杂交瘤技术
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Koehler和Milstein在体细胞融合技术的基础上创立了淋巴细胞杂交瘤（hybri-doma)技术，他们将丧失合成次黄嘌吟-鸟嘌吟磷酸核糖转移酶的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞举行融合，融合的细胞不仅可以延续传代，而且能分泌抗绵羊红细胞的单克隆抗体，这项技术开创了医学与生物学基础讨论的新纪元。
杂交瘤技术具有周期长，高度延续的特点，涉及大量组织细胞培养，细胞免疫学和免疫化学等办法。
一、杂交瘤技术的原理 B淋巴细胞接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，是重要的体液免疫细胞。
B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再举行细胞分裂。
骨髓瘤细胞是恶性增殖的转化细胞，通过细胞融合技术将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，所产生的融合细胞既具有亲本骨髓瘤细胞的无限繁殖的生物学特性，又具有另一亲本B淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。
B淋巴细胞杂交瘤技术的原理可以从以下三个关键之处来阐明：首先是细胞融合剂的挑选，用法细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于互相粘连而融合在一起。
最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。
（PEG1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂，普通应用浓度为40% (W/V)。
第二，细胞融合的挑选培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤( hypoxanthine, H )、甲氨蝶吟( aminopterin, A）和(thymidine, T )，所以取三者的字头称为HAT培养基。
甲氨蝶吟是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。
惟独融合细胞具有亲代双方的遗传性能，能在HAT培养基中长久存活与繁殖。
第三，细胞融合是随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。
筛选过程普通分为两步举行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上举行的特异性抗体筛选，从而找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后举行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养，这一过程称作克隆化。
细胞融合与杂交瘤技术
1.动物细胞筛选方式
抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性
差异筛选杂种细胞。 如，亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏 感
亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏 感
杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上 生长
HAT选择系统
• HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤 （A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养 基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。
40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能 在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。
如，亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左 右生长。
亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉 素。
杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上 生长。
荧光激活细胞分选仪：用不同荧光素标
记的脂质染料分别处理参与融合的亲本细 胞，在激光的激发下，融合细胞能发射两 种荧光，由此筛选杂种细胞。
四、杂交瘤细胞的制备
（周期长，技术性要求强）
制备MAb涉及一系列实验技术方法及 试剂的选择，包括抗原、免疫动物、免疫 方案、筛选检测抗体的方法、骨髓瘤细 胞、饲养细胞、血清、融合剂、细胞融合 方案、杂交瘤细胞克隆化、细胞的扩大培 养和冻存等。
单抗的制备过程：
• 动物免疫与亲本细胞的选择 • 细胞融合：淋巴细胞杂交瘤
杂交细胞遗传表型的控制过程：
遗传表型的动态观察和定期分析 （核型与带型）
建立种子细胞库，定期传代分种， 避免细胞过度生长
