微生物次级代谢产物合成基因簇预测分析
次级代谢产物基因簇
次级代谢产物基因簇次级代谢产物基因簇是指一组在细胞内合成和调控次级代谢产物的基因序列。
次级代谢产物是一类细胞内产生的化合物，不同于细胞的生存所必需的主要代谢产物，而是具有特定的生理功能或生物活性。
这些次级代谢产物包括抗生素、抗肿瘤物质、植物次生代谢产物等，对人类和生物体的生理活动具有重要的影响。
次级代谢产物基因簇通常由多个连续排列的基因组成，这些基因按特定的顺序编码了合成次级代谢产物所需的酶和调控蛋白等。
基因簇的存在使得细胞能够高效地合成次级代谢产物，并保证其在合适的时间和条件下被产生。
在细菌中，次级代谢产物基因簇的存在非常普遍。
细菌通过次级代谢产物基因簇合成了许多重要的化合物，如抗生素。
抗生素基因簇通常由多个基因组成，这些基因编码了合成抗生素所需的酶和蛋白质。
这些基因按照一定的顺序排列在细菌的染色体上，形成基因簇。
通过对这些基因簇的研究，科学家们可以了解到抗生素的合成机制，并可以通过调控基因簇的表达来提高抗生素的产量或改变抗生素的结构，从而开发出更加有效的抗生素。
除了细菌，植物中也存在许多次级代谢产物基因簇。
植物次级代谢产物基因簇的研究对于揭示植物次生代谢的合成机制和调控网络非常重要。
通过对植物次级代谢产物基因簇的分析，科学家们可以了解到植物合成次级代谢产物的途径和关键酶，进而可以通过基因工程手段来提高植物次级代谢产物的产量或改变其结构，从而获得具有更好生物活性的化合物。
近年来，随着基因组学和生物信息学的发展，科学家们可以通过对基因组的分析来预测和鉴定次级代谢产物基因簇。
通过对不同生物的基因组进行比对和分析，可以找到具有相似结构和功能的基因序列，并判断其是否属于次级代谢产物基因簇。
这为研究次级代谢产物的合成机制和调控网络提供了重要的工具。
次级代谢产物基因簇的研究不仅对于药物开发和农业生产具有重要意义，还对于生物多样性和生态系统的保护具有重要意义。
许多次级代谢产物具有抗菌、抗肿瘤和抗虫等生物活性，对人类健康和生物体的生存发展起到重要作用。
第12组激活沉默基因以获取新型微生物次级代谢产物的策略素材
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异源表达使得沉默基因在新的表达系统中无需按照原来的起始位点进行有效转 录，对培养条件也无特殊要求，克服了天然生产菌表达 水平低、遗传操作困难、 不容易规模培养等缺点，为工业化生产扫清障碍。另外，它还适用于生长缓慢 的微生物，如蓝细菌、真菌等。由该法已发现多种新的生物活性物质。
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实现天然产物异源表 达生物合成必须要解 决以下几个问题。
激活沉默基因以获取新型微生物次 级代谢产物的策略研究
组员： 季宗德 郭秋香 张羡媛
赵琪
1
一直以来，天然产物在人类疾病的治疗过程中发挥着重 要作用。
根据2007 年的统计，1981～2006 年间国际上所有批 准的药物中，超过 50%来源于天然产物、天然产物的衍生物 或模拟天然产物药效基团的合成化合物。 尤其是，目前临 床上使用的 60%的抗癌药物和 70%的抗生素是天然产物或 者基于天然产物研发的药物。
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6 单菌多次级代谢产物策略
单菌多次级代谢产物（one strain-many compounds，OSMAC）策略，是通过 改变培养培养基成分、通气量及添加重金属和酶抑制剂等发酵条件来获取更多新型 的次级代谢产物的方法
缺点：OSMAC 策略虽然有效， 但是其工作量 大，且最终能 否获得新的有 活性的次级代 谢产物并不确 定
中国科学家更是于 2009 年 发起了“万种微生物基因组” 计划，预计在3年内完成1万 种微生物物种全基因组序列 图谱的构建。
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在常规培养条件下，大 多数生物合成基因簇不表 达或以极低水平表达并在 沉默生物合成基因簇包含了 特定条件下被激活而表达 多种结构类型的微生物次级代谢 活性产物，这些 DNA序列称 产物编码信息, 提供了丰富的合 为沉默生物合成基因簇。 因此，如何利用现有 成生物学天然元件或模块 , 并为 未来设计和构建新型微生物次级 的研究成果和技术手段 代谢产物生物合成途径提供丰富 进行激活沉默基因以获 的物质基础。
微生物次级代谢产物生物合成基因簇技术分析
微生物次级代谢产物生物合成基因簇技术分析作者：宫克飞来源：《中国科技博览》2013年第28期[摘要]微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物，其生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提。
[关键词]生物合成技术中图分类号:[Q528+.2] 文献标识码:A 文章编号:1009-914X(2013)28-0296-01微生物产生的次级代谢产物在化学结构和生物活性方面多种多样，主要的产生菌类群包括放线菌、芽孢杆菌、粘细菌、假单胞菌、蓝细菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以链霉菌为代表的放线菌产生的。
根据结构特点可以基本上将抗生素分为β内酰胺、氨基糖苷、核苷、四环素、多肽、糖肽、大环内酯、安莎、聚醚和类萜等种类。
以上多种多样抗生素的结构特点也决定了它们生物活性的多样性，除了可以抑菌杀菌外，还可以作为抗癌药、抗寄生虫药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、低血胆固醇治疗剂等等，在医疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域均发挥着重要作用。
随着大量微生物次级代谢产物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难，已知结构化合物分离的重复性很高。
另一方面，临床上病原微生物的耐药性日益严重，伴随着多耐药性、高耐药性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不断出现，如何利用已有资源，定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。
分子生物学基础上的组合生物合成(combinatorial biosynthesis)和代谢工程(metabolic engineering)成为解决上述问题的重要手段，但是次级代谢产物生物合成基因(簇)的克隆与功能鉴定是这两项技术实施的必要前提。
一、微生物次级代谢产物生物合成基因簇的组成特点自从Malpartida等1984年克隆了放线紫红素的全部生物合成基因，以及随后克隆的榴菌素、红霉素、泰乐星等生物合成基因，揭示了微生物次级代谢产物生物合成基因成簇排列的特征，即与特定产物合成相关的结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等集中位于染色体的一段连续区域。
antismash的原理和应用
ANTISMASH的原理和应用介绍ANTISMASH是一种用于分析次级代谢产物基因簇在细菌、真菌和植物中的存在和特征的工具。
它可以通过分析基因组序列来预测和注释这些基因簇，帮助科研人员理解次级代谢产物在生物体中的合成和功能。
原理ANTISMASH利用计算机算法来分析基因组序列中的次级代谢产物基因簇。
它首先会使用预训练的模型来识别基因组中的潜在基因簇，然后利用多种算法对这些基因簇进行进一步的分析和注释。
这些算法包括拟合HMM（隐马尔可夫模型），识别保守的主要酶基因，预测次级代谢物的结构类型等。
最后，ANTISMASH会生成详细的报告，其中包含关于基因簇中基因的功能注释、预测次级代谢物的结构类型和潜在活性等信息。
应用ANTISMASH在生物研究中有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.生物药物研发：ANTISMASH可以帮助科研人员发现潜在的次级代谢产物基因簇，从而开发新的生物药物。
通过分析基因组序列，ANTISMASH可以预测次级代谢物的结构类型和潜在活性，为药物研发提供重要的信息。
2.农业和食品科学：ANTISMASH可以帮助农业科学家和食品科学家研究植物中的次级代谢产物。
通过分析基因组序列，ANTISMASH可以帮助研究人员了解植物中次级代谢产物的合成途径和功能，从而改良农作物和提高食品质量。
3.微生物生态学：ANTISMASH可以在微生物生态学中发挥重要的作用。
通过分析微生物基因组序列，ANTISMASH可以帮助科研人员了解微生物群落中的次级代谢产物合成的多样性和功能。
这对于理解微生物在生态系统中的作用十分重要。
4.天然产物研究：ANTISMASH可以用于研究和发现天然产物。
通过分析基因组序列，ANTISMASH可以帮助研究人员预测潜在的次级代谢产物基因簇，这对于发现新的天然产物具有重要意义。
总结ANTISMASH是一种用于分析次级代谢产物基因簇的工具，通过分析基因组序列可以帮助科研人员预测和注释基因簇，并理解次级代谢产物在生物体中的合成和功能。
微生物源化合物合成基因簇异源表达研究进展
使用的多种药 物都属于这一类化合 物， 在农业上使 用 的一些 农 药 、 兽药等也属于这类化合 物ｕ Ｊ 。一 些
对 人 类极 为安 全 并能 有效 杀 灭靶 标 生 物 的聚 酮类 化
论（ 如图 １ ） ， 并对如何利用异源表达开发新化合物进
行综述。
合物也被应用于食品领域 Ｊ 。由非核糖体肽合酶
关键 词 异 源表 达 中图分 类号 ： Ｑ ９ ３ ６ 次级代 谢基 因簇 文献标 识码 ： Ａ 聚酮 类物质 非核糖 体肽 文 章编 号 ： １ ０ ０ ３— ０ １ ７ ４ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ９— ０ １ ３ ３— ０ ７ 簇， 从 而达 到 获得新 活性 化合 物 的 目的 。
２ ０ １ ５年 ９月 第３ Ｏ卷第 ９期
中国粮油学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｃ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ ｓ ａ ｎ ｄ Ｏｉ ｌ ｓ Ａｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
Ｖｏ １ ． ３ ０． Ｎｏ ． ９
Ｓ ｅ ｐ ． ２ ０１ ５
微 生 物 源化 合 物合 成基 因簇 异 源 表达 研 究 进 展
黄 颖 赵 晨 关 雄 张晓琳
１ ０ ０ ０ ３ ７ ） ３ ５ ０ ０ ０ ２ ） （ 国家粮 食局 科学 研究 院 ， 北京
（ 福建 农林 大学 生物农 药 与化 学生 物学 教育 部重 点实 验室 ， 福州 摘 要
ｐ ｅ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ Ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ） Ｊ 、 Ｇ ｉ ｂ ｓ ｏ ｎ等 温 一 步 法 ＿ ｌ 等 。 Ｄ Ｎ Ａ 合 成 和组装 策 略的优 势 在 于 能够 实 现 基 因簇 的密码 子 优化 和调 控 基 因 的选 择 ， 并 可 以 添加 或 删 除 酶 切 位 点 。在 一 个 简 单 的 宿 主 中 （ 例 如 大 肠 杆 菌
次级代谢产物的生物合成与调节
氯霉素，利福霉素等
怎样解除这种分解代谢物调整？
六、能荷调整（磷酸盐旳调整）
↓*2
八氢番茄红素
↓
六氢番茄红素
↓
ζ—胡萝卜素
↓
链孢红素
↓
番茄红素
↙
↘
γ—胡萝卜素
δ—胡萝卜素
↓
↓
海胆酮 ←─β—胡萝卜素
α—胡萝卜素
↓
Байду номын сангаас
↓
↓
角黄素
β—隐黄质
叶黄素
↓
↓
虾青素
玉米黄素
↓↑
环氧玉米黄素 → 辣椒红素
↓↑
紫黄素
→ 辣椒玉红素
↓
新黄素
类胡萝卜素旳生物合成途径
•次级代谢酶旳专一性低
相对来说催化初级代谢产物合成旳酶专一性强，催化 次级代谢产物合成旳某些酶专一性不强，所以在某种 次级代谢产物合成旳培养基中加入不同旳前体物时， 往往能够造成机体合成不同类型旳次级代谢产物。
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七、细胞膜透性旳调整
