基因表达载体和重组质粒的区别

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基因工程专业大题

1.生物技术概念与特征定义：利用活体生物或它们的产物来生产或修饰一种产品以改良植物和动物、或发展具有特殊用途的微生物的技术。

2.基因工程的概念利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程3.PCR反应体系基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成4.PCR反应参数：高温变性(94)，低温退火（60），适温延伸（72）5.PCR反应体系：（1）模板DNA（2）特异性引物dNTP（3）耐热的DNA聚合酶（Taq酶）（4）缓冲溶液6.PCR反应原则：引物原则：（1）引物扩增跨度（2）引物解链温度（3）避免引物内部或引物之间存在互补序列（4）G+C含量：尽量控制在40%至60%之间（5）引物的3‘末端特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对（6）引物中有或能加上合适的酶切位点7.分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

用途：（1）研究DNA之间的亲缘关系（2）发现基因的缺失或突变；（3）测定某种遗传信息的量（4）鉴定某种基因（5）基因治疗8.常用分子杂交类型：（1）DNA印迹技术Southern blotting（2）RNA印渍技术Northern blotting（3）蛋白质印渍技术Western blotting（4）斑点印迹Dot blotting（5）原位杂交in situ hybridization9.DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)10.Sanger双脱氧链终止法原理：（1）Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂，2ˊ,3ˊ-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3ˊ位又少了个羟基。

高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3

第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。

1。

科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。

2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。

一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。

(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。

（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。

（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。

3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。

（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。

（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。

二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。

(2）使目的基因能够表达和发挥作用。

2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。

基因片段与载体连接、转化和重组子筛选

1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，
由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶
常用的ＤＮＡ连接酶有两种：
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面；２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；３．自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链；４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。

四．结果与分析讨论
１．计算转化率。２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。问题与讨论：１．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？

2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，
原则
上要注意：１．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株；２．根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法

菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。本实验利用抗生筛选转化子。
四．结果与分析
电泳检查连接结果
１．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。３．连接反应中应注意些什么问题及如何提

基因工程-载体

cmlr
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因）多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因中的靠近5`-端。 2、长度约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限制酶切 2)DNA重组
无 DNA插入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插入外源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数量的作用。大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。

基因工程的基本操作程序——彭真课件

①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多
数单子叶植物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③转化过程:
Ti质粒
构建
表达
转入
农杆
导入
目的基因
载体
菌
植物
插入
细
胞
植物细胞表达染色DNA
新性状
（2）子种生种生物的全部基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性
P15思考与探究
2、检测目的基因是否转录出了mRNA ①方法: 分子杂交
②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交
Bt毒素蛋白
抗体
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
真核细胞的
基因结构
外显子：能编码蛋白质的序列编码区
内含子：不能编码蛋白质的序列
非编码区：有调控作用,上游有启动子，下
游有终止子
非编码序列：包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点相同点
原核细胞
真核细胞
编码区是 _连__续__的
编码区是间隔的？
将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因。基因基因组
部分基因（cDNA）基因组DNA与cDNA的比较

重组DNA技术

目录
（二）表达载体
表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因
的载体。
根据宿主细胞分为：
原核表达载体真核表达载体
目录
1. 原核表达载体
原核表达载体的基本组成
R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列
目录
2. 真核表达载体
真核表达载体的基本组成
OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点； TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。
设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
目录
（一）克隆载体
1. 克隆载体应具备的基本特点
至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制；至少有一个选择标志（selection marker）：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，如抗生素抗性基因。有适宜的RE的单一切点：载体中一般都构建有一段特异
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
目录
2.
从基因组DNA文库获取目的基因
组织或细胞染色体DNA
限带的所有基因组DNA的集合
克隆载体重组DNA分子受体菌录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个 RE的单一切点，
可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（ multiple cloning sites，MCS）。

