肉毒毒素基本知识

Justinus Kerner 推 测“腊肠毒” 作用 原理，并提出应用 于治疗的可能性
1944 1920s 1895
1946
1820
•E Van Ermengem 分 离肉毒梭状芽胞杆菌
•Schantz 开始研究 其特性和应用
ຫໍສະໝຸດ Baidu
历史和发展（2）
V Brook 证实A 型肉毒毒素阻断 乙酰胆碱释放 Schantz 和 Scott 继续研究
cGRP Glutameat Substance P Syntaxin
VAMP/ synaptobrevin SNAP-25 Ca++ Channels
作用机理的临床意义
肉毒毒素阻滞位点
躯体运动神经元
Α-梭外肌-收缩减少 γ – 梭内肌-传入信号减弱
内脏运动神经元内脏平滑肌收缩减少 腺体分泌减少
痛觉感受器
轻链水解特异 SNARE蛋白
B,D,F,G型 轻链 重链 A,C,E 型 C 型 膜没有 融合 SNARE 复合 体不能形成
肉毒素以胞饮方 式进入
肉毒素 神经递质 不能释放
肌肉细胞 肌肉纤维瘫痪
尚有其它作用机理 – 如疼痛
作用机理录像
作用过程
主要步骤： 结合（Binding） ：
• A型肉毒素的重链与运动神经终板上的乙酰胆碱受体高亲和结合
M 交感神经
Ach
N N
NE
胆碱能性神经：
运动神经 全部植物神经节 前纤维 大多数副交感神 经节后纤维

Ach
胸 腰 神 经
交感神经
Ach
N 交感神经
Ach
M D
N 交感神经 骶 神 经 躯体运动神经
Ach
Ach
Epi N
Ach
支配小汗腺和血 管肌肉的交感神经节 后纤维
N
还阻滞其它物质的释放
对疼痛的作用
1
0
1
10
100
毒素剂量 , U/kg Toxin Dose, U/kg
K. Roger Aoki, PhD, Pharmacology of Botulinum Toxins
不同产品的弥散性不一样
在达到最大局部 效应前就从注射 部位弥散出去了
弥散 弥散
保妥适®
效应
其它肉毒毒素®
剂量
本研究的临床相关性有待明确
BOTOX® 临床应用范围日益扩大
神经肌肉 自主神经 感觉神经
斜视*
美容*
偏头痛 失驰缓症
脑瘫
痉挛性斜颈*
眼睑痉挛* 多汗症*
膀胱
保妥适全球被批准情况
适应症 眼睑痉挛 斜颈 半面肌痉挛 儿童脑瘫 成人痉挛 多汗 皱眉纹和其它面纹 斜视 第7神经功能紊乱 构音障碍 背痛 被批准国家数 适应症 肛裂 肌震挛 原发震颤 头痛 胃失迟缓症 颈痛 膀胱过动 磨牙症 肌筋膜痛 鼻唇线 多发性硬化 被批准国家数
4
Atr thresh 达到最大 局部效果 = ED50
Response 平 均 DAS 峰 值
3
2
弥 散
全 身 效 应
Atr thresh: 注射腓肠肌后引起 同侧四头肌萎缩的最低剂量
•作为局部注射药，肉毒素一般 没有口服药所具有的全身作用 •在临床使用中，很多副反应是 由于药物不适当弥散造成的 •临近肌肉 •全身
3
2
1
正常
0 0 4 8 12 16 20
注射后天数
DAS 量效关系 （对数值）
此图可用来比较不同产品的效力
平 均 DAS 峰 值
毒素剂量, U/kg
保妥适®
效力最高的肉毒素
Toxins 保妥适X® (n=6) 兰州BTX-A (n=6) Dysport® (n=3) Myobloc™ (n=5) ED50 ± SEM (U/kg) 3.4 ± 0.3 5.7 ± 0.3 16.2 ± 1.1 23.4 ± 1.4
FTAT (Frontalis Antibody Test 前额抗体试验)
• 简便,很快有结果 • 与其它方法相关性好
= 7.5 U = 15 U
效果不佳不都是因为抗体
注射技术不正确
• 如剂量过低或注射在错误的肌肉上
对所注射的肌肉功能了解不全 没有注射所有引起症状的肌肉 要达到功能效果还需控制拮抗肌 肌肉挛缩已到固定程度
减少抗体产生的危险
每次使用最低剂量
摄入（Internalization)：
• 毒素通过受体介导的胞饮作用进入细胞内。这一过程中神经末端细胞膜将毒素包裹， 在神经末梢内形成毒素囊泡。摄入后，肉毒素的轻链从囊泡中被释放到胞浆内，现在 已非常明确轻链具有阻断神经递质的功能结构。