外界物质旳吸收或代谢产物旳分泌都需经细胞 膜旳运送，如发生障碍，则胞内合成代谢物不 能分泌出来，影响发酵产物收获，或胞外营养 物不能进入胞内，也影响产物合成，产量下降。
在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能 力旳大小影响青霉素发酵单位旳高下。假如输 入硫化物能力增长，硫源供给允足，合成青霉 素旳量就增多。
（1）筛选营养缺陷型回复突变株
微生物次级代谢讲解
次级代谢物生物合成步骤： ① 养分摄入细胞内； ② 通过中枢代谢途径养分转化为中间体； ③ 次级代谢物前体的生物合成；
中间体 ：对初级代谢而言； 前体： 对次级代谢而言； 有时二者是同一物质，有时前体在中间体的基础(jīchǔ)上结构略 有改变。
④ 如有必要，改变其中的一些中间体； ⑤ 前体进入次级代谢物生物合成的专有途径； ⑥ 次级代谢的主要骨架形成后，作最后的修饰，成为产物。
Rose的定义（1979）： 前体(precursor)是在细胞内生成的，或由培养基 提供的，能被代谢形成某种终产物的物质。 Stanbury等的定义(1984)： 前体指加入到某一培养基中的一些化学物质被直接 结合到所需产物中。
精品资料
前体现代定义： 指加入到发酵培养基中的某些化合物，它能被微
生物直接结合到产物分子(fēnzǐ)中去，而自身的结 构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。
精品资料
（一）微生物次级(cì jí)代谢的特 性
①一般不在生长期产生，而在生长后期(hòuqī)形 成
抗生素晚合成的原因之一可能是避免生长受其自身产 物的抑制； 次级代谢产物的合成过程一般是在培养 基中缺乏某种营养物质，菌体生长受到限制时才启动 的。
精品资料
精品资料
②种类繁多(fánduō)，结构特殊，含不常见的化学键：
66化学结构乳链球菌素的化学结构ileileddhbalasalaleudhaabusalalysglyproglyabusalaglymetleualaasnmetlysalaabuhisalaabusholysddhavalhisileseralasabuaminobutyricaciddhadehydroalaninedhbdehydrobutyrine乳链球菌素乳链球菌素n乳链球菌素能有效地抑制引起食品腐败的许多革兰阳乳链球菌素能有效地抑制引起食品腐败的许多革兰阳性菌如肉毒梭菌金黄色葡萄球菌溶血链球菌和性菌如肉毒梭菌金黄色葡萄球菌溶血链球菌和利斯特菌的生长和繁殖尤其对产生孢子的革兰阳利斯特菌的生长和繁殖尤其对产生孢子的革兰阳性菌如枯草芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌等有很性菌如枯草芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌等有很强的抑制作用
构巢曲霉基因组研究
FA，改变功能注释
ED，实验确定
EP，表达模式
丝状真菌的一个重要特征是能够产生次级代谢产物，因此研 究真菌的次级代谢也就成为对基因簇研究的而一个拓展。基 因测序的最新进展表明真菌基因组拥有远远多于在实验室常 规条件下表达次级代谢产物的基因簇。这些沉默的基因簇对 我们研究其次生代谢物来说是个巨大挑战，然而我们已经使 用了很多方法来尝试激活它们。丝状真菌的次级代谢产物是 很有效的化合物，从这些致命的毒素中分离出的抗生素具有 潜在的抗癌作用。丝状真菌在药物的发现和发展史上扮演着 重要的角色，比如抗生素有青霉素，免疫抑制剂有环孢菌素， 抗真菌剂有灰黄霉素和棘白菌素，降血脂药有洛伐他丁都来 源于丝状真菌。许多有生物活性的次级代谢产物在常规实验 条件下容易获得，并且已经获得了药物开发专利。
2-ethyl-4,6-dihydroxy-3,5-dimethylbenzaldehyde 2-乙基-4,6-二羟基-3,5-二甲基苯 Ferricrocin 铁菌素:抗革兰氏阳性菌抗生素 (2Z,4Z)-4,6-Dimethylocta-2,4-dienoic acid （2Z，4Z）-4,6-二甲基辛-2,4-二烯酸 Penicillin 青霉素:是抗菌素的一种，是指分子中含有青霉烷、能破 坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素 norsolorinic acid 降散盘衣酸 Terrequinone A:是由构巢曲霉(Aspergillus nidulans)分泌的具有抗 癌活性的二级代谢产物，有着广阔的应用前景和市场潜力。 Aspyridone A, B:利培酮，用于治疗急性和慢性精神分裂症。特别 是对阳性及阴性症状及其伴发的情感症状(如焦虑、抑郁等)有较好 的疗效。
基因本体（ Gene Ontology ，GO）：是一个在生物信息学 领域中广泛使用的本体。它是一个词汇表，具有树形结构， 可以电脑操作和动态搜索。 GO 涉及的基因和基因产物词汇 分为三大类，涵盖生物学的三个方面： ① 细胞组件（Cellular Component）:指基因产物位于何种细 胞器或基因产物组中（如糙面内质网、核糖体、蛋白酶体 等），即基因产物在什么地方起作用。 ② 分子功能（Molecular Function）：描述在个体分子生物 学水平上的活性。如催化活性或结合活性。 ③ 生物学过程（Biological Ptocess）：指由分子功能有序地 组成的，具有多个步骤的一个过程。
微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新
微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新一、概述微生物在生长过程中，除了进行维持生命活动所必需的初级代谢外，还会产生一系列复杂的次级代谢产物。
这些物质通常具有多样的化学结构和生物活性，包括抗生素、毒素、激素、色素等，对微生物自身并无明确的生理功能，但对人类和其他生物体可能具有显著的生物活性。
微生物次级代谢产物一直是药物研发的重要来源之一。
近年来，随着基因组学、转录组学、蛋白质组学等技术的飞速发展，研究者们开始从分子水平深入探索微生物次级代谢产物的生物合成机制。
生物合成基因簇的研究成为了热点之一。
生物合成基因簇是指一组在染色体上连续排列的基因，它们共同负责某一特定次级代谢产物的生物合成。
这些基因包括结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等，它们之间具有复杂的调控关系，共同构成了微生物次级代谢产物生物合成的分子基础。
在药物创新方面，微生物次级代谢产物生物合成基因簇的研究具有重要的意义。
通过对生物合成基因簇的克隆和分析，可以深入了解次级代谢产物的生物合成途径和调控机制，为药物的设计和合成提供新的思路和方法。
通过基因工程手段对生物合成基因簇进行改造和优化，可以实现次级代谢产物的定向生产和产量提高，为药物的规模化生产提供可能。
利用生物合成基因簇的多样性，还可以发掘新的次级代谢产物，为药物创新提供更多的候选物质。
微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新之间存在着密切的联系。
通过对生物合成基因簇的深入研究，不仅可以揭示微生物次级代谢产物的生物合成机制，还可以为药物创新提供新的思路和方法。
未来，随着技术的不断进步和研究的深入，微生物次级代谢产物生物合成基因簇在药物创新领域的应用前景将更加广阔。
1. 微生物次级代谢产物概述微生物，作为地球上最古老且多样的生命形式，它们在生物地球化学循环和生物合成过程中发挥着至关重要的作用。
微生物的代谢活动不仅限于维持其生命活动所必需的主要代谢过程，还包括一种称为次级代谢的过程。
微生物代谢分析的实验方法和数据分析
微生物代谢分析的实验方法和数据分析微生物代谢分析是一个重要的领域，它包括了微生物代谢途径的理解和微生物代谢产物的生产。
这个领域被广泛应用于医学、生物技术、食品工业等方面，因此，对于微生物代谢分析的实验方法和数据分析的研究有着重要的意义。
实验方法微生物代谢分析实验方法涉及到的步骤和技术相当多。
但是，无论实验的种类如何，都需要遵循一定的基本原则和技术。
1.微生物的培养微生物的培养是代谢分析的第一步。
在实验之前，必须制备好含有基础培养物的培养基，并将微生物在培养基中培养。
这个过程需要在一定的温度、湿度、气氛条件下进行。
不同的微生物需要不同的培养条件，环境条件的变化可以影响代谢途径，从而影响微生物代谢产物的生产。
2.代谢阳极反应代谢阳极反应是微电极法的一种变化。
这种实验方法可以实现微生物代谢物的动态监测，不仅可以实时追踪微生物代谢物的变化，还可以在微生物代谢物验证反应机理时帮助确定代谢途径。
3.质谱分析质谱分析是目前微生物代谢分析的核心技术之一。
在实验中，通过分析微生物代谢产物分子的质量，可以确定含有不同碳同位素的代谢产物的数量。
质谱分析的方法有多种，如时间飞行质谱、电子喷雾质谱等。
数据分析微生物代谢分析的数据分析方法是非常重要的，因为代谢产物的数据可以帮助研究人员了解微生物内部代谢途径的运行情况。
数据分析的过程包括数据整理、数据挖掘和数据解释等环节。
1.数据整理数据整理是数据分析的第一步。
对于代谢产物的数据，研究人员需要对数据进行整理和清洗。
数据整理包括消除数据质量问题、处理缺失数据、变换数据极值和数据标准化等。
2.数据挖掘数据挖掘是数据分析的一个重要环节。
在代谢产物的数据挖掘过程中，研究人员需要将数据经过预处理后进行统计学分析。
研究人员可以根据实验需要，进行差异分析、聚类分析、因子分析等统计学方法，帮助他们理解代谢途径的变化。
3.数据解释数据解释是数据分析的最后一个环节。
在分析代谢产物的数据之后，研究人员需要对结果进行解释。
OSMAC方法在微生物次级代谢产物研究中的应用
科学技术创新2020.26OSMAC方法在微生物次级代谢产物研究中的应用朱美林王皓天（蚌埠医学院，安徽蚌埠233000）1概述微生物次生代谢物已被认为是药物发现和开发中新化合物的主要来源。
传统的微生物化学研究主要集中在从发酵液和菌丝体中提取和分离具有结构活性的化合物。
然而，由于已知次生代谢物的高重新发现率，这些过程正变得低效[1]。
人们普遍认为，在标准发酵条件下，很大一部分微生物基因簇是沉默的。
通过挖掘微生物基因组和针对次生代谢物的生物合成基因簇，研究人员可以更客观地挖掘微生物的潜力，如击倒、引入或异源表达微生物基因，调节启动子，诱导突变，或改变培养条件来刺激次生代谢物基因的表达[2]，见图1。
改变培养条件被认为是最简单、最有效的策略，被Zeeck教授和他的同事称为"一株多化合物(OSMAC)"[3]。
在广泛查阅文献的基础上，本文总结了应用OSMAC策略的重要和成功的例子，包括改变培养基、改变培养条件、与其他菌株共培养、添加表观遗传修饰剂或生物合成前体[4]。
图1激活微生物沉默基因簇的策略2OSMAC常见方法2.1改变培养基成分及培养方式培养基不仅对微生物生长有较大影响，而且对新陈代谢也有较大影响。
据报道，C/N比、盐度和金属离子可以调节MSM基因表达的程度和模式，导致各种次生代谢产物的产生。
一株海洋来源的Asteromyces cruciatus763菌株在仅含精氨酸的查氏培养基中培养时，产生了一种新的五肽lajollamide A（1），见图2，而不是在正常的查氏培养基中缺失的NaNO3[5]。
图2部分代表化合物的结构式一株曲霉属真菌Aspergillus sp.在富氘查氏肉汤上培养时，从中分离得到了6个生物碱类化合物，而该菌株在PDB培养基中培养时，能代谢一种新的戊烯化吲哚生物碱waikialoid A（2），该生物碱对白色念珠菌生物膜的形成有较强的抑制作用，IC50值为1.4μM[6]。
链霉菌次级代谢产物生物合成基因簇异源表达研究进展
链霉菌次级代谢产物生物合成基因簇异源表达研究进展王苗;王倩【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2018(042)007【总页数】3页(P803-805)【关键词】链霉菌;次级代谢产物;异源表达;生物合成【作者】王苗;王倩【作者单位】遵义医学院/贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室,贵州遵义563003;遵义医学院/贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室,贵州遵义563003【正文语种】中文【中图分类】R394天然活性物质的合成、调控和抗性基因都是成簇的排列在微生物基因组内，通过基因工程等技术，将目的基因转移至不同的宿主菌内异源表达，不仅能够激活沉默基因簇，且可将异源表达体系作为一个非常有用的工具，通过生物合成或组合生物合成的方法生产出更多结构新颖且功能独特的实用天然产物或其衍生物[1-2]。
