胶原在生物医学领域的应用

胶原在生物医学领域的应用

胶原在生物医学领域的应用

刘白灵(四川大学高分子研究所)

[摘要]

胶原是动物体中最丰富的蛋白资源,由于胶原具有很低的免疫原性,与多种宿主细胞及组织有着良好的相互作用,因而可广泛地用于制备胶原基医用材料及医用装置。

本文介绍了胶原作为医用材料的生物学优势、胶原基生物材料在医疗领域的使用,以及胶原基生物材料的制备和注意事项。本文还对胶原基医用材料和传统用同类材料的生物医学性质进行了对比,简述了采用生物技术改善胶原基医用材料的途径和前景。

[正文]

胶原是动物所有结缔组织—皮、腱、韧带、软骨等的主要蛋白成分,是最为丰富的蛋白质之一,占哺乳动物所有蛋白质的30%。自古以来,胶原一直主要作为制革工业的基本原料。随着时代和科学技术的发展,人们在探讨胶原的化学、物理、生物学性质的过程中,逐渐认识和开辟着胶原广泛应用的新领域。随着21 世纪我国产业结构的调整,制革工业的发展方向是生产的规模化、集约化和产品和高性能化,充分利用我国动物皮生物资源,开发具有高附加值的胶原新产品势在必行。

由于胶原的特殊性质和其性质上的优势,胶原在生物医学领域有着十分广阔的应用前景。

胶原的这种优势来源于它独特的结构、生化及生物学性质。

1. 胶原作为生物材料的优势

1.1低免疫原性

胶原作为医用移植材料最重要的特点在于其免疫惰性。与其它具有免疫性(immunogenicity) 的蛋白质相比,胶原的免疫原性非常低。特别是在胶原以胶原组织(tissue -based) 和纯化胶原形式使用时,这一优势更为明显。80年代对各种胶原产品的免疫原性进行测定时发现,所产生的免疫应答是由存在于胶原产品中的极少量的非胶原蛋白引起的。产生免疫性的另一原因是材料中存在着变性胶原,胶原的单根肽链比天然的未遭破坏的胶原螺旋分子表现出较高的免疫原性。这可能是因为胶原受到破坏而变性时,将原来隐匿在内部的抗原决定簇暴露出来,从而引起了免疫应答。

90 年代以前,人们一直认为胶原没有免疫原性。但后来的研究发现,胶原可表现出一定的免疫原性。例如,在制备哺乳动物胶原的单克隆抗体时,发现Ⅰ型胶原的免疫原性比Ⅲ型、Ⅴ型、Ⅵ型胶原低得多。将组织胶原的端肽(telopeptides) ,螺旋微区(domain) ,以及其它微区的免疫原性进行对比,发现端肽的免疫原性最强。因而,在制备可溶性胶原医用产品时,应除去胶原的端肽。但对以组织基使用的胶原材料,则应保留端肽,目的是保存交联位点,赋予组织材料所需要的完整结构。研究还发现用戊二醛交联,可部分降低胶原材料的免疫原性。

1.2细胞基质间的相互作用

胶原基材料另一优势,在于它与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。

胶原基材料无论是在被吸收前作为形成新组织的骨架,还是被吸收同化进入宿主,成为宿主组织的一部分,都与细胞周围的基质有着良好的相互作用,表现出相互影响的协调性,并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分。

胶原可促进不同类型细胞生长,如Ⅰ型胶原可用于培养各种不同类型的细胞。细胞与胶原之间的相互作用机理取决于细胞的类型,相互作用可能直接通过特异性的受体,但更常见的是由特殊的粘结蛋白,如纤维结合素等中介的相互作用。

胶原基材料的另一特点,是除了可增加细胞的粘结外,还能改善细胞的生长、分化与移动。胶原在与其它胞外基质分子的缀合中,具有可支撑多种不同类型细胞的生长与功能的特点。这一能力促进了胶原基生物材料在多个领域的应用。

1.3与血小板的相互作用

胶原对血小板有凝聚作用,可形成血栓阻止流血,因而可用于制备凝血材料。血管壁的内皮层发生损伤流血时,靠近受伤部位的血小板便与内皮下的结缔组织直接接触,进而使血小板活化、释放出颗粒成分,进行凝血。正因为如此,在使用胶原或胶原复合物制备心血管装置时,要特别注意防止或抑制、隐匿胶原与血小板之间的相互作用。

