打靶技术在基因功能研究中的应用、应用基因打靶技术研制人类疾病动物模型、应用基因打靶技术改良动物品系和研制动物反应器等。
gene knock-out将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。
去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。
《ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究》范文
《ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究》篇一一、引言近年来，随着生物科技和分子遗传学的迅猛发展，基因打靶技术作为一种强有力的遗传工程工具，已被广泛应用于各种模式生物中。
基因打靶是利用特定的DNA序列切割技术，实现对目标基因位点的精确编辑，从而达到对基因表达调控的目的。
本文旨在研究ZFNs（锌指核酸酶）介导的牛MSTN（肌萎缩性肌肉营养不良症相关蛋白）位点的基因打靶研究，探讨其在畜牧业上的潜在应用价值。
二、ZFNs的概述ZFNs是一种人工合成的蛋白质分子，其能够特异性地识别并切割DNA序列。
其通过结合到特定的DNA序列上，进而诱导DNA双链断裂（DSB），进而激发细胞的修复机制，达到对目标基因的精确编辑。
三、牛MSTN基因的背景与意义MSTN基因是一种在哺乳动物中广泛存在的基因，其编码的蛋白主要与肌肉发育、生长调节有关。
通过对牛MSTN位点的基因打靶，可以有效调节肌肉的生长速度和数量，对于改良畜牧业中牛的品种和提高养殖效率具有巨大的应用价值。
四、研究方法本研究首先设计并构建了针对牛MSTN位点的ZFNs表达载体。
然后通过显微注射技术将ZFNs注射到牛的受精卵中，使ZFNs在受精卵中表达并切割MSTN位点。
接着通过细胞修复机制，实现对MSTN基因的精确编辑。
最后，通过PCR和测序等手段，验证编辑的准确性及效率。
五、研究结果实验结果显示，通过ZFNs介导的基因打靶技术，成功在牛MSTN位点实现了DNA双链断裂。
经过细胞修复机制，实现了对MSTN基因的精确编辑。
PCR和测序结果进一步证实了编辑的准确性和效率。
同时，通过对注射后胚胎的培育和移植，发现基因编辑后的胚胎具有更高的存活率和生长速度。
六、讨论本研究利用ZFNs介导的基因打靶技术，成功实现了对牛MSTN位点的精确编辑。
这一成果为畜牧业的改良提供了新的可能。
通过对基因编辑后的胚胎进行培育和移植，有望实现牛品种的改良和养殖效率的提高。
此外，本研究还为其他基因疾病的治疗提供了新的思路和方法。
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基因打靶技术【摘要】基因打靶技术是建立在同源重组技术之上,可对基因组进行定位修饰的实验方法。
本文简述了基因敲除技术的基本原理、打靶策略、筛选机制,在动植物和微生物中常用的基因敲除方法以及基因打靶的应用。
基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法, 是后基因组时代的重要研究内容。
【关键词】基因打靶;同源重组;打靶策略;筛选机制一．前言发展历史：基因敲除（gene knockout）又称基因打靶（Gene targeting）是自20 世纪80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，。
早在80年代初,人们就开始研究在哺乳动物基因组中,存在使外源DNA与现存同源序列同源重组的可能性。
1985年, Smithies及其同事的研究使之得到确证。
同期的相关研究证明了鼠多能干细胞系具有诱发小鼠产生种系组织的能力,甚至在长期培养后仍存在,导入这些细胞器系的突变可以传给后代。
其传统概念是指同源重组敲除技术即利用DNA 转化技术，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA 序列与靶细胞内染色体上同源DNA 序列间的重组，将载体DNA 定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或与靶细胞基因组上某一确定片段置换，从而达到基因敲除的目的[5]。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。
所以，基因敲除的基本原理是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生物学技术。
二．主题1基因打靶的基本原理绝大多数的基因打靶策略都是基于同源重组( homologous recombination)的机制。
同源重组是指发生在非姐妹染色单体( sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合,普遍存在于噬菌体、细菌和真核生物中。
