杂交瘤技术

其优点是融合成本低，勿需特殊设备；简便、融合效
率较高。因此在1975年获得成功后很快取代仙台病毒 法。
pH6,浓度50%，分子量小于1000的融合效果最好
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（3）电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，将细胞置于电
场中，使它们彼此靠近紧密接触并排列呈串，然后在高 强度、短时程的直流电脉冲的作用下，相互连接的细胞 膜被击穿而导致细胞融合。
脾细胞
不能长期存活
骨髓瘤细胞
筛选出
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HAT培养基筛选
B淋巴细胞： HGPRT+，TK+
存活但短命
骨髓瘤细胞： HGPRTˉ或TKˉ
杂交瘤细胞： HGPRT+，TK+
死亡
长期存活，
且产抗体，
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三、单克隆抗体 的制备过程
动物免疫 细胞融合及HAT筛选
抗体的检测
杂交瘤细胞的克隆化
拌。
（3）继续搅动1分钟，目的使所有的细胞尽可能地与PEG 接触。
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（4）慢慢加入预热的无血清1640 1ml ，1min，目的是稀释 PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml ，2-3min内加完，
并持续轻轻搅动，此时细胞对机械损伤非常敏感。
（5）离心1000rpm，室温10 min，去上清。 （6）取预热的15%牛血清1640，先加10ml，对准细胞团加液， 使细胞颗粒均匀分布于悬液中；再加90ml。制成约 2×106/ml细胞悬液。
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Cienkawski(1876）、Buck(1877）、Geddes(1880） 在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物 细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学 融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨 髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。
髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数
分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加
入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞 称为饲养细胞（Feeder cells）。

机制尚不明了，一般认为：

可能释放非种属特异性的生长刺激因子； 也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
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常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹
胞，它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力，
又具有参与融合的体细胞的一些特征。
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杂交瘤技术（也称单克隆抗体制备技术）
是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B 淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋 巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂
交瘤细胞系的技术。
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单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb)
培养筛选 骨髓瘤细胞系
融合
饲 养 细 胞
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1、免疫小鼠和脾细胞的制备

免疫动物：6~8周龄BALB／c小鼠 免疫抗原：纯度越高越好，各种病毒、细菌、细胞或可溶性抗原。 一般可溶性抗原用完全佐剂效果较好。甚至PAGE胶条带直接研 磨亦可。

免疫途径：皮下、腹腔或静脉注射 免疫程序：基础免疫2~3次，静脉再加强免疫1次。 加强免疫后3~5天解剖，取脾细胞配制成适量浓度细胞悬液用于 融合。
腔巨噬细胞。其中小鼠腹腔巨噬细胞使用最为 普遍，因其来源及制备较为方便，且有吞噬清 除死亡细胞及其碎片的作用。
饲养细胞的制备：
细胞融合前一天，从同系正常小鼠腹腔取巨噬细 胞，加入培养板，96孔板每孔细胞数为2×104；24孔板， 每孔为1×105个，置37℃培养。
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4、 50%PEG配制
称20~50g PEG1500~4000粉剂，放于玻璃瓶中，
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7、抗体的筛查
细胞融合后两周即可筛查抗体。选择检测方法以快速、
简便、特异、敏感和便于一次处理大量样品为原则。
常用的方法有：
ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等
McAb的检测。
RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
FACS(流式细胞术)用于检查细胞表面抗原的McAb检
永远分裂和存活——长命细胞。
没有抗体分泌。
经筛选HGPRTˉ或TKˉ。
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2. 细胞融合技术
分泌抗体 短命 长命 不分泌抗体 骨髓瘤细胞
脾细胞 (B淋巴细胞)
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
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3. 杂交瘤细胞的筛选
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾细胞脾细胞
不能长期存活
骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
其优点是：

融合率高、重复性强、对细胞伤害小；
可在显微镜下观察融合过程； 诱导过程可控性强。
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电融合示意图
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（二）杂种细胞的筛选
人工诱导细胞融合是一个随 机的过程，可能产生多种类型的 细胞，筛选的目的是获得优良的 杂种细胞。 应根据其细胞特性来选择适 当的筛选方法（如酶缺陷、药物
TK HGPRT IMP
A
TMP
核苷酸
DNA
DNA的生物合成途径与HAT选择培养基
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凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能
利用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；
HGPRTˉ或TKˉ细胞在HAT培养基上不能存活；
HGPRTˉ与TKˉ细胞融合或与正常细胞融合后的
杂交细胞，可在HAT培养基上存活。
指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识 别一种抗原决定簇的均质抗体。
克隆
指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖 形成的细胞集落。
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二、基本原理
（一）细胞融合
细胞融合（cell
fusion）是指两个
或更多个相同或不同细胞通过膜融
合形成单个细胞的过程。
可在自发或人工诱导下发生。
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两个不同基因型的细胞可形成一个杂种细胞。
（7）加入已含有饲养细胞的96孔板或24孔板（每孔加入细胞
数分别为2×105 和1×106 ）。
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6、HAT 和HT选择培养
（1）接种24h后加入HAT选择培养液。 （2）融合后7~10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加
一半新的)，以后每2~3天半量换液一次。
（3）两周后换HT培养液（目的是洗出残留于细胞内的氨 基喋呤），以后每3~4天换液一次。 （4）再维持培养两周改用一般培养液。
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Georges J.F. Köhler
科勒
Cesar Milstein
米尔斯坦
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主要内容
基本概念 单克隆抗体制备技术的基本原理