目前采用的方法之一是用戊二醛对胶原医用装置材料进行交联,这种方法可减少胶原与血小板间的相互作用。

现更多采用的方法是用聚合物交联以覆盖胶原表面,或用如肝素的化合物涂敷胶原表面,阻止其与血小板的作用。

1.4纤维的再形成性

经纯化的可溶性胶原在胶原基生物材料中占有重要地位,其主要性质之一是可在体外再次形成与天然胶原纤维相似的有序纤维状结构。在制备可溶性胶原时,虽然已通过酶的作用除去了胶原分子的端肽,但可溶性胶原在体外的再形成过程仍然存在。

使用可溶性胶原的另一优势在于其免疫原性被大大减弱,又能形成纤维,获得了与原有结构相似的堆砌,从而有利于细胞基质间相互作用的分子过程。利用可溶性胶原的纤维再生性质,还可将其制备成适合于移植用的膏状注射物或海绵等结构。

1.5机械性能

以组织基胶原使用的胶原装置,固有强度是其重要的优势。生物体中,胶原是为结缔组织提供强度的主要蛋白成分,因而可能在广泛的范围内满足肌体对机械强度的要求。胶原纤维具有很高的机械强度的重要原因,在于胶原中的天然交联,在制备组织胶原装置时应尽量加以保留。制备过程中,还应尽可能地保留组织基胶原中的蛋白多糖,以维持胶原固有的卷曲。胶原的这种结构特点有利于组织在受到外力作用时能量的耗散,使胶原避免破裂。

2. 不同形式的胶原基生物材料

以胶原为主要或唯一组分制备医用材料,已有大量的报导与专利。

表1 虽仅是部分摘录,但也已表明胶原基产品在多个医疗领域应用的可能性。其中一部分已进入人体实验、部分限于动物实验,有些已步入商品阶段。胶原在以上某些领域使用时,因需求量或因其它替换材料的价格低,成为商品的可能性较小。但胶原的多功能性,特别是胶原可与其它重复物因子一起成为复合体的特点,便获得了合成高分子不可替代的应用机会。

P -以纯化过的可溶性胶原或粉碎形式提供(purified collagen -based)

3. 胶原基生物材料的制备

3.1 不溶性胶原

主要指以胶原组织基形式和由碾碎的胶原制备的生物医用胶原材料。这种胶原材料的制备比较简单,但要把胶原的免疫原性降低到最低限度,还需要一些其它的处理。例如,可用无花果蛋白酶对胶原进行温和处理,除去非胶原性蛋白质。处理时要防止胶原的降解,并注意不能因除去蛋白多糖而增加了胶原装置的刚性,损害胶原固有的综合机械性能。在用胶原组织直接制备生物装置时,须尽可能缩短从屠宰到制备期的时间间隔,以减少胶原的自溶性与降解程度。

3.2 可溶性胶原

用酶处理已绞碎的皮肤组织,通常使用的是酸性蛋白酶胃蛋白酶。胃蛋白酶可切去胶原肽链端肽的交联区,而且在胃蛋白酶作用所需的酸性pH 条件下,胶原组织将发生膨胀、进而溶解。再提高反应体系pH 至中性,使胃蛋白酶失活,或在对胶原进行纯化的过程中除去胃蛋白酶。实验室中最常见的纯化方法是:在酸性或碱性pH 条件下,用NaCl 对胶原进行分级沉淀。酸或碱处理也可用来制备可溶性胶原,缺点是这种方法易引起胶原螺旋区结构的断裂,而且不能有效地除去端肽;而酶处理却可通过降低非胶原污染物或从胶原分子上除去端肽,从而降低胶原的免疫原性。

3.3 增强胶原基材料的强度

天然的胶原组织都有很高的强度,但是当胶原基装置由可溶性胶原制备时,强度则很低。

因而通常采用交联,在胶原分子间引入新的化学键,以使产品获得适当的强度而用于特定的情况。交联的另一目的,是减少天然的、未经处理的胶原基体的免疫原性。此外,还可用交联来控制胶原基生物材料的使用寿命,交联在制备实用性的胶原基生物材料中具有十分重要的作用。

