基因工程

重组子(recon):两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。

重组子(recombinant), 含有重组DNA分子的转化细胞。

穿梭载体(shuttle vector)是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体.这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.

Spi筛选:野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coil的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感。（这种生长抑制作用是受λ噬菌体red和gam这两个基因编码的产物控制的。如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶原性E.coil中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作Spi-。因此，通过λ噬菌体载体DNA上的red和/或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶原性细菌鉴别重组和非重组λ噬菌体。

1、外源基因导入植物细胞方法及原理？

以载体为媒介的基因转移和基因或DNA的直接转移。所谓以载体为媒介的基因转移就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将外源基因转入植物细胞的技术。DNA的直接转移是指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术。

叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。

农杆菌介导的遗传转化是大多数双子叶植物转化中常采用的方法，但由于农杆菌具有宿主局限性，极少能感染单子叶植物，特别是一些重要的农作物如水稻、小麦、玉米等对农杆菌不敏感，难于应用此法进行遗传转化。

基因枪法基因枪法又称粒子轰击技术（particle bombardment）。这一方法是用粒子枪把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速地射进植物细胞或组织。由于此法快速简便，不受宿主范围限制，而受体植物细胞不需去除细胞壁，转化率又高，被转化的细胞或组织容易再生成植株，因而颇受关注。

微注射法微注射法（microinjection）是利用显微注射仪等，通过机械的方法将外源基因或DNA直接注入细胞核或细胞质。与其他方法相比，这个方法对外源遗传物质的导入更为直接和有效。

电激和电注射法电脉冲能改变细胞膜的透性。通过高压电脉冲的电激穿孔作用把外源DNA 引入植物原生质体的方法就称为电激法（electroporation）。这种方法现已较广泛地应用于单子叶和双子叶植物以及动物的基因转移，如20世纪80年代末用此法将新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因转入玉米自交系的原生质体，已再生成植株。

2、真核基因在大肠杆菌表达的困难及解决办法？

真核生物基因不能在大肠杆菌中表达出具有生物活性的功能蛋白，其原因是：第一，大肠杆菌细胞内不具备真核生物的蛋白质复性系统，许多真核生物基因仅在大肠杆菌中合成出无特异性空间结构的多肽链；第二，与其它原核细菌一样，大肠杆菌缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性恰恰依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用；第三，大肠杆菌内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定；第

四，大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。上述缺陷在一定程度上制约了重组大肠杆菌作为微型生物反应器在异源真核生物蛋白尤其是药物蛋白大规模生产中的应用。

强化异源蛋白的生物合成主要归结为外源基因剂量（拷贝数）、基因转录水平和mRNA翻译速率的时序性控制，而这种控制又是在重组子构建过程中通过相应表达调控元件的精确组装来实现的，现分述如下：A 启动子考虑调整启动子基因之间的距离;利用可控制的强启动子调整外源基因的表达时序，即通过启动子活性的定时诱导，将外源基因的转录启动限制在受体细胞生长循环的某一特定阶段;B终止子对于一些终止作用较弱的终止子，往往采用二聚体终止子的特殊结构。当含有终止子序列的DNA片段插入到该位点上时，由启动子介导的报告基因转录被封闭，从而减少或阻断了报告基因的表达;C:SD序列尽量避免基因编码区内前几个密码子碱基序列与大肠杆菌核糖体结合位点之间可能存在的互补作用,在一般情况下，这一序列能够高效表达多数真核生物基因，但应当指出的是，如果在排除了转录效率低下和表达产物不稳定等因素之后，某些克隆在上述质粒上的外源基因的表达效果并不理想，可以考虑修改或更换核糖体结合位点序列，其中最为重要的是SD序列及其与起始密码子之间的间隔长度.D 密码子：外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：首先，采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法；其次，对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。E:质粒拷贝数:装备强启动子以提高转录效率以及将外源基因克隆在高拷贝载体上以增加基因的剂量.

3Ti质粒介导植物转基因的原理？

目前以T-DNA转化植物细胞的标准方法大多采用Ti质粒介导的二元整合转化程序。首先构建含T-DNA区的农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，分别将外源基因、NPTII基因和多克隆位点取代T-DNA上的tms、tmr和tmt基因组；重组分子转化大肠杆菌，待鉴定扩增后再导入携带一个Ti辅助质粒的农杆根瘤菌中，该辅助质粒含有vir区但缺失了T-DNA区；将上述的农杆根瘤菌转化子悬浮液涂布在植物根部伤愈组织上，辅助质粒中的vir基因表达产物便会促使重组T-DNA片段进入受体细胞内。

4 对转基因植物安全性评价的必要性

从理论上说，转基因技术和常规杂交育种都是通过优良基因重组获得新品种的，但常规育种的安全性并未受到人们的质疑。其主要理由是常规育种是模拟自然现象进行的，基因重组和交流的范围很有限，仅限于种内或近缘种间。并且，在长期的育种实践中并未发现什么灾难性的结果。而转基因技术则不同，它可以把任何生物甚至人工合成的基因转入植物。因为这种事件在自然界是不可能发生的，所以人们无法预测将基因转入一个新的遗传背景中会产生什么样的作用，故而对其后果存在着疑虑。而消除这一疑虑的有效途径就是进行转基因植物的安全性评价。也就是说要经过合理的试验设计和严密科学的试验程序，积累足够的数据。人们根据这些数据可以判断转基因植物的田间释放或大规模商品化生产是否安全。对试验证明安全的转基因植物可以正式用于农业生产，而对存在安全隐患的则要加以限制，避免危及人类生存以及破坏生态环境。只有这样，我们才能扬长避短，充分发挥转基因技术在农业生产上的巨大应用潜力。

3 转基因植物安全性评价的主要内容

目前，国际市场上的转基因食品按照要求必须进行了严格审查，证明它们对人类健康无副作用。检验不仅在生产国进行,而且联合国粮农组织和世界卫生组织联合委员会负责监管。对转