稳定的染色体数（或倍性、个数变化） 与带型，能有稳定的产物
第二节 杂交瘤技术与 单克隆抗体的生产
一、基本概念 二、杂交瘤技术的基本原理 三、单克隆抗体的特性 四、杂交瘤细胞的制备 五、单克隆抗体的应用
杂交瘤技术(hybridoma technique)基本程序与方法 6
杂交瘤技术（hybridoma technique）基本程序与方法 6（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的 -5℃?0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。
即复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。
用5-10ml HT培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。
如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔细胞进行培养。
不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。
在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
6、单抗特性的鉴定（1）单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。
①杂交瘤细胞的染色体分析对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。
另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。
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制备单克隆抗体
从筛选得到的杂交瘤 细胞中提取单克隆抗 体，进行纯化和定量 。
应用单克隆抗体
将单克隆抗体应用于 临床诊断、治疗和基 础研究等领域。
单克隆抗体技术的实验操作流程
免疫原制备
制备免疫原，如抗原蛋白或多糖等，并进行 纯化和定量。
免疫动物
将免疫原注射入动物体内，刺激机体产生特异 性抗体。
制备杂交瘤细胞
杂交瘤技术和单克隆
抗体技术ppt课件模
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2024-01-11
目录
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较 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的实
验操作流程 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的应
用案例
01
杂交瘤技术简介
杂交瘤技术的定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B淋巴细胞与骨髓瘤细 胞融合，形成杂交瘤细胞的技术。
单克隆抗体的应用领域
01 肿瘤诊断与治疗
用于肿瘤的早期诊断、靶 向治疗、免疫治疗等。
03
免疫性疾病。
02 感染性疾病
用于诊断和治疗病毒性肝 炎、艾滋病等感染性疾病 。
04 心血管疾病
用于诊断和治疗冠心病、
心肌梗死等心血管疾病。
杂交瘤技术与单克隆抗体技
杂交瘤技术与单克隆抗体技
04
术的实验操作流程
杂交瘤技术的实验操作流程
准备免疫动物
选择适宜的免疫动物 ，如小鼠或大鼠，并 进行免疫接种，刺激 机体产生特异性抗体 。
制备杂交瘤细胞
将免疫动物的脾细胞 与肿瘤细胞融合，形 成杂交瘤细胞。
克隆化筛选
通过选择性培养基筛 选出能够产生所需抗 体的杂交瘤细胞，并 进行克隆化培养。
杂交瘤细胞生成抗体技术
杂交瘤细胞生成抗体技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。
他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。
融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。
在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。
实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。
用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。
生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。
杂交瘤技术名词解释
杂交瘤技术名词解释
杂交瘤技术 (Hybridoma Technology) 是一种用于生产单克隆
抗体的生物技术，也被称为免疫杂交技术或细胞融合技术。
该技术利用肿瘤细胞或脾细胞作为受体细胞，将抗原基因融合到受体细胞的染色体中，从而使受体细胞能够产生并分泌单克隆抗体。
在杂交瘤技术中，两种细胞类型被结合到一起：一种是人类淋巴细胞 (humoral lymphocyte),另一种是肿瘤细胞或脾细胞
(cytotoxic lymphocyte)。
这两种细胞类型的结合会产生一种杂交瘤细胞，这种细胞能够同时产生人类淋巴细胞和肿瘤细胞或脾细胞产生的抗体。
杂交瘤技术有许多应用，包括制备治疗用抗体、研究免疫反应、开发新药物检测方法等。