基因敲除的操作步骤基因敲除的一般流程见图1, 基本程序是: 用PCR 技术扩增目的基因序列, 在体外插入卡拉霉素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记, 使目的基因失活,再将失活的目的基因构建至一环状载体上, 用电转化、显微注射等方法将构建好的载体转化入受体细胞内, 以抗性标记初步筛选阳性菌或进行目的基因功能的失活检测, 再以PCR, southern杂交等做进一步验证。
现在, 为了更好地区别单交换与双交换造成的重组, 通常使用两个抗性标记,在发生单交换时, 阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组, 而发生双交换时,第二次同源重组会导致基因回复至野生型或敲除目的基因, 在前一种情况下,两种标记都不存在; 在后一种情况下, 基因组上只有阳性标记, 因此这样的敲除子可以通过正负筛选鉴别出。
但如果载体构建时在同源序列内部引入一些突变, 就不会回复至野生型, 这样, 既能实现基因的失活, 基因组上又不会带有抗性标记, 这对构建/食品级0的安全菌株是有益的。
几种常用的基因敲除技术1 利用同源重组进行基因敲除基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞( embryonic stem cell, ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来,主要是利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。
通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的[ 1 ] 。
基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。
完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段,即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除[ 2 ] ,现阶段以噬菌体的Cre /Loxp系统和酿酒质粒的FLP /FRT系统应用得最为广泛[ 3 ] 。
2 利用随机插入突变进行基因敲除基因定点敲除虽然是最直接的研究基因功能的方法,但是对开花植物而言,缺乏高效实用的定点突变技术。
目前较为有效的方法是大规模的随机插入突变,它为在基因组范围内敲除掉任何一个基因提供了可能。
这项技术具有效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。
随机插入突变可以分为T - DNA插入突变和转座子插入突变。
以农杆菌介导的T - DNA插入突变适用于多种植物,可以直接在植物基因组DNA中产生稳定的插入突变,而且插入位点的随机性较强,但是它只适用于那些容易被T - DNA转化的植物,且常常会引起的染色体重排现象,使突变体表型与T - DNA插入无关而难以进行遗传学分析。
尽管如此,近年来将T - DNA插入突变应用于拟南芥还是获得了广泛的成功。
[ 4 ]转座子插入突变是利用了转座子在染色体上可移动的特点,当它跳跃插入到某个功能基因时,就会引起该基因的失活,并诱导产生突变型。
因此可以利用某些能随机插入基因序列的转座子,在目标细胞基因组中进行随机插入突变,建立一个携带随机插入突变的细胞库,然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。
目前研究报道,能用于任何物种的转座子打靶载体是以两种噬菌体Mu为基础的mini -Mu转座子(每个转座子上都携带标记基因) ,它们可以在拟删除基因两侧各插入一个mini -Mu转座子,然后在两个插入位点之间的制造缺失。
这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移,留下一个带有选择标记在两侧的与靶基因同源的臂。
利用mini - Mu转座子进行基因敲除具有极大的方便性,它不需要知道基因组序列,仅已知外显子即可,且载体构建迅速,技术简单,载体可以携带多种不同抗性基因,可以同时处理多基因。
但是转座子的应用也有一定限制,比如要求转座子本身较短,容易操作,且对任何拟敲除区域有较高转座效率等[ 5 ] 。