对胶原进行交联可采用物理交联与化学交联两种途径。在对胶原进行交联处理时,不仅要考虑所用方法的交联强度,更重要的是要考虑所用方法产生的稳定性、毒性、趋钙化以及抗酶降解性能等。

可使用的化学交联剂有:甲醛、双醛淀粉、戊二醛、其它双醛、二异氰酸酯(特别是六亚甲基二异氰酸酯) 、水溶性碳化二亚胺、脂肪族环氧化物、氰尿酰氯、酰基叠氮,以及由染料中介的光氧化反应等。

与化学法相比,物理法的通用性较差, 仅限于对纯化胶原重组产品的交联处理。物理交联法的优点是没有引入任何有毒物质。已有研究表明,采用高能辐射、紫外辐射、干热处理等都可十分有效地实现某些反应,而且不会在蛋白分子中引入新的基团,只是作用机理还待研究。

4. 胶原基生物材料的应用

4.1 心脏瓣膜

用机械瓣膜置换第一大动脉和左房室瓣膜的首例手术始于60 年代初,不久便引入了大主动脉的同种移植瓣膜。之后,由于研制出了组织状胶原基装置商品,为特定的患者提供了能有效代替机械装置的多种异种移植,猪的大主动脉瓣膜是使用最广泛的天然组织心脏瓣膜的替代物。

心包装置主要由牛心包组织构成,切割牛的心包组织并将其排列成心瓣状,主要为三小叶状,并与天然的瓣膜结构相近。与大主动脉瓣膜相比,主动脉瓣前尖的厚度较大,而且联结的轮廓清晰。这些装置的胶原结构轮廓分明,在加工过程中也出现了与猪瓣膜相似的变化,所有组织基瓣膜都经过戊二醛的交联化处理。为了避免产品过度硬化,戊二醛的使用浓度应比较低。

这两种胶原基医用装置的主要优点是:强度高、耐久性长。虽然它们也会随着时间的推移而出现变质现象,但变化速度缓慢,不会象机械装置发生突然损坏。

生物瓣膜的另一突出优点是引发血栓栓塞并发病的频率比较低,患者不必进行长期的抗凝治疗。在目前对心血管疾病的治疗中,常同时使用生物型与机械型的装置,到底选择那一种装置取决于患者的特定情况。比如为了避免抗凝治疗,妊娠中的妇女倾向于使用生物型装置,因为用于抗凝治疗的药物常可通过胎盘进入婴儿。

生物型装置的缺点之一是植入人体后的钙化问题,据统计,使用生物型装置,易发生的事故中,86%是因钙化所致,而且大部分起因于钙化和瓣尖撕裂的双重作用。钙化一般随着移植后时间的延长而增加。在大多数患者中,钙化在移植3年后便明显起来;但在某些患者身上,移植后历经10 年还没有任何症状。

一般而言,组织基胶原瓣膜在头10 年使用期内性能良好。现在,材料学家正竭力合成新的医用瓣膜材料,目的是大幅度延长材料的使用寿命, 减少二次手术,减轻患者痛苦。

4.2 血管修复

由于心血管疾病日益增加,对替换血管装置的要求越来越多。因手术需求不同,则需要不同直径的装置,如直径小于1.5mm 的微动脉置换器,这种置换操作需在显微镜下进行;可在一般手术条件下进行的直径为

1.5～4mm 的小型心血管置换器;以及大直径置换器等。目前,在胸、腹及一些外周手术中,则使用了一些由合成材料聚酯制备的性能良好的大直径装置。对生物材料在这一领域使用的要求主要是制备小直径置换器,例如,对于冠状旁路手术来说,极有价值的途径是采用自身隐动脉或乳动脉。但约有30 % 的患者,因不能采用自身材料,就需要其它生物材料。

生物组织基心血管装置的主要优势是直径小于5mm 的心血管置换器,与合成材料相比,生物材料的多样性为改善置换器的性能提供了有利条件。合成的生物组织基这两类心血管导管都已被用于血管的替换。如经过改性和稳定化处理的生物导管,象脐静脉导管、胶原导管等。但天然组织基装置多数缺乏耐久性,如用牛动脉血管进行修复,就因其耐久性差,以及动脉瘤扩张问题而导致失败。