细胞融合技术
杂种细胞的筛选（HAT） 三个技术基础
单克隆抗体的制备过程 单克隆抗体的应用
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一、基本概念
杂交瘤细胞
指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细
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（三）杂交瘤技术产生的三个技术基础 1、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性
B淋巴细胞（B lymphocytes）：
接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异
性抗体，在体液免疫中具有重要功能。
本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细
胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命 细胞。
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骨髓瘤细胞 (myeloma cells)： 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可
测。
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8、克隆化
由于在一个培养孔内不能保证只存在一种杂交瘤细胞系，
因此必需克隆化。一般需多次克隆化3~5次，才能获得 稳定型基因和稳定分泌特异性抗体的细胞。
要尽早克隆化，以防止单克隆抗体细胞系被竞争淘汰。
分泌抗体的克隆一般生长较慢。
克隆化后的杂交瘤细胞也需定期再克隆，以防突变和染
色体丢失。
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诱导细胞融合的常用方法
生物方法：如仙台病毒 化学方法：如聚乙二醇（PEG） 物理方法：如电融合
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（1）仙台病毒融合法
常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和
副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用
最为广泛。
因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促
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2、骨髓瘤细胞的准备
常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2/0、X63等。 选择要点：稳定易培养、自身不分泌抗体、融
合率高、HGPRT缺陷株（8-氮鸟嘌呤定期筛选 出正常细胞）。
融合条件：对数生长期，良好的细胞形态，活
力细胞达95%。融合前肯定不能少于1周。
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3、饲养细胞的准备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨
高压灭菌（121℃~132℃）20min，溶化呈液状，
PEG尚未凝固时，加入RPMI-1640 20~50ml（与PEG
重量相当）立即充分混合。此为50%PEG保存于室温，
呈碱性，不必调节pH。
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5、细胞融合
（1）SP2/0细胞和免疫脾细胞按1:4的比例放于一个50ml离 心管中，充分混匀，离心后尽量吸尽上清，置于37℃玻 璃杯水浴中。 （2）用1ml吸管将1ml 37 ℃预热的50%PEG溶液，逐滴缓 慢加入混合细胞管中（1min以内加完），边加边轻轻搅
基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体
通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单
核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid
cell） 。
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细胞融合研究进展
Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地 融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组 织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的 血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细 胞发生融合的过程。
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克隆培养方法

有限稀释法（较常用）：使96孔板上其中36孔每孔5个
细胞，另36孔每孔1个细胞，余下24孔每孔0.5个细胞；
亦有经连续稀释成最终30个/ml，每孔0.1ml接种48孔。

软琼脂平板法


FACS选取法
显微挑选法
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克隆化培养后，通常在10~14天测抗体进行阳
性克隆的筛查。
取抗体阳性的克隆，可继续克隆化或进一步扩
进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒 诱导细胞融合。
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用 灭 活 的 病 毒 诱 导 的 动 物 细 胞 融 合 过 程 示 意 图
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（2）聚乙二醇融合法
聚乙二醇（polyethyleneglycol ，PEG） 分子可在质膜
之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融
合。
杂交瘤技术
（hybridoma technique）
姚 娟 安徽医科大学微生物学教研室
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杂交瘤技术又称单克隆抗体制备技术。
1975年，英国剑桥Kö hler和Milstein将骨髓瘤
细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成的杂交
细胞即可产生抗体，又可无限增殖，从而创
立了具有划时代意义的杂交瘤技术。
大培养。
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防染色体丢失、
变异及污染。
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源自文库
9、抗体大量生产
方法主要有两种：
体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从
上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一 般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产， 费用较高。
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补救合成途径
细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶 （HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）， 将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料。
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H—hypoxanthine （次黄嘌呤） A—aminopterin （氨基喋呤） T—thymidine （胸腺嘧啶核苷）
糖和 氨基酸 T 核苷酸 前体 H
抗性标记、营养缺陷、温度敏感
等）。
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HAT是最常用的筛选系统
原理
细胞DNA合成有两条途径：
主要合成途径
补救合成途径
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主要合成途径
即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取
的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷酸，进
而合成DNA。
这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基，
因此该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断。
大规模培养
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McAb技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定 抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞 (hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞 那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特
异性抗体的能力。
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三个基本环节和两个决定因素
选 择 培 养 基 （HAT）
免疫鼠 取脾细胞
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HGPRTˉ细胞的筛选
可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏 HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤
（8-azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可筛选出
HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8-
AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。
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由此可见，HAT选择培养基及补救合成途 径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后 选择出杂交细胞株的关键因素。