阻断 （Blocking)
• A型肉毒素通过裂解胆碱能神经末梢突触前膜内SNAP-25而阻滞乙酰胆碱的释放。 SNAP-25是一种在细胞膜上促使神经末梢内囊泡与突触前膜顺利融合并释放乙酰胆碱 的必需蛋白质。这过程阻止肌肉收缩，但并不影响神经递质的分泌和储存，也不影响 电信号沿神经纤维传导。
79 65 62 61 54 54 52 37 23 8 5
5 5 5 4 4 1 3 3 1 1 1
83个国家，22个适应症
保妥适®在中国的适应症
1998：
• 眼睑痉挛、面肌痉挛及相关 局灶性肌张力障碍。
2009年2月：
• 暂时改善65岁及65岁以下成人 因皱眉肌/或降眉间肌活动引起 的中度至重度皱眉纹。
生物制品的特定
没有仿制品的概念
• 肉毒毒素是一类产品名，而非通用名
• 与疫苗接近
产品本身没有专利，生产工艺专利 用单位（Unit）衡量，单位之间不能换算 很容易得到，很难提纯，很难恒定
FDA 最新通告：
历史和发展（1）
•首次沉淀纯化 A型肉毒毒素 （H.Sommer) •Lammanna 首次分离出A 型肉毒素结晶
• 氯， 加热85C5分钟
人与人不能传播
存在肉毒素抗毒素 （但对已经存在的症状无效）
高纯度的保妥适® 治疗不会导致肉毒中毒
肉毒中毒:
• 肉毒毒素导致的一种全身性的反应 致死剂量 (70kg 人) 静脉注射 3,000 单位
保妥适是高度纯化的肉毒素
• 局部注射治疗,直接注射在相关肌肉 或腺体上 • 如剂量合适,很少弥散到其它肌肉 每瓶保妥适® 只含100单位 纯化的肉毒素
历史和发展（3）
Allergan获得FDA批 准以 BOTOX 商品名 上市；用于治疗眼睑 痉挛，斜视和第VII神 经功能紊乱
83个国家 22个适应症
1998年6月中国药品监 督管理局批准保妥适® 用于治疗眼睑痉挛、面 肌痉挛及相关病灶肌张 力障碍。
2006年6月 GSK在中国 上市保妥适®
2009 2006
肉毒素结构
50 KD
150 KD
COOH
NH2
S-S 100 KD Heavy Chain 重链 S S 与靶位受体 结合，促轻 链内转
LC 轻链
以锌肽链内切 酶实施毒效 NH2 血凝素维持毒素三维结构稳定 前体毒素－900 KD 复合体 HA (Haemagglutinin) ,血凝素 NTNH non-toxic nonhaemagglutinins 非血凝素蛋 白 影响结构因素： 热变性，碱性条件 空气/液体介面形成的气泡改变毒素 形态，氮气/二氧化碳 稀释至过低浓度
1997 1989
1998
2002
Allergan 公司 获得对A型肉 毒素的所用权
FDA 批准低 蛋白剂型 每 100单位 5ng
FDA批准美 容适应症
2月11日获中 国SFDA批准 用于皱眉纹
不是个合适的生化武器
温度、湿度，空气和光照都会使毒素降解
雾状的毒素，很不稳定 常规的消毒方法既能使其灭活
Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088
抗原性
抗原:
• 能触发抗体产生的外来分子，抗原表面有非常 特异性的抗体结合部位，这称为抗原决定簇。
抗体:
• 抗体（也称为免疫球蛋白[Ig]）是针对抗原而产 生的。只有相对应的抗原决定簇出现时，抗体 才被激活。
免疫应答反应具有记忆和强化功能
中和抗体使毒素失去作用
中和 抗体 非中和 抗体
非中和 抗体
中和 抗体
抗原测试方法（I）
WBA （Western Blot Analysis 蛋白印迹分析）
• 不能区分中和抗体和非中和抗体
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免 疫吸附试验)
• 一种厌氧菌，其孢子常规在土壤中，与产生破伤风毒 素的细菌属同一科 • 在合适的条件下（10oC，无氧，合适的酸度）孢子生 长为梭菌 • 细菌继续产生大量的孢子或自溶将毒素释放出来 • 不同的菌株(如Hall株,Bean株)产生不同亚型的神经毒 素(分为 A、B、C、D、E、F、G等7个抗原型), 其中A型 毒力最强 • 是导致肉毒中毒(Botulism)的原因