与用合成的生物医用材料制备的装置相比,胶原基装置还具有感染性低、宿主组织能向装置中渗入生长而不需要高密度孔结构,以及可与天然血管在物理性质上较好的匹配等优点。

4.3 可溶性胶原

胶原经纯化后可制成注射胶原。

这类胶原产品的优势在于它的非免疫性、可再次形成与天然胶原纤维相似的纤维结构, 并与宿主细胞和其它结缔组织成分保持正常的相互作用。可溶性胶原在适当的缓冲液中,加热至体温时,便可在组织中原位形成纤维,或在进入组织之前形成纤维。在后一种情况下,胶原溶液还应保持适当的流变性能,以使其能以液体形式注入组织的指定部位,再形成不溶性的纤维。

这种方法对软组织的扩增、恢复,特别是对矫正各种皮肤断面缺陷非常有用,还可用于食管括约肌声带的修复、牙周方面的治疗。

4.4 创伤、烧伤修复材料

胶原敷料有多种形式,如膜片、海绵状及粒状等,应能重新溶解,能吸收创伤渗出液,可与宿主细胞外基质相互作用,以促进细胞在新结缔组织上的粘附、移动、生长和沉积;能诱导分化、诱导成纤维细胞的趋化性,延迟伤口收缩,加速创伤修复。

本世纪初在烧伤的治疗中使用了天然猪皮和羊膜,但如今更着重于重组形式的胶原,即胶原经纯化处理变为可溶性胶原后再制备成多种敷料。对胶原基创伤、烧伤修复敷料的设计,开始是以创伤闭和,减少感染,降低体液损失为主。这类敷料的特点是具有可诱发正常真皮形成的能力。之后,则对材料进行改性,以降低其免疫原性;或用粘多糖(氨基葡聚糖) 替代部分胶原、改变其降解速率;控制敷料的厚度和孔径,促进组织向内优化生长。对由Ⅰ型、Ⅲ型胶原和粘多糖组成的,未经戊二醛交联的创伤敷料,还采用脱乙酰壳多糖改善其机械性能,提高治疗效果。

也可用Ⅰ、Ⅲ型胶原、弹性胶原或溶解性的弹性胶原肽链组成混合物,形成复杂的结缔组织基质,再补充抗生素、透明质酸、纤维结合素和肝素增加剂,这些补充材料可促进创伤的愈合。最近的研究中,还向基质中添加成纤维细胞生长因子、血小板衍生物生长因子和表皮生长因子等,这些生长因子都可有效地促进创伤愈合。

4. 5 胶原止血剂

胶原与血小板作用后,引起后继的与血液聚集相关联的一系列过程的进行,从而可迅速凝血。作为止血剂使用的胶原可以是粉状、片状及海绵状等多种物理形态。与胶原类止血材料相竞争的有纤维素、明胶和纤维衍生物,其优势是价格较低。但研究表明,胶原的止血效果明显。用无花果蛋白酶除去牛腱不溶性胶原中的非胶原性蛋白质,再将其在酸性介质中分散并形成膨胀的纤维体,然后经冷冻干燥成为海绵状,再用0. 15 % 的甲醛处理,便使其具有使用稳定性和回弹性的特点。有人还采用牛皮真皮制备了“ 微晶”型胶原,实验结果表明,这种产品比重组胶原在诱导絮凝的产生上更有效,因而止血作用更强。

胶原止血剂在治疗细胞组织器官如肝或脾的创伤上效果更明显。由于这些组织一般缺乏结缔组织的支持,在出血、渗出、细胞表面的修复过程中,十分需要纤维蛋白构架维持稳定。在这种情况下,使用胶原基止血剂可减少这些组织中血液的流失。

4. 6 明胶

明胶是胶原经温和而不可逆的断裂后的主要产生,明胶与胶原具有相似的氨基酸组成。据《中药大辞典》记载,明胶具有“滋阴润燥、止血消肿”之功,可治“ 虚劳肺痿,咳嗽咯血、吐衄、崩漏、跌扑损伤、痈肿、烫伤”;《本草汇言》载“ 黄明胶,止诸般失血之药也。??与阿胶通用,其性平补,宜于虚热者也。如散痈肿,调脓止痛,护膜生肌等。??”