该技术的优点是利用单个细胞生产大量抗体，具有很高的产量和纯度。
此外，杂交瘤技术还能够生产高度特异性的抗体，对于治疗某些疾病具有重要意义。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术
四、免疫系统能将外来微生物和分子与本身成份区别开来。
五、系统记忆每一次与外来抗原旳遭遇
免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免 疫记忆能够延续动物终身。
六、免疫反应旳许多性质是经过克隆选择拟定旳
一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合 抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急 剧分裂克隆）。
重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。 二、不同类型抗体旳区别
IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。 它们旳重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。
重链旳不同使这些蛋白具有不同形式旳免疫功能，而且在 完毕反应成熟旳不同阶段发挥作用。这些差别主要是因为Fc 片段上旳蛋白序列不同所致。
四、抗体重链旳分子构造
重链旳序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链具 有一种可变区和三个恒定区，每区含110个氨基酸，其他重 链具有附加旳恒定区。
IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、 IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。
五、重链和轻链旳可变区形成抗原结合位点
B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体旳修饰型， 功能相当于受体。
毒性T细胞：携带结合抗原旳细胞表面受体。 辅助T细胞：在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关 键旳调整作用。
体液介导旳适应性免疫反应：体液反应引起产生可结合外 来抗原旳循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞 介导是抗体技术旳基础。
HAT选择培养基：HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄 嘌呤（H）、氨基喋呤（A）或氮丝氨酸（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）旳培养基。细胞为合成DNA所需要旳嘌呤和嘧啶，可 由两条途径取得。一条为主要途径，即从磷酸核糖焦磷酸 （PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），进而转变为脱氧 鸟苷三磷酸（dGTP），及从脱氧尿苷酸（dUMP）合成脱氧 胸苷酸（dTMP），再转变为脱氧胸苷三磷酸（dTTP）。这 一合成途径，可为加入旳会克制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基旳 二氢叶酸还原酶旳叶酸类似物A所阻断。此时，只有HGPRT+ 和TK+细胞才干经过另一条应急途径，利用外加旳核苷酸旳 “前体”H来合成IMP和利用T来合成dTMP，而得以有活下 来。相反，HGPRT－和TK－细胞则将因无法利用H和T来合成 DNA而死亡。所以，在HGPRT－和TK－细胞融合后，应用 HAT培养基即可将经过基因互补而同步取得HGPRT和TK酶 旳杂种细胞筛选出来。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术专家讲座
杂交瘤技术和单克隆抗体技术
第21页
4、抗原形式 5、注射路径：需考虑三个问题。
1）要注射多大剂量； 2）与免疫原同注是什么缓冲液，还有其它什么成份； 3）免疫原释放入淋巴系统及循环系统速度怎样？ 对于兔，大致积注射常采取皮下多点注射。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术
第20页
三、动物免疫
1、动物选择 Balb/c小鼠，6~8周龄；兔子生后约12周。 动物数：小鼠4~6只；兔子2~4只。
2、佐剂 免疫反应非特异性刺激物叫做佐剂，诱导对可溶性抗原
抗体反应必须使用佐剂。但对颗粒性抗原或全细胞抗标准 不是必须。
佐剂包含两种原因：一是佐剂是贮备性物质以预防抗原迅 速代谢；二是佐剂必须是能够非特异性地刺激免疫反应物 质。试验时普通是将水溶液注入到佐剂中。 3、抗原剂量
杂交瘤技术和单克隆抗体技术
第1页
3、免疫系统含有109以上淋巴细胞遍布全身，确保了它们在 任何部位都能快速反应。淋巴细胞由骨髓中原始干细胞不 断产生，经血液及淋巴系统循环，暂时停顿并积聚于称作淋 巴器官特异化结构中，在哺乳动物中就是淋巴结和肝脏。 在免疫反应过程中，免疫原积聚于一个淋巴器官中，这个淋 巴器官就变成了免疫反应焦点。
第四讲 杂交瘤细胞和单克隆抗体技术
第一节、免疫基本知识