本文针对近年来在链霉菌体内次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达研究进展进行综述，着重介绍了链霉菌次级代谢产物非核糖体肽酶(NRPSs) 、聚酮合酶(PKSs)和杂合NRPS/PKSs基因簇异源表达研究的方法及研究过程中需解决的问题，进而对近些年异源表达天然产物的新研究思路进行汇总及展望，以期为新药的研发及合成药的高效表达提供良好的来源和途径。
1 微生物异源表达体系功能介绍及应用近年来，微生物来源基因簇异源表达的研究逐步成为医药、生物和化学界长期的研究内容。
随着对微生物基因簇研究的深入，特别是一些不可培养微生物基因或沉默基因的激活表达研究，技术水平上迫切需要强大的功能齐全的异源表达体系来生产这些化合物，从而获得更多结构新颖且功能独特的实用新型活性物质 [3-4]。
将整个或部分抗生素的基因簇插入与其原始产生菌不同源的适宜宿主菌内表达，使其产生该抗生素完整结构或部分结构的过程，主要策略包括：生物信息学预测、克隆基因簇、修饰基因簇、转移基因簇、功能性表达基因、比较分析代谢产物图谱等，这种研究手段称为异源表达,生产这些活性化合物即建立基因簇异源表达体系 [5]。
拮抗水稻病原菌假单胞菌ＡＨ_菌株的鉴定及全基因组序列分析
拮抗水稻病原菌假单胞菌ＡＨ菌株的鉴定及全基因组序列分析胡逸群，沈文杰，陈晴晴，张爱芳∗㊀（安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，安徽合肥２３０００１）摘要㊀［目的］探究菌株ＡＨ的生防潜力和基因组序列信息，以解析其防病机制，挖掘次级代谢产物基因资源㊂［方法］采用稀释涂布平板法分离水稻的叶际微生物，筛选具有拮抗效果的菌株；根据形态学㊁１６ＳｒＤＮＡ和ｇｙｒＢ基因测序和系统发育分析，鉴定其种属；利用平板抑菌试验明确其抑菌谱；大田喷施菌悬液明确其防治效果㊂继而，利用第二代Ｉｌｌｕｍｉｎａ与第三代ＰａｃＢｉｏ结合的测序方法对生防菌进行全基因组测序，对测序数据进行基因组组装㊁基因预测与功能注释㊁次级代谢产物合成基因簇预测等分析㊂［结果］ＡＨ是一株短杆状恶臭假单胞菌株，对稻瘟病菌㊁茎点霉菌㊁水稻纹枯病菌和水稻黄单胞菌具有广谱抗菌活性，且田间施用ＡＨ菌液可显著降低水稻白叶枯病和稻瘟病的病害等级㊂抗生素敏感性测试揭示菌株ＡＨ对氨基糖苷类抗生素高度敏感㊂ＡＨ基因组全长为５８８９１２５ｂｐ，编码５２１５个基因，ＧＣ含量为６３．７４％，有１９个ｒＲＮＡ㊁７７个ｔＲＮＡ和７８个ｎＲＮＡ，ａｎｔｉＳＭＡＳＨ预测得到８个次级代谢产物合成基因簇㊂［结论］ＡＨ菌株具有良好生防潜力，深层机制解析可为病害防控提供科学依据㊂关键词㊀恶臭假单胞ＡＨ；生物防治；稻瘟病；水稻白叶枯病中图分类号㊀Ｓ４３５．１１㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）２０－０１３８－０９ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．２０．０３４㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＷｈｏｌｅＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＡＨＳｔｒａｉｎＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｔｏＲｉｃｅＰａｔｈｏｇｅｎｓＨＵＹｉ⁃ｑｕｎ，ＳＨＥＮＷｅｎ⁃ｊｉｅ，ＣＨＥＮＱｉｎｇ⁃ｑｉｎｇｅｔａｌ㊀（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＡｇｒｏ⁃ｐｒｏｄｕｃｔｓＳａｆｅｔｙ，ＡｎｈｕｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒ⁃ａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ２３０００１）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｄｇｅｎｏｍｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎＡＨｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｔｏｒｅｖｅａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｄｉｓｅａｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｇｅｎｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｓｐｒｅａｄｉｎｇｐｌａｔｅｓｗａｓｕｓｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍｒｉｃｅｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，１６ＳｒＤＮＡａｎｄｇｙｒＢｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｆｌａｔｓｔａｎｄｏｆｆｔｅｓｔａｎｄｓｐｒａ⁃ｙｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｉｎｆｉｅｌｄｃｌａｒｉｆｉｅｄｉｔｓｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＡＨｓｔｒａｉｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇａｔｈｉｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＰａｃｂｉｏＳＭＲＴｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍａｎｄｓｅｃｏｎｄ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＩｌｌｕｍｉｎａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｎ，ｇｅｎｏｍｅａｓｓｅｍｂｌｙ，ｇｅｎｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，ａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．［Ｒｅｓｕｌｔ］ＡＨｗａｓａｓｈｏｒｔｒｏｄｓｔｒａｉｎ，ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ，ａｎｄｓｈｏｗｅｄｂｒｏａｄ⁃ｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｇａｉｎｓｔＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ，Ｐｈｏｍａｓｐ．，Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ，ａｎｄＸａｎ⁃ｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅ．ＳｐｒａｙｉｎｇＡＨｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｄｉｓｅａｓｅｇｒａｄｅｃａｕｓｅｄｂｙｂａｃｔｅｒｉａｌｂｌｉｇｈｔａｎｄｂｌａｓｔｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉ⁃ｔｙｔｅｓｔｉｎｇｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔＡＨｓｈｏｗｅｄｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．ＴｈｅｔｏｔａｌｌｅｎｇｔｈｏｆＡＨｇｅｎｏｍｅｗａｓ５８８９１２５ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ５２１５ｇｅｎｅｓｗｉｔｈ６３．７４％ＧＣｃｏｎｔｅｎｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１９ｒＲＮＡ，７７ｔＲＮＡａｎｄ７８ｎＲＮＡ．Ａｎｄ，ｅｉｇｈｔｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｓｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙａｎｔｉＳＭＡＳＨｐｌａｔｆｏｒｍｉｎＡＨｇｅｎｏｍｅ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＢａｓｅｄｏｎｇｏｏｄｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＡＨｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｅｅｐｍｅｃｈａｎｉｓｍｃａｎｐｒｏｖｉｄｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｂａｓｉｓｆｏｒｄｉｓｅａｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＡＨ；Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ；Ｒｉｃｅｂｌａｓｔ；Ｒｉｃｅｂａｃｔｅｒｉａｌｂｌｉｇｈｔ基金项目㊀国家自然科学基金项目（３２２０２２７３）；安徽省自然科学基金项目（２１０８０８５ＱＣ１１７）㊂作者简介㊀胡逸群（１９９２ ），女，安徽灵璧人，助理研究员，博士，从事水稻病原菌致病机制和病原菌与生防菌互作研究㊂∗通信作者，研究员，从事水稻抗病性鉴定与病原菌致病机制研究㊂收稿日期㊀２０２３－０５－１２㊀㊀为缓解农药过度施用与环境保护之间的矛盾，微生物来源的生防菌剂或制品有较好的开发前景㊂假单胞菌属㊁芽孢杆菌属和木霉属来源的微生物，对多种植物或动物病原菌具有良好的抑菌活性，因此被广泛用作生物防治剂［１－４］㊂假单胞菌属具有代谢多样性的特点，可产生多种次级代谢产物，如吩嗪类物质（ｐｈｅｎａｚｉｎｅｓ）㊁硝吡咯菌素（ｐｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎ）㊁２，４－二乙酰基间苯三酚（２，４－ｄｉａｃｅｔｙｌｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ）㊁黄绿菌素（ｐｙｏｃｙａｎｉｎ）和环脂肽（ｃｙｃｌｉｃｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＬＰｓ）等㊂此外，假单胞菌属细菌也能通过诱导系统抗性的方式，抑制病原菌定殖或生长，对植物具有保护作用［５－８］㊂铜绿假单胞菌Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＵＰＭＰ３菌株合成的吩嗪粗提物，可显著减轻狭长孢灵芝引起的油棕榈茎基底感染［９］㊂从苹果花上分离的Ｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌＦ９菌株表现出对火疫病菌的良好拮抗特性［１０］㊂此外，大多数假单胞菌属菌株可作为植物根际促生菌，分泌生长调节剂来增强植物防御病原菌的能力㊂从印度青蒿根际分离的Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ可以促进植物生长，且对植物病原菌链格孢㊁黄曲霉和尖孢镰刀菌表现出很好的生防活性［１１］㊂恶臭假单胞Ｐ．ｐｕｔｉｄａ与近缘物种Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ和Ｐ．ｂｒａｓ⁃ｓｉｃａｃｅａｒｕｍ可作为生物防治剂和植物生长促进剂［１２－１３］㊂Ｐ．ｐｕｔｉｄａ与其他有益微生物复合施用时，显著增加了水果营养元素的含量［１４－１５］㊂Ｐ．ｐｕｔｉｄａＢ２０１７菌株通过产生铁载体ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ来抑制植物病原菌［１６］㊂在有益于植物的同时，生防菌也需要使自己免于如活性氧爆发之类的快速且强烈的植物防御反应所导致的损伤㊂Ｐ．