最近的研究表明:明胶,特别是水解明胶,对多种皮肤病均有治疗作用,其用于手足皲裂、皮肤搔痒病、鱼鳞病等皮肤病,效果非常显著。当水解明胶结合药物配伍使用时,能够更要效地治疗某些并发性皮肤病。水解明胶在治疗中未发现任何刺激性与副作用,它能滋润皮肤、修补和促进伤口愈合。此外,水解明胶在内科病学中也有用武之地,对慢性胃炎、消化胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡有更佳的治疗效果。

5. 展望

迄今为止,胶原基医用材料的绝大多数均取材于动物,主要是牛。由于安全性问题和免疫原性及感染性疾病的传播(如牛海绵状脑类),人们对使用外源胶原怀有疑虑。共识是来自人体的胶原的生物相容性、生物功能性均优于动物胶原。人体胶原最可靠的来源是子宫,但在制备和使用人体胶原组织时,还需要对病毒和其它传递性的感染剂进行严格测试。

随着生物工程技术的发展,人类可采用重组DNA 技术,进行人体胶原的表达与纯化。即在建立能获得大量的、价格低廉的重组胶原产品的可行方法后,大大促进胶原生物材料的充分开发与利用。虽然许多外源基因已在多种重组的宿主载体系统,如细菌、酵母菌、杆状病毒、哺乳类及其它体系中得以表达,但形成功能必胶原分子的表达则十分困难。这是因为从胶原的mRNA 翻译成胶原分子后,还需经过复杂修饰加工过程。该过程需多种酶的参与( 详见“胶原的生物合成过程及其调节”),而表达胶原基因的宿主体系常常不产生这

些酶,使分泌后胶原分子的后修饰加工过程困难化。

建立一个能使胶原蛋白高水平表达的载体系统非常重要,这个载体须带有合适的启动子、信号肽、能传染或转化多种上宿主感受态细胞、并包括脯氨酰-4 -羟化酶基团,此酰能将脯氨酰残基在胶原重复结构G-X-Y 的Y 位羟基化成4 -羟脯氨基酸,对胶原的稳定十分重要。

制备人体胶原分子的另一方法是采用转基因动物,如让转基因牛的乳汁中含有人的重组胶原。其方法是将牛奶蛋白的专用启动子与胶原、以及与胶原后修饰相关的酶基因进行体外重组,再用微量注射法将重组注入受精的卵母细胞或胚胎干细胞中,最后将这些细胞移植入替代母亲中。

用以上两种方法一旦获得了首代产品,基因重组法在生产一系列的第二代产品时就有了灵活性和很大的

潜力。人们可应用在胶原的结构、功能、调节上已有的丰富知识,特别是其与生物体系相互作用的相关知识,创造出特定的分子和生物材料, 它们具有增强了的,或降低了稳定性、免疫性、止血能力及特异性结合能力。由此还产生其它的两个可能性,一是设计和表达一个完全与天然蛋白质类似的产物;二是创造出一个全新的、增强了生物功能的生物材料。

对胶原基产品的进一步设计与制备也可与细胞素或生长因子相结合。细胞素和生长因子在创伤的愈合中十分重要,因为组织的修复过程涉及到细胞、基质及生长因子间不断的相互作用。结合生长因子、转化生长因子β( TGF -β) 、血小板衍生因子(PD GF) 、成纤维细胞生长因子(F GF) 以及表皮生长因子( EGF) 等,它们都具有加速伤口愈合的作用。采用生物工程,把这些生长因子的基因拼合成重组体,可使基因工程化的生物材料具有所期望的生物活性。

由上可知,为了使未来的胶原基生物材料具有最好的生物相容性,要考虑很多因素。将重组DNA 技术及我们对于胶原和重组修复的知识结合起来,将会加强具有特定设计性质的胶原基生物材料的生物活性,使其

与组织的环境相适应,产生更好的相互作用,促进其应用。

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