载体

基因工程的载体载体的特征：在寄主细胞中能够自主复制；有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点插入外源基因片段；在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；载体分子较小，以便体外基因操作；对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件；载体的类型⏹质粒⏹噬菌体⏹其他载体(如:酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物Ti质粒、动物病毒)质粒(plasmid): 多数情况下,质粒是存在于细菌染色体外的小的双链闭合环状DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞⏹并不是所有的质粒都是环状分子, 在多种细菌中都发现有线性质粒⏹质粒广泛存在于原核生物中, 其大小从相对分子量小于1X106 到大于200X106质粒的形态1) cccDNA—双链闭合环状DNA2) ocDNA—开环DNA3) cDNA—线形DNA（L型）在DNA促旋酶（gyrase）作用下成负超螺旋构型, 在拓扑异构酶I的作用下解旋。

溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）也有解旋作用溴化乙锭插入DNA超螺旋的作用随着插入的溴化乙锭数目增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直至产生环状分子的开放形式. 进一步的插入在双螺旋中引入了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋方向). 为了清楚起见,只表示了双螺旋的一条单链质粒DNA的复制类型⏹严紧型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。

所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝⏹松弛型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。

如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数穿梭载体（shuttle vector) 可以在两种生物体内复制的载体分子质粒的命名规则⏹小写字母p表示质粒（plasmid)⏹p后面的两个大写字母表示发现或者构建该质粒的作者或者实验室名称⏹数字表示编号⏹例：pBR322、pET21、pGEM-T质粒的宿主范围⏹质粒只编码少数几个其自身复制所需要的蛋白质,甚至在许多情况下只编码其中一个蛋白质⏹所有其他复制所需的蛋白,包括DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶等都是由宿主细胞提供的⏹质粒所编码的复制蛋白质定位在ori 附近，因此只有ori 周围的一小部分区域是复制所必需的⏹因此，把质粒的其他部分删除掉，把外源序列加到质粒上，复制仍然可以继续进行⏹质粒的宿主范围是由它的ori 决定的质粒的不相容性⏹在没有选择压力的情况下，两种质粒不能共存于同一个宿主细胞内⏹如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容显性质粒和隐蔽质粒⏹显性质粒(表达型质粒)----除了携带与本身复制和转移有关的基因外, 还携带一些其他的基因, 宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状, 这样的质粒称为显性质粒⏹隐蔽质粒----无异常性状表现出来克隆载体例：pBR322、pUC18、pUC19、pGEM-T表达载体例：pET-21、pGEX⏹质粒DNA的制备碱裂解法、煮沸法、层析柱过滤法碱裂解法原理：在高pH的碱性条件下，染色体DNA和蛋白质变性，质粒DNA由于其超螺旋共价闭合环状结构，尽管其DNA的大部分氢键也断裂，但是双链DNA仍然不会分离，当恢复到中性时，染色体DNA复性，并聚集形成不可溶的网架。

基因工程原理与技术-3

pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签：多聚组氨酸残基、结合麦芽糖蛋白、谷胱甘肽-s-转移酶。
亲和层析法纯化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的杀伤质粒)。
提取的质粒有三种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线形DNA。
2、质粒的复制类型严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。

2.1_基因工程载体-质粒载体_201209

死
抗菌素
活
b.蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）
乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖
乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。
LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物
-半乳糖苷酶Xgal显色反应： -半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
– 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员
• 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定
（ 5）质粒DNA的构型：
SC型共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型开环DNA（ocDNA） L 型线性DNA（cDNA）
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
• 严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-2份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid)；高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达10-200份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)。
• 松弛型
（4）可转移性
在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。
大肠杆菌接合（conjunction）
如：F质粒（性质粒、或F因子）
质粒迁移
• 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
– 接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等

基因工程(基因工程的基本条件-载体系统)

(二)质粒载体(Plasmid)
1. 质粒的一般生物学特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；
质粒常见于原核细菌和真菌中；绝大多数的质粒是DNA型的；绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分
子结构，即cccDNA；质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。
D-DNA ocDNA cccDNA
但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。
沸水浴法用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体；加溶菌酶裂解细菌细胞壁；沸水浴40秒钟；离心，用无菌牙签挑去沉淀物；乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；
λ噬菌体生物学特性：溶原状态
➢λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态； ➢整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质； ➢人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；
4363 bp
ROI
➢用于基因克隆
ROP Origin of Replication Hind II
Sal I Bal I
pUC18/19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
➢分子量2686bp； GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT

基因工程常用的三种载体

基因工程常用的三种载体载体是基因工程中常用的一种工具，用于将外源基因导入宿主细胞中并进行表达。

常见的载体有质粒、病毒和人工染色体。

本文将分别介绍这三种载体的特点、用途和优缺点。

1. 质粒：质粒是圆形、双链DNA分子，广泛应用于基因工程中。

质粒的构建相对简单，可以通过DNA重组技术来插入外源DNA 片段。

质粒通常包含由宿主细胞识别的来源于细菌或酵母的起源序列，以实现在细胞中的复制和维持。

此外，质粒上还包含选择性标记基因和表达调控元件，以便筛选和调控目标基因的表达。

质粒在基因工程中有着广泛的应用。

首先，质粒载体可以在大肠杆菌等常见细菌中表达外源基因，用于重组蛋白的产生和纯化，或进行功能研究。

此外，质粒也可以构建用于植物和动物细胞的转染，用于基因转导和基因治疗等领域的研究。

质粒的优点在于构建简单，易于操作，并且可以在多种细胞中进行表达。

然而，质粒的转染效率较低，不适合大规模基因转导。

此外，在某些细胞中，质粒的稳定性较差，易丧失外源基因。

2. 病毒：病毒是一类依赖于细胞代谢活动的生物体，可以将外源基因导入宿主细胞并进行复制和表达。

常见的基因工程病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腱实病毒等。

病毒载体的主要特点是高效的基因转导能力和细胞特异性。

由于病毒依赖于细胞进行复制和表达，因此病毒载体能够实现高效转导和表达目标基因。

此外，病毒载体还可以通过选择性修饰病毒表面蛋白来实现对特定细胞的特异性转染，进一步提高基因转导效率。

病毒载体被广泛应用于基因治疗和基因敲除等研究领域。

在基因治疗中，病毒载体能够将替代基因导入患者细胞中，以治疗某些遗传性疾病。

在基因敲除中，病毒载体则可以导入携带某种特殊序列的DNA片段，进而敲除靶基因。

然而，病毒载体也存在一些限制。

首先，病毒复制过程中可能引起细胞毒性反应，对细胞造成伤害。

其次，病毒载体的构建和生产相对复杂，需要严格的无菌操作和关键的质控步骤。

3. 人工染色体：人工染色体是一种合成的染色体模拟体，可用于将大片段基因组DNA导入宿主细胞中。

基因工程-基因表达载体构建(2)

（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用 DNA分子杂交方法，用 DNA与RNA杂交方法检测目的基因是否转录，用免疫（抗原抗体反应）法检测目的基因是否表达。另外也让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态。可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因 DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是脱；
（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞受精卵等。动物常把细胞作为受体细胞。导入植物细胞的方法有等；农杆菌转化农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法染色体DNA 法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的显微注射法上，导入动物细胞的方法有；如果运载体是质 CaCl2 处理，以增大细菌细胞壁粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常，在很短的时间内就能够获快得大量的目的基因。
途径方法
供体细胞中的DNA 中直接分离基因鸟枪法
供体细胞中的DNA ↓限制酶许多DNA片段 ↓载入运载体 ↓导入受体细胞 ↓ 外源DNA扩增, 产生特定性状 ↓分离目的基因
人工合成基因（真核细胞）反转录法
目的基因mRNA ↓反转录单链DNA ↓合成双链DNA(即目的基因)
根据已知氨基酸序列合成DNA
氧核苷酸且遵循碱基互不配对原则
转基因表达成功的原因是生物共用一套遗传密码。基因工程的意义：。目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍。
实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？