ｐｕｔｉｄａＲＲＦ３通过改变根部基因的转录表达来刺激植物产生防御反应，并通过改变根际的化合物组分来保护自身［１７］㊂一直以来，我国稻米主产区的真菌㊁细菌病害频发，稻瘟病菌可在水稻营养生长期侵染叶片导致叶瘟，在生殖生长期侵染稻穗导致穗颈瘟，严重降低稻米产量和品质［１８］㊂镰孢菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ的复合侵染，如藤仓镰孢菌Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ㊁层出镰孢菌Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ㊁拟轮枝镰孢菌Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ等，会降低种子发芽率，或引起水稻恶苗病［１９］㊂此外，黄单胞菌Ｘａｎ⁃ｔｈｏｍｏｎａｓ是一类重要的植物病原细菌，可侵染４００多种植物，包括稻㊁棉㊁豆等粮食作物和柑橘㊁香蕉和木薯等经济作物［２０］㊂其中，Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ和Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ是稻黄单胞的２个致病变种，分别引起水稻白叶枯病和细菌性条㊀㊀㊀安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（２０）：１３８－１４６斑病，危害严重［２１－２２］㊂面对防病增产与生态保护之间日益突出的矛盾，广谱抑菌菌株的开发利用是减少化学制剂使用㊁降低环境污染的有效策略㊂叶际微生物的生境更为复杂多变，具备良好的环境适应性和多种生防机制㊂基于此，笔者通过分离水稻叶片微生物㊁平板对峙筛选拮抗菌株㊁多基因测序和系统发育分析鉴定得到一株具有良好抗菌活性的恶臭假单胞Ｐ．ｐｕｔｉｄａＡＨ菌株，田间试验明确其对水稻白叶枯病和稻瘟病具有防治效果㊂利用第二代Ｉｌｌｕｍｉｎａ与第三代ＰａｃＢｉｏ结合的方法进行全基因组测序，并对测序数据进行基因组组装㊁基因预测与功能注释㊁次级代谢产物合成基因簇分析，为ＡＨ菌株的基因功能研究提供分子遗传信息㊂恶臭假单胞Ｐ．ｐｕｔｉｄａＡＨ菌株的研究可为水稻病害防控提供科学依据㊂１㊀材料与方法１．１㊀供试菌株和培养条件㊀稻瘟病菌Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ㊁纹枯病菌Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ㊁茎点霉菌Ｐｈｏｍａｓｐ．㊁水稻白叶枯病菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ㊁尖孢镰孢菌Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏ⁃ｒｕｍ㊁层出镰孢菌Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ㊁短小杆菌Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．，均保存于笔者所在实验室㊂细菌培养用ＬＢ培养基，白叶枯病菌培养用ＮＡ培养基，培养条件为２８ħ，保存介质为５０％甘油㊂真菌培养用ＰＤＡ培养基，培养条件为２８ħ，无菌滤纸对菌丝块进行低温保存㊂１．２㊀稻瘟拮抗细菌的分离和筛选㊀为从水稻叶际分离稻瘟病菌的拮抗细菌，用无菌剪刀将水稻叶片组织切成小块，在无菌水中浸泡３０ｍｉｎ，６０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ获得上清液㊂将悬浮液进行梯度稀释（１０－２㊁１０－３㊁１０－４㊁１０－５），取不同浓度的稀释液５０μＬ涂布于３个ＬＢ板上，平板于２８ħ培养２ｄ㊂挑取形态差异的单菌落进一步纯化保存，用于拮抗菌的筛选㊂稻瘟病菌孢子液稀释至２ˑ１０７个／ｍＬ，涂布ＰＤＡ平板后，２８ħ培养３ｄ㊂取２μＬ上述细菌菌液滴于上述平板，２８ħ培养３ｄ，周围有抑菌圈的细菌即为目的菌，纯化并保存㊂１．３㊀拮抗细菌的形态观察㊀取２０μＬ新鲜菌悬液滴到碳膜铜网，静置５ｍｉｎ后用滤纸吸去多余液体㊂将２％磷钨酸滴在碳膜铜网，静置染色２ｍｉｎ后用滤纸吸去多余液体，室温干燥㊂在透射电子显微镜下观察细菌形态，采集图像分析㊂１．４㊀细菌分类鉴定㊀利用细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取基因组ＤＮＡ㊂使用细菌通用引物［２３］扩增１６ＳｒＤＮＡ基因（２７Ｆ，５ᶄ－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ－３ᶄ；１４９２Ｒ，５ᶄ－ＡＣＧ⁃ＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３ᶄ）㊂使用特异性引物扩增ｇｙｒＢ序列（Ｆ，５ᶄ－ＧＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＴＧＴＧ－３ᶄ；Ｒ，５ᶄ－ＧＴＣＧＡＴＣＡＴＣＴＴＧＣＣＡＡＣＧＡＣＣＧＣ－３ᶄ）㊂ＰＣＲ扩增产物经过纯化后送生工生物技术公司进行测序㊂测序结果与ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）中核酸数据进行比对，选择同源性较高的近缘物种序列，利用ＭＥＧＡＸ软件使用邻接法构建系统发育树㊂１．５㊀平板对峙试验㊀５种植物病原菌（Ｍ．ｏｒｙｚａｅ，Ｒ．ｓｏｌａｎｉ，Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ，Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）和２种附生菌（Ｐｈｏｍａｓｐ．，Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）作为拮抗测试的靶标菌㊂将上述分离得到的拮抗细菌在液体ＬＢ中培养至生长对数期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．０），用于平板对峙试验㊂拮抗真菌试验：将新鲜菌丝块放置在ＰＤＡ平板中央，将２μＬ拮抗细菌菌悬液滴在平板边缘㊂平板于２８ʎＣ培养箱培养３ ７ｄ，拍照并记录数据㊂拮抗细菌试验：将靶标菌的菌悬液（ＯＤ６００ｎｍ＝１．０）稀释１００倍，涂布于ＬＢ平板，２８ʎＣ培养１ｄ后再将２μＬ拮抗细菌的菌悬液滴在上述平板边缘㊂平板放置在２８ʎＣ培养箱培养３ｄ，拍照并记录数据㊂１．６㊀田间防治试验㊀籼稻常规稻品种ＷＨ２６作为参试材料，评价拮抗细菌对水稻３种病害（稻瘟病㊁水稻白叶枯病㊁细菌性条斑病）的田间防治效果㊂１月龄的水稻苗用于接种病原菌㊂病原菌接种前１和３ｄ，分别用拮抗菌的菌悬液（ＯＤ６００ｎｍ＝０．５）均匀喷施水稻幼苗，以叶片布满微液滴为限㊂水稻白叶枯病菌接种：用无菌剪刀沾取Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ的菌悬液（ＯＤ６００ｎｍ＝０．５），在距离叶尖边缘约２ｃｍ处剪下叶片㊂选取１０株水稻，每株取３片叶片进行接种处理㊂接种１４ｄ后进行病斑长度测量㊂水稻细菌性条斑病菌接种：用无针头的１ｍＬ注射器将Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ菌悬液（ＯＤ６００ｎｍ＝０．５）注入水稻叶片的细胞间隙，注意避免对植物造成另外的机械损伤㊂选取１０株水稻，每株取３片叶片进行接种处理㊂接种７ｄ后进行病斑长度测量㊂稻瘟病菌接种：将Ｍ．ｏｒｙｚａｅ孢子悬液浓度调整为２ˑ１０５个／ｍＬ，均匀喷施于水稻叶片，以叶片布满微液滴为限，接种７ｄ后观察统计发病情况㊂１．７㊀抗生素敏感性试验㊀采用平板加药法测试拮抗细菌对庆大霉素（Ｇｍ）㊁卡那霉素（Ｋｎ）㊁氨苄霉素（Ａｍｐ）和利福平（Ｒｉｆ）的敏感性㊂固体ＬＢ培养基中分别加入上述抗生素，配制终浓度分别为２０．０㊁１０．０㊁５．０㊁２．５μｇ／ｍＬ的抗生素平板㊂将拮抗菌的菌悬液（ＯＤ６００ｎｍ＝１．０）稀释１００倍，均匀涂布于上述平板，２８ħ培养１ｄ，拍照并计数菌落㊂１．８㊀细菌全基因组测序㊀第二代Ｉｌｌｕｍｉｎａ与第三代ＰａｃＢｉｏ结合的测序方法进行全基因组测序㊂离心收集新鲜的ＡＨ菌体，试剂盒法提取基因组ＤＮＡ（ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ，ＴａＫａＲａ）㊂使用Ｇ－ｔｕｂｅｓ（Ｃｏｖａｒｉｓ）剪切基因组ＤＮＡ，ＥＸＯＶＩＩ处理ＤＮＡ并进行ＤＮＡ末端修复，制备ＳＭＲＴｂｅｌｌＤＮＡ文库㊂基因组的从头组装基于三代数据，使用ｆａｌｃｏｎ进行原始数据的自我矫正及基因组初步组装，得到一致性序列㊂使用ＧｅｎｏｍｉｃＣｏｎｓｅｎｓｕｓ软件对原始数据再次矫正，使用ｓｐｒａｉ对一致性序列进行环化处理，得到环化的细菌基因组［２４］，Ｃｉｒｃｏｓ软件构建基因组圈图［２５］㊂使用Ｐｒｏｄｉｇａｌ软件预测编码基因［２６］，Ｒｆａｍ预测非编码ＲＮＡ［２７］㊂２㊀结果与分析２．１㊀生防细菌的分离㊀通过稻瘟孢子液平板的筛选方法，分离得到５株具有抑菌作用的细菌菌株，其中抑菌作用最显著的一株命名为ＡＨ，对其进行后续研究㊂在ＰＤＡ培养基上培养２ｄ后，ＡＨ菌落形态为黄白色，表面粗糙，边缘凹陷（图１Ａ㊁Ｂ）㊂在ＬＢ培养基上，ＡＨ菌落形态与ＰＤＡ培养基相似，菌体更为致密（图１Ｃ㊁Ｄ）㊂透射电镜观察到ＡＨ呈短杆菌（图１Ｅ㊁Ｆ）㊂９３１５１卷２０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀胡逸群等㊀拮抗水稻病原菌假单胞菌ＡＨ菌株的鉴定及全基因组序列分析注：使用平板划线法（Ａ，Ｃ）和菌液悬滴法（Ｂ，Ｄ），分别在ＰＤＡ培养基（Ａ，Ｂ）和ＬＢ培养基（Ｃ，Ｄ）培养菌株ＡＨ㊂透射电镜观察菌体形态（Ｅ：５．０μｍ；Ｆ：５００ｎｍ）㊂Ｎｏｔｅ：ＳｔｒａｉｎＡＨｗａｓｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎＰＤＡｍｅｄｉｕｍ（Ａ，Ｂ）ａｎｄＬＢｍｅｄｉｕｍ（Ｃ，Ｄ）ｂｙｓｔｒｅａｋｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ（Ａ，Ｃ）ａｎｄｄｒｏｐｐｉｎｇｐｌａｔｅｏｆｌｉｑｕｉｄｂａｃｔｅｒｉａｌｃｕｌ⁃ｔｕｒｅ（Ｂ，Ｄ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｐ．ｐｕｔｉｄａＡＨｓｔｒａｉｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＴＥＭ），ｗｈｉｃｈｗａｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２％ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃａｃｉｄｏｎｔｈｅｃｏｐｐｅｒｇｒｉｄｔｏｓｔａｉｎｆｏｒ２ｍｉｎｏｎ５．０μｍ（Ｅ）ａｎｄ５００ｎｍ（Ｆ）ｓｃａｌｅ．图１㊀菌株ＡＨ的形态学特征Ｆｉｇ．１㊀ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｓｔｒａｉｎＡＨ２．２㊀生防细菌的鉴定㊀ＡＨ的１６ＳｒＤＮＡ基因序列长度为１４０５ｂｐ，ＢＬＡＳＴ比对结果显示该序列与Ｐ．ｐｕｔｉｄａ㊁Ｐ．ｗａｙａｍ⁃ｂａｐａｌａｔｅｎｓｉｓ㊁Ｐ．ｍｕｙｕｋｅｎｓｉｓ㊁Ｐ．ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ㊁Ｐ．ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ㊁Ｐ．ｓｈｉｒａｚｉｃａ和Ｐ．ａｓｉａｔｉｃａ等菌株高度相似，相似度均高于９９．８７％，需进一步确定种属㊂利用特异性引物扩增得到ｇｙｒＢ基因序列，长度为７０８ｂｐ，ＢＬＡＳＴ比对结果显示该序列与Ｐ．ｐｕｔｉｄａＮＸ－１㊁Ｐ．ｐｕｔｉｄａＰＣ２同源性为９７．７４％，与Ｐ．ｗａｙａｍ⁃ｂａｐａｌａｔｅｎｓｉｓＲＷ３Ｓ１相似度为９６．１５％，与Ｐ．ｍｕｙｕｋｅｎｓｉｓＣＯＷ３９相似度为９３．０４％，与Ｐ．ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ各菌株相似度均为９２％㊂利用ＭＥＧＡＸ软件构建系统发育树，表明ＡＨ属于恶臭假单胞菌Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（图２）㊂图２㊀菌株ＡＨ基于ｇｙｒＢ基因的系统发育树Ｆｉｇ．２㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｇｙｒＢｇｅｎｅ０４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年２．３㊀菌株ＡＨ的生防潜力㊀菌株ＡＨ对参试的７种菌株均表现拮抗活性，其中对稻瘟病菌㊁水稻白叶枯病菌㊁短小杆菌和茎点霉抑制作用显著，抑菌圈直径均大于１．３ｃｍ（图３Ａ㊁Ｂ㊁Ｆ㊁Ｇ，图４）㊂对于水稻纹枯病菌㊁尖孢镰孢菌和层出镰孢菌的抑菌圈直径小于１．０ｃｍ（图３Ｃ㊁Ｄ㊁Ｅ，图４）㊂注：平板拮抗测试ＡＨ对稻瘟病菌（Ａ）㊁茎点霉（Ｂ）㊁纹枯病菌（Ｃ）㊁尖孢镰孢菌（Ｄ）㊁层出镰孢菌（Ｅ）㊁短小杆菌（Ｆ）㊁水稻白叶枯病菌（Ｇ）的抑菌活性㊂Ｈ．平板模式图㊂Ｎｏｔｅ：ＴｅｓｔｅｄｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｃｌｕｄｅｄＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ（Ａ），Ｐｈｏｍａｓｐ．（Ｂ），Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ（Ｃ），Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ（Ｄ），Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ（Ｅ），Ｃｕｒｔｏ⁃ｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．（Ｆ），ａｎｄＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ（Ｇ）．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｄｅｌｄｉａｇｒａｍ（Ｈ）．图３㊀菌株ＡＨ对参试菌株的平板拮抗测试Ｆｉｇ．３㊀ＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｅｆｆｉｃａｃｙｏｆＰ．ｐｕｔｉｄａＡＨａｇａｉｎｓｔｔｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓ图４㊀菌株ＡＨ的平板抑菌效果Ｆｉｇ．４㊀ＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｅｆｆｉｃａｃｙｏｆＰ．ｐｕｔｉｄａＡＨａｇａｉｎｓｔｔｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓ㊀㊀田间防治试验中，水稻叶片喷施ＡＨ菌悬液不影响水稻生长（图５Ａ）㊂仅接种稻瘟孢子液时，叶片出现急性型病斑㊁慢性型病斑㊁褐点和白点型病斑的混合症状（图５Ｂ㊁Ｃ）；接种前用ＡＨ菌悬液处理后症状显著减轻㊂水稻白叶枯病菌接种后，叶片呈现黄白色皱缩症状，沿叶脉扩展㊂ＡＨ喷施后症状显著减轻㊂且ＡＨ处理组的叶片皱缩现象比白叶枯病菌接种组的症状延迟３ｄ出现㊂水稻细菌性条斑病菌接种后，接种部位叶片出现黄褐色的短病斑，ＡＨ菌液处理对病害进程无明显影响（图５）㊂说明田间喷施菌株ＡＨ悬液可有效减轻水稻白叶枯病和稻瘟病的病害等级㊂２．４㊀菌株ＡＨ基因组分析㊀采用二代Ｉｌｌｕｍｉｎａ与第三代ＰａｃＢｉｏ结合的测序技术对菌株ＡＨ进行全基因组测序，获得高质量Ｒｅａｄｓ１０２１１４条，数据量１．２７Ｇ㊂ＡＨ基因组长为５８８９１２５ｂｐ，ＧＣ含量为６３．７４％，包含５２１５个编码序列，其中包括１９个ｒＲＮＡ㊁７７个ｔＲＮＡ和７８个ｎＲＮＡ㊂基于ＧＣ偏差㊁ＧＣ含量㊁非编码ＲＮＡ（ｒＲＮＡ为红色表示，ｔＲＮＡ为蓝色表示，ｓＲＮＡ为绿色表示）和ＣＯＧ注释等信息，使用Ｃｉｒｃｏｓ软件构建的基因组圈图见图６㊂全基因组测序数据已提交至ＧｅｎＢａｎｋ，收录号为ＳＡＭＮ３４２０９９４３㊂利用ＮＲ数据库进行蛋白质序列相似性比对显示，共有５１８３个基因被注释，占基因总数的９９．４％；在ＫＥＧＧ数据库中比对得到５１５０个基因，占比９８．８％；在ＣＯＧ㊁Ｓｗｉｓｓ⁃Ｐｒｏｔ和ＧＯ数据库中分别比对得到４１６４㊁３８５８㊁３７１５个基因，占比分别为７９．８％㊁７４．０％和７１．２％㊂㊀㊀对菌株ＡＨ基因组数据进行ＫＥＧＧ和ＧＯ数据库分析，结果见图７㊂ＫＥＧＧ注释结果表明，菌株ＡＨ基因组中有２８１０个编码蛋白的基因富集到六大类４２条代谢通路中㊂其中，代谢功能相关的基因占比最大，其中氨基酸代谢㊁碳水化合物代谢㊁辅酶因子和维生素代谢㊁能量代谢相关通路的１４１５１卷２０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀胡逸群等㊀拮抗水稻病原菌假单胞菌ＡＨ菌株的鉴定及全基因组序列分析数量较高㊂表明菌株ＡＨ具有代谢多样性的特征㊂ＧＯ数据库按照生物过程㊁细胞组分和分子功能三类对菌株ＡＨ基因功能进行分类，其中细胞组分中膜组分相关基因㊁分子功能中的ＡＴＰ结合和金属离子结合相关基因占比较大㊂注：稻瘟病菌（上），水稻细菌性条斑病菌（中）和白叶枯病菌（下）在感病水稻品种ＷＨ２６上的发病情况㊂Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｓｅｖｅｒｉｔｉｅｓｏｆｒｉｃｅｂｌａｓｔ（ｕｐｐｅｒ），ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｅａｆｓｔｒｅａｋ（ｍｉｄｄｌｅ），ａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｂｌｉｇｈｔ（ｌｏｗｅｒ）ｉｎｔｈｅｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｙＷＨ２６ｗｅｒｅｅｘｈｉｂｉ⁃ｔｅｄ．图５㊀菌株ＡＨ对水稻病害的防治效果Ｆｉｇ．５㊀Ｔｈｅｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔａｇａｉｎｓｔｔｈｒｅｅｍａｊｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｓｏｎｒｉｃｅｐｌａｎｔｓ２．５㊀次生代谢产物合成基因簇的预测㊀使用ａｎｔｉＳＭＡＳＨ在线平台对菌株ＡＨ基因组中次级代谢产物合成基因簇进行预测，分析表明该基因组包含８个次级代谢产物基因簇，其中５个是非核糖体肽合成酶（ＮＲＰＳ）基因簇或ＮＲＰＳ－ｌｉｋｅ基因簇（图８㊁表２）㊂根据基因簇同源性，ＡＨ可能合成２类已知的抗菌物质ｖｉｓｃｏｓｉｎ和ｐｕｔｉｓｏｌｖｉｎ㊂分析发现，Ｃｌｕｓｔｅｒ１与ＢＧＣ０００１１００来源的Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｃｈｅｉ的合成基因簇相似性为１３％；Ｃｌｕｓｔｅｒ２和Ｃｌｕｓｔｅｒ５都与ＢＧＣ００００４１３来源的Ｐｓｅｕｄｏ⁃２４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年ｍｏｎａｓｐｒｏｔｅｇｅｎｓＰｆ－５的ｐｙｏｖｅｒｄｉｎ合成基因簇相似，相似度分别为１０％和４％；Ｃｌｕｓｔｅｒ３与ＢＧＣ０００１３１２来源的ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＳＢＷ２５的ｖｉｓｃｏｓｉｎ合成基因簇相似度为５０％㊂Ｃｌｕｓｔｅｒ４与Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ的ｐｕｔｉｓｏｌｖｉｎ合成基因簇相似性为５０％；Ｃｌｕｓｔｅｒ５与ＢＧＣ００００４１３来源的Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｒｏｔｅ⁃ｇｅｎｓＰｆ－５的ｐｙｏｖｅｒｄｉｎ合成基因簇相似性为４％；Ｃｌｕｓｔｅｒ８与ＢＧＣ０００１６９２来源的ＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａＡＴＣＣ１９０６１的ｎｅｍａｔｏｐｈｉｎ合成基因簇相似性为１２％㊂另外Ｃｌｕｓｔｅｒ６和Ｃｌｕｓｔｅｒ７未比对到相似基因簇，暗示菌株ＡＨ中可能存在新物质合成基因簇，具有研究和应用潜力㊂注：Ｃｉｒｃｏｓ（ｖ０．６９）软件绘制菌株ＡＨ的基因组圈图，从内到外分别代表ＧＣ偏移㊁ＧＣ含量㊁非编码ＲＮＡ（红色是ｒＲＮＡ，蓝色是ｔＲＮＡ，绿色是ｓＲ⁃ＮＡ）㊁前导链的ＣＯＧ注释和后随链的ＣＯＧ注释㊂Ｎｏｔｅ：ＴｈｅｍａｐｗａｓｄｒａｗｎｕｓｉｎｇＣｉｒｃｏｓ（ｖ０．６９）．Ｆｒｏｍｔｈｅｃｅｎｔｅｒｔｏｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒｙ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔＧＣｓｋｅｗ，ＧＣｃｏｎｔｅｎｔ，ｎｏｎ⁃ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ（ｒＲＮＡ，ｒｅｄ；ｔＲＮＡ，ｂｌｕｅ；ｓＲＮＡ，ｇｒｅｅｎ），ＣＯＧａｎｎｏｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌｅａｄｉｎｇｓｔｒａｎｄ，ａｎｄＣＯＧａｎｎｏｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌａｇｇｉｎｇｓｔｒａｎｄ．图６㊀菌株ＡＨ的基因组圈图Ｆｉｇ．６㊀ＧｒａｐｈｉｃａｌｃｉｒｃｕｌａｒｍａｐｏｆｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆＰ．ｐｕｔｉｄａＡＨ２．６㊀菌株ＡＨ对氨基糖苷类抗生素高度敏感㊀采用平板加药法对菌株ＡＨ的抗生素敏感性进行测定发现，外源卡那霉素或庆大霉素浓度为２．５μｇ／ｍＬ的条件下，菌株ＡＨ生长出现明显抑制现象；利福平浓度为１０μｇ／ｍＬ时，ＡＨ生长被抑制，２０μｇ／ｍＬ时抑制作用明显；在所有测试浓度下，氨苄霉素均未对ＡＨ生长产生影响（图９）㊂这表明ＡＨ菌株对氨基糖苷类抗生素（庆大霉素和卡那霉素）高度敏感，且抑菌作用存在剂量依赖性㊂３㊀结论与讨论该研究通过平板抑菌测试，筛选得到５株具有生防效果的菌株，其中菌株ＡＨ效果最好，经多基因测序比对，鉴定为恶臭假单胞Ｐ．ｐｕｔｉｄａＡＨ㊂进一步测试发现ＡＨ对植物病原细菌水稻白叶枯菌和病原真菌稻瘟病菌㊁纹枯病菌都有较好的抑菌活性，其抑菌谱具有一定的广谱性，具有研究价值㊂在线平台ａｎｔｉＳＭＡＳＨ预测发现Ｐ．ｐｕｔｉｄａＡＨ中有８个次级代谢产物合成基因簇，可能合成ｖｉｓｃｏｓｉｎ㊁ｐｕｔｉｓｏｌｖｉｎ等抗菌物质㊂ｐｕｔｉｓｏｌｖｉｎ对多种病原菌具有拮抗活性，一般通过破坏细胞膜和抑制ＤＮＡ合成的机制发挥抗菌作用，也能作为生物表面活性剂影响细菌群体感应与生物膜形成［２８］㊂但ＡＨ菌株的合成基因簇与已知基因簇比对的相似度来看，均未超过５０％，仅有Ｃｌｕｓｔｅｒ３与Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＳＢＷ２５的ｖｉｓｃｏｓｉｎ合成基因簇相似度为５０％，Ｃｌｕｓｔｅｒ４与Ｐ．ｐｕｔｉｄａ的ｐｕｔｉｓｏｌｖｉｎ合成基因簇相似性为５０％㊂Ｃｌｕｓｔｅｒ６和Ｃｌｕｓｔｅｒ７未比对到相似基因簇，另外的Ｃｌｕｓｔｅｒ１㊁２㊁５㊁８基因簇与已知菌株基因簇的相似度为１３％㊁１０％㊁４％㊁１２％㊂此外，经过比对发现胺甲萘降解菌株Ｐ．ｐｕｔｉｄａＳｉｍｍｏｎｓ０１㊁Ｐ．ｐｕｔｉｄａＮＢＲＣ１４１６４菌株有６个次级代谢产物合成基因簇，耐低碳氧菌株Ｐ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０有７个合成基因簇［２９］㊂这些结果暗示菌株ＡＨ的８个基因簇除合成上述已知物质，还可能合成其余未报道的物质，具有代谢多样性的特征，有较好的研究和应用潜力㊂３４１５１卷２０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀胡逸群等㊀拮抗水稻病原菌假单胞菌ＡＨ菌株的鉴定及全基因组序列分析注：Ａ．ＫＥＧＧ注释结果；Ｂ．ＧＯ注释结果㊂Ｎｏｔｅ：Ａ．ＫＥＧＧａｎｎｏｔａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ；Ｂ．ＧＯａｎｎｏｔａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ．图７㊀菌株ＡＨ的基因功能分析Ｆｉｇ．７㊀ＧｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＰ．ｐｕｔｉｄａＡＨｇｅｎｏｍｅ４４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年注：ＡｎｔｉＳＭＡＳＨ在线平台预测菌株ＡＨ的次级代谢产物合成相关基因簇，８个基因簇的信息如图㊂不同颜色代表不同类型的基因㊂Ｎｏｔｅ：ＳｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｓｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙａｎｔｉＳＭＡＳＨｏｎｌｉｎｅｐｌａｔｆｏｒｍ．ＥｉｇｈｔｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｓｗｅｒｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄｏｎＰ．ｐｕｔｉｄａＡＨｇｅｎｏｍｅａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｏｒｄｅｒａｎｄｌｅｎｇｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｓｏｆｇｅｎｅｓａｓｓｈｏｗｎ．图８㊀菌株ＡＨ的８个次级代谢产物合成基因簇Ｆｉｇ．８㊀ＳｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｓｉｎＰ．ｐｕｔｉｄａＡＨ表２㊀菌株ＡＨ的８个次级代谢产物合成基因簇信息Ｔａｂｌｅ２㊀ＤｅｔａｉｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｅｉｇｈｔｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｃｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙａｎｔｉＳＭＡＳＨｏｎｌｉｎｅｐｌａｔｆｏｒｍ区域Ｒｅｇｉｏｎ类型Ｔｙｐｅ起始位置Ｆｒｏｍ终止位置Ｔｏ已知相似基因簇Ｍｏｓｔｓｉｍｉｌａｒｋｎｏｗｎｃｌｕｓｔｅｒ相似度Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙʊ％Ｒｅｇｉｏｎ１ｒｅｄｏｘ⁃ｃｏｆａｃｔｅｒ４３２７６２４５４９０９ｌａｎｋａｃｉｄｉｎＣ，ＮＲＰ＋Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ１３Ｒｅｇｉｏｎ２ＮＲＰＳ２３６６０２３２４５０２０６ｌａｎｋａｃｉｄｉｎＣ，ＮＲＰ１０Ｒｅｇｉｏｎ３ＮＲＰＳ２９０１８６７２９６４８５９ｖｉｓｃｏｓｉｎ，ＮＲＰ５０Ｒｅｇｉｏｎ４ＲｉＰＰ⁃ｌｉｋｅ，ＮＲＰＳ３００３７９４３０５０７４４ｐｕｔｉｓｏｌｖｉｎ，ＮＲＰ５０Ｒｅｇｉｏｎ５ＮＲＰＳ３９９３３３３４０４６２８６ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ，ＮＲＰ４Ｒｅｇｉｏｎ６ＮＡＧＧＮ４２８６３８１４３０１１８２ Ｒｅｇｉｏｎ７Ｈｓｅｒｌａｃｔｏｎｅ，ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ５２０８７８１５２２９４０１Ｒｅｇｉｏｎ８ＮＲＰＳ－ｌｉｋｅ５７３２５３０５７７５９６１ｎｅｍａｔｏｐｈｉｎ，ＮＲＰ１２图９㊀菌株ＡＨ的抗生素敏感性测试Ｆｉｇ．９㊀ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆＰ．ｐｕｔｉｄａＡＨ㊀㊀菌株ＡＨ的抗生素敏感性测试结果表明其对氨苄霉素的耐药性很强，而分析ＡＨ菌株的基因组数据发现，其中并不含有编码氨苄霉素抗性的基因，但鉴定得到多个ｒｅｓｉｓｔ⁃ａｎｃｅ⁃ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｔｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＲＮＤ）类型的抗生素外排泵基因，这表明菌株ＡＨ可能是通过外排泵系统来阻止氨苄霉素的外源施加对细菌造成的损伤㊂除ＲＮＤ类５４１５１卷２０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀胡逸群等㊀拮抗水稻病原菌假单胞菌ＡＨ菌株的鉴定及全基因组序列分析外排泵外，ＡＨ基因组中还鉴定到ｓｍａｌｌｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＳＭＲ）类的外排泵，靶向氨基糖苷类抗生素㊂而抗生素敏感性测试表明菌株ＡＨ对氨基糖苷类抗生素高度敏感，推测可能是由于相关基因表达水平较低或发生沉默而无法发挥蛋白正常功能，导致菌株ＡＨ不足以防御氨基糖苷类抗生素㊂菌株ＡＨ的全基因组数据为后续分子操纵提供了遗传信息，也为深层的防病机制解析提供了基础㊂参考文献［１］ＢＩＥＳＳＹＡ，ＦＩＬＩＯＮＭ．ＰｈｅｎａｚｉｎｅｓｉｎｐｌａｎｔａｇａｉｎｓｔｔｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｂｅｎｅｆｉｃｉａｌＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｐ．：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｅｎ⁃ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１８，２０（１１）：３９０５－３９１７．［２］ＦＩＲＡＤ，ＤＩＭＫＩＣᶄＩ，ＢＥＲＩＣᶄＴ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓｂｙＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８，２８５：４４－５５．［３］ＹＩＮＮ，ＺＨＡＯＪＬ，ＬＩＵＲ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｉｃａｃｙｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓｓｔｒａｉｎＢｃ⁃ｃｍ１０３ａｇａｉｎｓｔＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｎｃｏｇｎｉｔａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅ，２０２１，１０５（８）：２０６１－２０７０．［４］ＢＡＬＴＨＡＺＡＲＣ，ＮＯＶＩＮＳＣＡＫＡ，ＣＡＮＴＩＮＧ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．ａｎｄＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｐ．ａｇａｉｎｓｔＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａａｎｄｏｔｈｅｒｃａｎ⁃ｎａｂｉｓｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０２２，１１２（３）：５４９－５６０．［５］ＢＯＮＮＩＣＨＳＥＮＬ，ＳＶＥＮＮＩＮＧＳＥＮＮＢ，ＲＹＢＴＫＥＭ，ｅｔａｌ．Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｂｉｏ⁃ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｖｉｓｃｏｓｉｎｅｎｈａｎｃｅｓｄｉｓｐｅｒｓａｌｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＳＢＷ２５ｂｉｏｆｉｌｍｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｅａｄｉｎｇ），２０１５，１６１（１２）：２２８９－２２９７．［６］ＪＵＮＳＲ，ＷＡＳＳＥＮＡＡＲＴＭ，ＮＯＯＫＡＥＷＩ，ｅｔａｌ．ＤｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｓｅｕｄｏ⁃ｍｏｎａｓｇｅｎｏｍｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｏｐｕｌｕｓ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｓｏｌａｔｅｓ，ａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｃｏｍ⁃ｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，８２（１）：３７５－３８３．［７］ＮＡＮＤＩＭ，ＳＥＬＩＮＣ，ＢＲＡＳＳＩＮＧＡＡＫＣ，ｅｔａｌ．ＰｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎａｎｄｈｙｄｒｏｇｅｎｃｙａｎｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓｓｔｒａｉｎＰＡ２３ｅｘｈｉｂｉｔｓｎｅ⁃ｍａｔｉｃｉｄａｌａｎｄｒｅｐｅｌｌｅｎｔａｃｔｉｖｉｔｙａｇａｉｎｓｔＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１５，１０（４）：１－１９．［８］ＭＩＳＨＲＡＪ，ＡＲＯＲＡＮＫ．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｓｅｕｄｏ⁃ｍｏｎａｄｓｉｎｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓｆｏｒｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ａｐ⁃ｐｌｉｅｄｓｏｉｌｅｃｏｌｏｇｙ，２０１８，１２５：３５－４５．［９］ＰＡＲＶＩＮＷ，ＧＯＶＥＮＤＥＲＮ，ＯＴＨＭＡＮＲ，ｅｔａｌ．ＰｈｅｎａｚｉｎｅｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏ⁃ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＵＰＭＰ３ｉｎｄｕｃｅｄｔｈｅｈｏｓｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｏｉｌｐａｌｍ（ＥｌａｅｉｓｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓＪａｃｑ．）⁃Ｇａｎｏｄｅｒｍａｂｏｎｉｎｅｎｓｅｐａｔｈｏｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｐｏｒｔｓ，２０２０，１０（１）：１－１２．［１０］ＺＥＮＧＥＲＥＲＶ，ＳＣＨＭＩＤＭ，ＢＩＥＲＩＭ，ｅｔａｌ．ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｒｉｅｎｔａｌｉｓＦ９：Ａｐｏｔｅｎｔａｎｔａｇｏｎｉｓｔａｇａｉｎｓｔｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓｗｉｔｈｐｈｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｉｎｔｈｅａｐ⁃ｐｌｅｆｌｏｗｅｒ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１８，９：１－１３．［１１］ＣＨＡＮＤＲＡＨ，ＫＵＭＡＲＩＰ，ＢＩＳＨＴＲ，ｅｔａｌ．ＰｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｎｇＰｓｅｕｄ⁃ｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｆｒｏｍＶａｌｅｒｉａｎａｗａｌｌｉｃｈｉｉｄｉｓｐｌａｙｓａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌａｇａｉｎｓｔｔｈｒｅｅｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｒｅｐｏｒｔｓ，２０２０，４７（８）：６０１５－６０２６．［１２］ＢＬＡＫＮＥＹＡＪＣ，ＰＡＴＴＥＮＣＬ．Ａｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈ⁃ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｃｏｍｐｌｅｘｏｆｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｅｃｏｌｏｇｙ，２０１１，７７（３）：５４６－５５７．［１３］ＰＡＳＴＯＲＮ，ＭＡＳＣＩＡＲＥＬＬＩＯ，ＦＩＳＣＨＥＲＳ，ｅｔａｌ．ＰｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＰｓｅｕｄｏ⁃ｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＰＣＩ２ｆｏｒｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｏｍａｔｏｐｌａｎｔｓａｇａｉｎｓｔｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，７３（３）：３４６－３５３．［１４］ＫＯＹＪ，ＫＩＭＪＳ，ＫＩＭＫＤ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ⁃ｂｅｈａｖｉｏｒｓａｇａｉｎｓｔＤｉａｐｏｒｔｈｅｃｉｔｒｉｂｙｐｒｅ⁃ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａｓｔｒａｉｎＴＨＪ６０９⁃３ｏｎｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆｃｉｔｒｕｓｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，５２（１０）：８７９－８８３．［１５］ＨＥＹ，ＰＡＮＴＩＧＯＳＯＨＡ，ＷＵＺ，ｅｔａｌ．Ｃｏ⁃ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ａｎｄＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓａｃｔｓａｓａｂｉｏｓｔｉｍｕｌａｎｔｔｏｐｒｏｍｏｔｅｇｒｏｗｔｈ，ｙｉｅｌｄａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｕｐｔａｋｅｏｆｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆａｐ⁃ｐｌｉｅｄｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１９，１２７（１）：１９６－２０７．［１６］ＤＡＵＲＡ⁃ＰＩＣＨＯ，ＨＥＲＮÁＮＤＥＺＩ，ＰＩＮＹＯＬ⁃ＥＳＣＡＬＡＬ，ｅｔａｌ．Ｎｏａｎｔｉｂｉ⁃ｏｔｉｃａｎｄｔｏｘｉｃｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａｓｔｒａｉｎＢ２０１７［Ｊ］．ＦＥＭＳｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ，２０２０，３６７（９）：１－９．［１７］ＫＡＮＤＡＳＷＡＭＹＲ，ＲＡＭＡＳＡＭＹＭＫ，ＰＡＬＡＮＩＶＥＬＲ，ｅｔａｌ．ＩｍｐａｃｔｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＲＲＦ３ｏｎｔｈｅｒｏｏｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｏｆｒｉｃｅｐｌａｎｔｓ：Ｉｎ⁃ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｒｏｏｔｅｘｕｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１９，４４（４）：９８．［１８］ＧＵＰＴＡＬ，ＶＥＲＭＡＮＩＭ，ＫＡＵＲＡＨＬＵＷＡＬＩＡＳＫ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｖｉｒｕ⁃ｌｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ：Ｄｉｓｅａｓｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｒｅ⁃ｃｅｎｔｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓｆｏｒｄｉｓｅａｓｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｉｎｒｉｃｅｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，２０２１，１２（３）：１７４－１８７．［１９］ＣＥＮＹＫ，ＬＩＮＪＧ，ＷＡＮＧＹＬ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｐｒｏｄｕｃｅｒＦｕｓａｒｉｕｍｆｕｊｉｋｕｒｏｉ：Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｔｏｏｌｋｉｔ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０２０，８：１－１７．［２０］ＮＡＫＡＹＩＮＧＡＲ，ＭＡＫＵＭＩＡ，ＴＵＭＵＨＡＩＳＥＶ，ｅｔａｌ．Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｂａｃｔｅ⁃ｒｉｏｐｈａｇｅｓ：Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅｉｒｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎａｇｒｉｃｕｌ⁃ｔｕｒｅ［Ｊ］．ＢＭＣｉｎｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０２１，２１（１）：１－２０．［２１］ＪＩＡＮＧＮ，ＹＡＮＪ，ＬＩＡＮＧＹ，ｅｔａｌ．ＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｉｒＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈｂａｃｔｅｒｉａｌｂｌｉｇｈｔ／ｌｅａｆｓｔｒｅａｋｐａｔｈｏｇｅｎｓ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅ）ｉｎｒｉｃｅ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）⁃ａｎｕｐｄａｔｅｄｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｒｉｃｅ，２０２０，１３（１）：１－１２．［２２］ＫＵＭＡＲＡ，ＫＵＭＡＲＲ，ＳＥＮＧＵＰＴＡＤ，ｅｔａｌ．Ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔｏｆｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｔｏｏｌｓｔｏｗａｒｄｇａｉｎｉｎｇａｂｅｔｔｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｒｉｃｅ－Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｄｕｒａｂｌｅｂａｃｔｅｒｉａｌｂｌｉｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ，２０２０，１１：１－２３．［２３］ＬＡＭＩＣＨＨＡＮＥＪＲ，ＢＡＬＥＳＴＲＡＧＭ，ＶＡＲＶＡＲＯＬ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｐｏｔａ⁃ｔｏｓｏｆｔｒｏｔｃａｕｓｅｄｂｙＥｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ（ｓｙｎｏｎｙｍＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｒｏｔｏ⁃ｖｏｒｕｍ）ｉｎＮｅｐａｌ：Ａｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅ，２０１０，９４（３）：３８２．［２４］ＨＵＮＴＭ，ＳＩＬＶＡＮＤ，ＯＴＴＯＴＤ，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｌａｔｏｒ：Ａｕｔｏｍａｔｅｄｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａ⁃ｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｅａｓｓｅｍｂｌｉｅｓｕｓｉｎｇｌｏｎｇｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅａｄｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅｂｉｏｌｏ⁃ｇｙ，２０１５，１６（１）：１－１０．［２５］ＫＲＺＹＷＩＮＳＫＩＭ，ＳＣＨＥＩＮＪ，ＢＩＲＯＬＩ，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｏｓ：Ａｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｅｓ⁃ｔｈｅｔｉｃｆｏｒｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１９（９）：１６３９－１６４５．［２６］ＨＹＡＴＴＤ，ＣＨＥＮＧＬ，ＬＯＣＡＳＣＩＯＰＦ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｄｉｇａｌ：Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｇｅｎｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｓｉｔｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢＭＣｂｉｏｉｎｆｏｒ⁃ｍａｔｉｃｓ，２０１０，１１（１）：１－１１．［２７］ＧＲＩＦＦＩＴＨＳ⁃ＪＯＮＥＳＳ，ＢＡＴＥＭＡＮＡ，ＭＡＲＳＨＡＬＬＭ，ｅｔａｌ．Ｒｆａｍ：ＡｎＲＮＡｆａｍｉｌｙｄａｔａｂａｓｅ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，３１（１）：４３９－４４１．［２８］ＣÁＲＣＡＭＯ⁃ＯＹＡＲＣＥＧ，ＬＵＭＪＩＡＫＴＡＳＥＰ，ＫÜＭＭＥＲＬＩＲ，ｅｔａｌ．ＱｕｏｒｕｍｓｅｎｓｉｎｇｔｒｉｇｇｅｒｓｔｈｅｓｔｏｃｈａｓｔｉｃｅｓｃａｐｅｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｃｅｌｌｓｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏ⁃ｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａｂｉｏｆｉｌｍｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１５，６：１－９．［２９］ＤＥＭＬＩＮＧＰ，ＡＮＫＥＮＢＡＵＥＲＡ，ＫＬＥＩＮＢ，ｅｔａｌ．ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０ｅｎｄｕｒｅｓｔｅｍｐｏｒａｒｙｏｘｙｇｅｎｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｂｉｏｅｎｇｉ⁃ｎｅｅｒｉｎｇ，２０２１，１１８（１２）：４７３５－４７５０．６４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年。
微生物次级代谢产物合成基因簇预测分析
Analysis tools of antiSMASH
NCBI BLAST+ HMMer 3, Muscle 3 Glimmer 3 FastTree
TreeGraph 2 Indigo-depict PySVG JQuery SVG
19
Pipeline for genomic analysis of secondary metabolites
PKS PKS PKS (neg.)