3 RNA干扰引起的基因敲除现在普遍认为转录后基因沉默是生物保持基因的完整性,抵御外来核酸入侵,抑制转座因子诱导DNA突变的手段,广泛存在于真菌、植物、线虫、脊椎动物和大肠杆菌中[ 6 ] 。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种普遍的转录后基因沉默的机制,由siRNA ( small intereferenceRNA)引起, siRNA是外源基因产生的dsRNA在Dicer酶的作用下所产生的长度为21 - 22nt的一系列片段的总称,具有很强的关闭基因的功能,能够介导RNA干涉现象,诱导出一种由siR2NA分子、核酸酶以及螺旋酶等结合在一起的RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing comp lex, R ISC) 。
R ISC能够解开siRNA并精确的指导特异的mRNA降解,使细胞抵抗外来基因侵入及病毒感染。
因此,通过将dsRNA分子导入细胞内,特异性地降解细胞内与其同源的mRNA,封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。
1998年, RNAi技术首先在线虫中建立,目前已在线虫、果蝇、真菌及拟南芥等生物中分别建立,并用于研究特定基因或已知基因在特定发育时期的功能[ 7 ] 。
RNAi的作用特点有: (1)特异性强,针对同源基因共有序列的RNAi 则只能导致同源基因失活,不影响其他内源性mRNA 的表达; (2)效率高,少量的dsRNA分子就可以完全抑制相应基因的表达,能在低于反义核酸几个数量级的浓度下研究目的基因; (3)穿透性强, RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持[ 8 ] 。
RNAi技术操作相对简便,结果快捷,尤其对于那些不容易获得突变体的基因或生物体来说, RNAi技术无疑提供了一种快速有效的研究基因功能的方法。
由于dsRNA引入生物体内的剂量和时间可以人为控制, RNAi技术可以用于研究某个特定基因在特定发育阶段的功能。
伴随着功能基因组学研究的深入, RNAi技术在研究信号传导途径、胚胎发育相关因子以及参与基本生物反应过程的新基因功能方面有巨大发展潜力,它将带来生物学研究的革命。
虽然RNAi技术有如此明显的专一性优点,但RNAi不能作用于所有基因和某些细胞类型(如神经元) ,很多设计的dsRNA不能产生抑制靶基因转录后沉默的效果。
由于RNAi实际上只是在转录后水平上降低基因的表达,并不象基因敲除那样完全把基因从基因组中剔除掉,有时也会因背景的不干净导致产生的表型难以分析[ 9 ]。
因此, RNAi不能完全取代传统的基因敲除技术。
基因敲除的应用基因敲除的威力在于研究者可以选择性地修饰基因及选择如何去修饰,最终完全控制该段基因的DNA序列或修饰其周围的调控元件。
由于几乎所有生命现象均由基因控制或受其影响,因此打靶技术在几乎所有生物学领域如微生物学、动物学、植物学、医学等领域都有应用价值。
它目前已经广泛的应用于各个方面,并取得了较大的进展。
基因敲除在医疗领域的应用基因敲除可用于建立人类疾病的转基因动物模型,为医学研究提供材料。
从敲除技术诞生之日直到现在,研究较多的是用小鼠ES细胞进行基因打靶, 所建立的小鼠模型多与人类遗传性疾病有关[ 14 ] 。
已产生的模型包括与癌基因和肿瘤抑制基因、免疫相关基因、生长因子与受体基因等。
这些模型的建立为治疗人类疾病提供了很大帮助。
如1989年囊性纤维化病(CF)的致病基因(CFTR)被成功地克隆, 1992年成功建立了CFTR基因敲除的CF小鼠模型,为CF基因治疗提供了很好的动物模型,得以顺利通过了基因治疗的动物试验,于1993年开始临床试验并获得成功。
基因敲除用于异种器官移植。
异种器官移植是将动物的器官、组织或者是细胞导入人体体内,排斥反应是限制这一新兴技术发展的主要瓶颈。
位于猪细胞膜表面的末端α - 1, 3 - 半乳糖苷转移酶抗原决定簇是引起排斥反应的重要原因,通过α - 1, 3 -半乳糖苷转移酶的基因敲除,为家猪可成为人体器官的有效供体提供了可能[ 15 ] 。
除以上外,基因敲除还可用于治疗遗传病等,包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗目的。
基因敲除用于改造动植物基因,鉴定新基因和其新功能,研究发育生物学深入研究基因敲除生物的发育及生命各期的表现,可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用,为研究基因的功能和生物效应提供模式。
例如,目前人类基因组研究多由新基因序列的筛选检测入手,进而用基因敲除法在各类生物体上观察该基因缺失引起的表型变化。
目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、LTD有缺陷的基因敲除动物,发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少。
动植物育种对动植物的基因进行修饰改造,可产生一些人类需要培育的生物新品种。