三大类病毒表达载体

逆转录病毒载体系统
杰特伟
选用的背景：由于重组腺病毒对于一些细胞类型难以转染，比如
各种类型的原代细胞、体内细胞，同时希望基因永久性表达，即将基因整合入靶细胞的基因组中，此时可以考虑选用逆转录病毒。
逆转录病毒简介：反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是
由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝并高效准确地整和到宿主染色体。
杰特伟杰特伟基因载体系统基因载体系统病毒载体系统病毒载体系统非病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体体腺病毒载反转录病毒载体体反转录病毒载腺伴随病毒载体体腺伴随病毒载单纯疱疹病毒载体体单纯疱疹病毒载慢病毒载体体慢病毒载裸裸dnadnadna阳离子脂质复合物dna阳离子脂质复合物dna蛋白质复合物dna蛋白质复合物细胞内包装细胞内包装细胞外包装细胞外包装dna阳离子多聚物dna阳离子多聚物dnarna嵌合物dnarna嵌合物杰特伟杰特伟公司相应的病毒表达载体质粒sirna表达载体去除去除cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白质粒较小质粒较小最好最好使用使用的的荧rnai质粒之一质粒之一杰特伟杰特伟质粒sirna表达载体cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白荧杰特伟杰特伟诱导性的sirna表达启动子四环素四环素强力霉素强力霉素杰特伟杰特伟teton基因表达系统的小常识gossen等构建了受四环素负调节的teton基因表达系统
常用的病毒载体的特点：
杰特伟
病毒载体
反转录病毒载体单链 RNA 病毒 8~10kb
腺病毒载体双链 DNA 病毒 36kb
A AV 病毒载体单链 DNA 病毒 ~5kb
HSV 病毒载体双链 DNA 病毒 152kb

基因工程知识点

名词解释1.基因工程：是将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。

2.限制性内切核酸酶：能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。

3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。

4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端。

5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。

6.DNA连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。

7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。

8.多克隆位点：是包含多种同一个限制性酶切点的一段很短的DNA序列9. α互补：为质粒DNA编码β—半乳糖苷酶的α亚基，宿主细胞可编码β亚基虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。

10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。

11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子12.探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。

这个标记的核酸分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以是RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD序列：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3‟端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。

基因工程的基本操作程序

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
小结：将目的基因导入受体细胞
生物种类常用方法受体细胞
植物细胞农杆菌转化法；
基因枪法；花粉管通道法。
植物体细胞
动物细胞显微注射技术
动物受精卵
微生物细胞 Ca2+处理法原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→ 导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达
三、将目的基因导入受体细胞
1
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳
定和表达的过程。
2 常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
3 目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1、目的基因导入植物细胞的方法（1）农杆菌转化法
①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
基因中内含子(位于编码蛋白质
某种生物的部分基因于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交
Bt毒素蛋白
抗体
苏云金杆菌
组织培养化脱分
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
提蛋白质
取
出现杂交带
2、鉴定——个体水平的鉴定
抗虫、抗病接种实验，活性比较实验
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗、人工合成

第三章基因工程载体

表达载体与克隆载体的区别

Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因有效的转录在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白质翻译在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子即为非重组子
pUC系列的质粒载体

pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制性核酸内切酶的单一酶切位点大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基因位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它并不破坏该基因的功能

4、
去除两个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切体外重组酶切
pBR313
EcoRII片断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型

1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体

3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体

克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛选重组子的示意图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr

生物学案：基因工程的基本操作程序

1．2 基因工程的基本操作程序1．简述基因工程的原理及基本操作程序。

2．尝试设计某一转基因生物的研制过程。

一、目的基因的获取1．从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同______的DNA片段导入________的群体中储存，各个________分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。

基因文库包括两种：________文库，即包含一种生物所有基因的文库；________文库，即只包含一种生物的一部分基因的文库，如______文库。

2．利用PCR（1）PCR的含义:是一项在生物______复制特定DNA片段的核酸合成技术。

（2）目的：短时间内大量扩增目的基因。

(3）原理：__________。

（4）过程：第一步,加热至90～95 ℃，________________。

第二步，冷却至55～60 ℃，________________________________________________。

第三步，加热至70～75 ℃，________________________________________________。

如此重复循环多次.（5）特点：指数形式扩增。

3．用化学方法人工合成如果基因比较____，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

二、基因表达载体的构建基因表达载体的组成：必须有启动子、________、终止子以及________等。

1．启动子启动子是一段有特殊结构的______片段,位于基因的首端，是____________________的部位,可驱动基因______。

2．终止子终止子也是一段______短片段，位于基因尾端,使______在需要的地方停止。

3．标记基因标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有________，从而将含有________的细胞筛选出来。

三、将目的基因导入受体细胞1．转化________进入受体细胞内,并且在受体细胞内________和______的过程,称为转化。