PKS PKS PKS
PKS_KS PKS_AT fabH
ene_KS mod_KS t2clf
SMART SMART This study
Yadav et al. (2009) Yadav et al. (2009) This study
Terpene Terpene ……….
gene prediction by Glimmer3 (prokaryotic data) or GlimmerHMM
(eukaryotic data) Transform the predicted results to EMBL format
21
Detection of gene clusters
nonribosomal peptides 非核糖体肽(NRP) bacteriocins 细菌素 aminocoumarins 基香豆素
butyrolactones 丁内酯
terpenes 萜烯 beta-lactams β-内酰胺 siderophores 铁载体
indoles 吲哚类
lantibiotics 羊毛硫抗生素
22
NRPS/PKS domain architecture analysis
五种海洋微生物次级代谢产物的研究的开题报告
五种海洋微生物次级代谢产物的研究的开题报告
标题：五种海洋微生物次级代谢产物的研究
摘要：
海洋微生物是海洋生态系统中最为丰富和多样化的生物群体之一，其次级代谢产物因具有广泛的生物活性和药用价值，在药物研发和工业应用上已经引起了广泛关注。
本研究选取了五种海洋微生物，包括：色素亚硝酸盐还原菌、蓝细菌、鸟枪菌、链霉菌和放线菌，采用发酵技术，研究其次级代谢产物。
本研究计划通过以下几个步骤来完成：
1. 微生物菌株的筛选和培养。
通过筛选优良菌株和优化培养条件，提高次级代谢产物的产量和质量。
2. 次级代谢产物提取和分离纯化。
采用有效的分离纯化方法，获得高纯度的次级代谢产物。
3. 次级代谢产物的结构鉴定和生物活性测试。
利用先进的分析技术，如高分辨质谱、核磁共振等手段，对次级代谢产物进行分析和鉴定，同时评估其生物活性和药物应用价值。
预期结果：
1. 成功筛选出五种海洋微生物菌株，并建立优化的培养条件。
2. 获得高纯度的次级代谢产物，并通过结构鉴定和生物活性测试评估其药用价值及应用前景。
3. 在此基础上，探索其进一步开发利用的方向和途径。
研究意义：
本研究可以为海洋微生物次级代谢产物的开发和利用提供重要信息，有助于寻找新型天然产物、开发新药物和提高产业竞争力。
同时，对于保护海洋生物资源和生态环境也具有积极意义。
我国生防微生物代谢产物研发应用进展与展望
微生物代谢产物农药（microbial metabolite pesticide，简称MMP）是以微生物发酵产生的代谢产物为活性成分，用于防治病虫草鼠等有害生物或促进植物生长发育的生物农药。
MMP 主要包括农用抗生素、微生物源植物免疫诱抗剂和微生物源植物生长调节剂，是我国应用面积最广的生物农药。
部分微生物代谢产物农药兼具预防与治疗效果，是未来绿色农药研发的一个重要方向。
本文总结了我国研发和应用的主要代谢产物农药种类、特点和最新研究进展，例如成都新朝阳研发生产的冠菌素，分析了我国代谢产物农药研发过程中存在的问题和挑战，为新型代谢产物农药的研发与应用提供参考。
中国是一个农业大国，生态环境多样，作物种类繁多，病、虫、草等危害频繁发生。
农药是农业生产中必需的生产资料，我国目前使用的农药以化学农药为主、生物农药为辅，为促进生态文明建设和农业可持续性发展，研发和使用无公害的生物农药得到全社会的高度重视。
生物农药的定义和范畴因不同国家和不同发展时期稍有不同，主要包括植物源农药、动物源农药、生物化学农药和微生物源农药。
微生物源农药主要包括活体微生物农药和微生物代谢产物农药（microbial metabolite pesticide，简称MMP）。
MMP 是以微生物发酵产生的代谢产物为活性成分、用于防治病虫草等有害生物或调节植物生长发育的生物农药，主要包括农用抗生素、植物免疫诱抗剂和植物生长调节剂。
农用抗生素具有特定的杀菌或杀虫活性，化学结构和防治作用机理明确，如井冈霉素和多抗霉素；植物免疫诱抗剂诱导植物产生免疫反应，增强植物抗病虫害能力，如阿泰灵；植物生长调节剂调节植物生长发育或抗逆性，如S-诱抗素。
本文总结了我国研发的主要代谢产物农药种类、特点和最新研发与应用进展，分析了目前研发与应用中面临的问题与挑战，为新型代谢产物农药的研发与应用提供参考。
01微生物代谢产物的特点（1）化学结构复杂，不能或不易通过化学方法合成；（2）生物活性具有选择性，病原菌对这些代谢产物不易产生抗药性；（3）兼具诱导植物产生免疫反应，提高植物抗病性，且有增产效果；（4）在土壤环境中的残留时间短，能够被微生物分解利用；（5）微生物代谢产物生产原料多为淀粉、糖类、玉米浆、黄豆粉等廉价再生性生物资源；采用发酵工艺生产，废液和废水可以回收再利用，对环境污染小，同一套设备略加改造可应用于其它菌种的发酵生产，投入成本相对较低。
微生物次级代谢产物多样性发掘方法
微生物次级代谢产物多样性发掘方法
方岫琴;王文璟;李华东;张晓婷;朱天骄;车茜;李德海;张国建
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2024(49)4
【摘要】微生物次级代谢产物是微生物在生长过程中产生的非必需性代谢产物,其往往具有独特的生物活性。
随着对微生物次级代谢产物多样性研究的不断深入开展,研究者逐渐发现在实验室的常规培养条件下微生物的代谢潜能不能完全被激发,从中可获得的天然产物结构类型远远少于其代谢潜能所决定的数量。
近年来,随着基因组技术、分子生物学技术特别是合成生物学相关技术的发展,研究人员开发了如OSMAC、表观遗传、异源表达等多种方法,从多个角度多层次地发掘次级代谢产物多样性。
这些方法有效激活潜在的生物合成基因簇、提高了微生物次级代谢产物多样性,加之与高通量筛选方法联合应用,能够显著改善了微生物活性天然产物的发现效率。
本文综述了微生物次级代谢潜能的激活以及代谢产物高效筛选的方法和技术,为提高微生物次级代谢产物多样性发掘,加快先导化合物的发现提供参考。
【总页数】12页(P415-426)
【作者】方岫琴;王文璟;李华东;张晓婷;朱天骄;车茜;李德海;张国建
【作者单位】中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室;崂山实验室海洋药物和生物制品功能实验室;青岛海洋生物医药研究院
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1
【相关文献】
1.激活沉默基因簇发掘微生物次级代谢产物的研究进展
2.OSMAC方法在微生物次级代谢产物研究中的应用
3.单菌多次级代谢产物方法及其在微生物代谢产物研究中的应用
4.浅紫灰链霉菌CQ01819及其次级代谢产物的定向发掘
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NRPS A domain
specificities are predicted using both the signature sequence method and the support-vector machinesbased method of NRPSPredictor2
24
analysis of secondary metabolism gene
nonribosomal peptides 非核糖体肽(NRP) bacteriocins 细菌素 aminocoumarins 基香豆素
butyrolactones 丁内酯
terpenes 萜烯 beta-lactams β-内酰胺 siderophores 铁载体
indoles 吲哚类
lantibiotics 羊毛硫抗生素
3
次级代谢产物简介
次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复 杂、对该生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必 需的物质 主要来源：放线菌、真菌等
Zwittermicin A
4
次级代谢产物简介
polyketides (type I) 聚酮(PK) polyketides (type II) polyketides (type III)
gene prediction by Glimmer3 (prokaryotic data) or GlimmerHMM
(eukaryotic data) Transform the predicted results to EMBL format
21
Detection of gene clusters
微生物次级代谢产物及其生物 合成基因簇预测分析
------antiSMASH
次级代谢产物及其生物合成基因簇简介
主 要 内 容
antiSMASH 分析方法及流程
antiSMASH 的优势与比较
次级代谢产物的分类鉴定概貌
2
微生物学发展史中四位重要人物
Louis Pasteur 法国人，开创 了微生物技术 的新时代
8
PKS
McDaniel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) 1846–1851
9
NRPS-PKS
Brian M. Kevany etal., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2009, 1144 –1155
Using HMMer3 tool (/) aligh Pfam-source and other pHMMs library
Compound class NRPS NRPS NRPS Description Condensation domain Adenylation domain Adenylation domain with integrated oxidase Ketosynthase domain Acyltransferase domain FabH fatty acid synthase Enediyine ketosynthase Modular ketosynthase Type II PKS Chain length factor HMM name Condensation AMP-binding A-OX Source PFAM PF00668.13 PFAM PF00501.21 This study
23
Predicted core structure
PKS AT domain
specificities are predicted using a 24 amino acid signature sequence of the active site as well as other pHMMs
V1.2 (August 20th, 2011)
17
Based on profile hidden Markov models of genes that are specific for certain types of gene clusters, antiSMASH is able to accurately identify the gene clusters encoding secondary metabolites of all known broad chemical classes antiSMASH not only detects the gene clusters, but also offers detailed sequence analysis
Alexander Fleming 苏格兰人，发现青霉 素及其治疗传染性疾 病的功效， 1945年获 得诺贝尔生理医学奖
Selman worksman 美国人，对土壤微生 物产生抗生素物质进 行了系统和开创性工 作，发现了抑制肺结 核的链霉菌素，1952年 获得诺贝尔生理医学 奖
Francisco Malpartida 西班 牙人，于 1984 年， 第一个克隆了放线紫 红素的 完整合成基 因 簇
次级合成基因簇的挖掘
传统的天然产物分离通常是通过活性跟踪的策略。
第一篇对NRPS进行 预测的文章
NATURE , 417 ,2002
J. Antibiot. 59(3): 168–176, 2006
J. Antibiot. 59(9): 533–542, 2006
Microbiology 154, 1555–1569,2008
Terpene synthase Phyphytoene_synth
PFAM PF03936.9 This study
Filter negative and positive pHMMs Gene clusters are defined by locating clusters of signature gene pHMM hits spaced within <10 kb mutual dis-tance
生理活性物质
受体拮抗剂
………..
6
次级代谢产物生物合成基因簇
次级代谢产物的编码基因通常在基因组中成簇存在，编码 具有多种功能的复合酶 研究的最清楚为 NRPS ： nonribosomal peptides synthetase PKS： polyketides synthetase
NRPS-PKS hybrid
7
次级代谢产物生物合成基因簇
ＰＫＳ和ＮＲＰＳ复合酶的基因主要是由连续的 模块(Ｍｏｄｕｌｅ)构成,每个基因模块的产物可催化多 聚酮或多肽链的一轮延伸和可能的修饰。 一个基因可能含有多个模块(Ｍｏｄｕｌｅ) 模块(Ｍｏｄｕｌｅ)非最小单位（下级单元：结构域） 一种次级代谢产物的合成由多个基因共同编码
22
NRPS/PKS domain architecture analysis
Domains and subgroups are detected using another pHMMs library Conserved motifs are detected using the pHMMs in the CLUSEAN package
PKS PKS PKS (neg.)
PKS PKS PKS
PKS_KS PKS_AT fabH
ene_KS mod_KS t2clf
SMART SMART This study
Yadav et al. (2009) Yadav et al. (2009) This study
Terpene Terpene ……….
20
Input files
Genbank format or EMBL format : annotated nucleotide file
Fasta format : the fasta should be single sequence FASTA files (with one ">")
15
Gene clusters distributed in fungi genome
Core orthologous and species-specific gene clusters in three fungi
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antiSMASH
(antibiotics & Secondary Metabolite Analysis Shell)
aminoglycosides / aminocyclitols 氨基糖甙类/氨基环醇
ectoines 四氢嘧啶
nucleosides 核苷
phosphoglycolipids 磷酸糖脂
melanins 黑素类
others
5
次级代谢产物简介
抗生素：抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等 酶抑制剂
免疫抑制剂
14
Gene clusters distributed in fungi genome
gene clusters in the 27 sequenced fungal genomes predicted by SMURF
N. Khaldi et al. , Fungal Genetics and Biology 47 ,(2010) 736–741
18
Analysis tools of antiSMASH
NCBI BLAST+ HMMer 3, Muscle 3 Glimmer 3 FastTree
TreeGraph 2 Indigo-depict PySVG JQuery SVG
19
Pipeline for genomic analysis of secondary metabolites