基本药理
单位的定义
有效性 安全性 抗原性
单位的定义
生物制品用单位(Unit),而不用mg衡量
肉毒素单位定义:
• 1 Unit (单位) = i.p. LD50 • 小鼠腹膜内注射配制后的本品溶液的半数致死量(LD50) • 不同厂家的肉毒素单位（Unit）彼此不能互换
• 有各自的实验和检测方法 说明书：
Scott 获得FDA批准在 人身上进行试验（眼睑 痉挛，半面肌痉挛）
1984 1978
1960’s – 1970’s
MF Brint 用于治疗 眼睑痉挛，半面肌痉 挛 斜颈，喉部肌张力 障碍，书写痉挛等…
1950’s
1950’s – 1960’s
纯化过程优化 (Duff and Schantz)
Scott在猴子身上进 行A型肉毒毒素治疗 斜视的试验
肉毒毒素介绍
主要内容
肉毒毒素介绍
• 历史发展
• 结构
• 作用机理 • 药理 毒理 免疫原性
目前商用的肉毒素及保妥适的特点 保妥适配制注意事项
什么是肉毒毒素?
(肉毒神经毒素,肉毒杆菌神经毒素，肉毒梭菌毒素 ) 是肉毒梭菌( Clostridium botulinum)在生长繁殖 过程中产生的一种细菌外毒素
• 分析血标本中有无保妥适®抗体及其含量的敏感的体外 方法。 • ELISA不能区分保妥适®的中和抗体与非中和抗体
抗原测试方法（II）
MPA (Mouse-Protection Assay 小鼠保护试验)
• 是目前测试抗体的金标准 • 唯一能准确测试中和抗体的方法 • 价格昂贵、费时, 只有阴性和阳性之分
COOH
作用机理(1)
神经肌肉接头
神经末梢 突触囊泡 SNARE 蛋白 形成复合体
正常神经递质释放过程
肌肉细胞
突触囊泡蛋白 SNARE 蛋白 突触相关蛋白
突触融合蛋白
囊泡和终板 膜融合
突触融合 复合体
神经终点
突触间隙 乙酰胆碱
乙酰胆碱受体
神经递质释放
肌肉细胞
肌肉纤维收缩
作用机理(2)
当有神经肉毒素时
*p < 0.05 one-way ANOVA and post hoc Tukey t-test
平均DAS (小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度)峰值效应曲线 *注意： 非线性关系
J. Francis Poster #51, Toxins 2005
局部和全身效应：弥散系数
弥散系数 (Diffusion Margin)
2分 1分 0分 没变化 注射前 注射后
• 半数有效量
• DAS =2 时剂量
用DAS测试小鼠肌肉弱化程度
严重
4 0.5% BSA/Saline .5u/kg (BoTx-A) 1u/kg 5u/kg 10u/kg 30u/kg
Digit Abduction Score
Mean ± SEM (n=10)
• 治疗剂量与中毒剂量相差很远
• 皱眉纹标准剂量： 20U
每瓶保妥适含蛋白5ng 1ng = 10-9 g
要导致死亡,需静脉注射 30瓶以上保妥适®
保妥适® 是局部用药
在治疗剂量内， 血液中检测不到肉毒素
邻近 肌肉
全身 作用
靶肌肉
弥散
BOTOX®
效应 剂量
本研究的临床相关性有待明确
Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088
本品的推荐剂量不可与其他肉毒梭菌毒素制剂的剂量互换。
文献上关于保妥适®的推荐剂量只适用于保妥适®，
对其他A型肉毒毒素不一定适用。
有效性的判断
局部有效性：
• 用DAS 评估
DAS 评分方法
4分 严重弱化
3分
• Digit Abduction Score 小鼠后趾外展评分 方法 • 测试去神经化程度
• 局部肌肉注射的 ED50
神经芽生 (Sprouting)
• 充分证据表明肉毒素介导的神经肌肉接头的化学去神经化作用并没有影响终板区域， 也没有影响轴突的生长，芽神经与终板结合连接释放神经递质
神经再生
• “芽生”是暂时的，会逐渐消退，原始的神经肌肉接头恢复功能。
乙酰胆碱的作用
节前
CNS
神经节
Ach
节后
Ach
副交感神经
颅 神 经