一、免疫系统：分非适应性免疫和适应性免疫两类。 1、非适应性免疫是由非特异性反应细胞介导。如：巨 噬细胞吞噬作用，泌细胞分泌溶菌酶，以及中性细胞造 成细胞裂解机制。 2、适应性免疫：是针对特定分子，而且可经重复暴露于外 源分子使之加强淋巴细胞合成细胞表面受体或分泌特异性蛋 白结合外源分子。这些分泌蛋白称为抗体；可与抗体结合 分子被称为抗原。当一个分子被用于诱导适应性反应时， 这个分子就被叫做免疫原。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体来源：1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体制备的一般流程如下:单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体制备的一般流程如下:单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
简述杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程
通过杂交瘤技术创建单克隆抗体的第一步就像给一只老鼠一个特殊的任务——成为超级抗体生产商！我们从给老鼠注射抗原开始，就像送它去执行一个秘密任务，寻找和摧毁敌人。
这个"免疫"过程让老鼠的免疫系统都爆发了，就像超级英雄准备拯救这一天一样，它开始产生抗原抗体，准备战胜坏蛋！
是时候让那些脾细胞从免疫鼠！脾脏就像B细胞的聚会中心，抗体产生岩星。
之后，我们将把这些脾脏细胞与肌瘤细胞结合，这些细胞基本上是细胞世界的不朽的阴茎。
这种聚变将产生杂交质瘤细胞，超级细胞具有产生抗体和永远分裂的力量。
这就像创造了一个超级英雄团队为了对付坏人，但在细胞层面！让核聚变的乐趣开始吧！
接下来令人兴奋的一步是把我们的杂交瘤细胞进行测试，看看哪些细胞具有产生抗体的超能力，这些抗原是激光聚焦于我们的目标抗原。
这些超级巨星细胞然后在实验室里被踢回并放松，在那里它们可以像小的抗体工厂一样，把数吨的单克隆抗体挤出。
一旦我们得到了一大批这些强大的抗体，我们可以给他们一个温泉日并净化它们，让他们都准备好在诊断测试中或作为治疗的英雄。
说到生化的冒险！。
杂交瘤技术
杂交瘤技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备目前，在世界上，已建立起数以千计的具有各种特异性的单克隆杂交瘤细胞系，它们所产生的单克隆抗体，在许多领域得到广泛应用。
1单克隆抗体在诊断上的应用单克隆抗体可辨认抗原物质结构的微细差异，并和抗原发生特异性结合，用放射免疫法能精确地测定抗原物质在体内的含量及变化。
对某些常见病、传染病、寄生虫病、肿瘤及体内激素或酶的缺陷症，做出快速而正确地判断。
希伯(Hbure)等用放射性同位素标记的单克隆抗体追踪心肌组织肌球蛋白的变化，拍摄了心肌损伤部位的可见图象。
目前已研制出能鉴定麻疹病毒、狂犬病毒、牛腹泻病毒、马流产病毒马传染性贫血病毒、牛鼻气管炎病毒、口蹄疫病毒等的单克隆抗体。
用放射性同位素标记的抗癌细胞单克隆抗体，在体内和癌细胞发生特异性结合，可发现用常规方法不能探测出的微小肿瘤的存在及其位置。
2单克隆抗体在治疗上的应用给患病的机体注射一定剂量的特异性单克抗体能增强机体对该病的抵抗力弗里曼隆(Freeman)等用含有抗疟原虫单克隆抗体的小鼠血清,注射给已感染疟原虫的小鼠，使病鼠的死亡率下降。
已研制出抗人恶性疟原虫单克隆抗体。
此外单克隆抗体还有解毒和脱敏作用，这是由于它能和血中的过量药物发生中和作用或与药物的受体部位相结合产生竞争性抑制的结果。
单克隆抗体对癌症的治疗，可做出重大贡献。
当抗癌细胞的单克隆抗体与大剂量的放射性化合物或细胞毒剂相偶联后，注人体内再同癌细胞结合就能在原位把癌细胞致死人们把这种新疗法叫做癌症的导弹疗法。
所用的细胞毒剂包括抗癌药物—氨甲喋吟、苯丁酸氮芥等，毒素—白喉毒素、蓖麻毒素蛋白等。
米勒(miller)等人用这种疗法治疗白血病和淋巴瘤时得到了满意的效果。
单克隆抗体对过去无法治疗的“严重混合免疫缺陷症”有特效。
哈佛医学院莱因赫茨(Reinehrz)等成功地用多种单克隆抗体治疗这种病的患者。
此外单克隆抗体还是一种很有应用前景的免疫抑制剂。
比泊(Bieber)等人建立了能生产抗胸腺细胞的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，做异体植皮试验时，给实验猴注射这种单克隆抗体使异体皮的存活期延长十夭。
杂交瘤技术应用、优缺点、常见问题解析
杂交瘤技术应用、优缺点、常见问题解析杂交瘤技术又称细胞融合技术，是将两个或多个细胞融合成一个。
融合后形成的杂交瘤细胞承袭了两亲本细胞的特征。
自发的细胞融合很少发生，当加入一种融合剂，如：聚乙二醇（常用）、仙台病毒或溶血卵磷脂后，两种细胞就可发生融合。
首先是质膜互相融合，形成具有两个或多个核的异核体，细胞进一步分裂时，核互相融合，形成了杂交细胞。
杂交瘤技术优缺点：优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。
缺点：a.操作步骤繁琐。
b.利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(HAMA）反应、在人体循环系统中很快被清除等。
杂交瘤技术应用：①诊断应用：单克隆抗体在疾病诊断中发挥了重要作用，其优点在于诊断准确且无交叉反应，例如在乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒的诊断中，单克隆抗体能显著减少假阴性的漏诊。
②治疗载体：单克隆抗体也可作为治疗疾病的载体。
通过与抗肿瘤药物结合，单克隆抗体能在体内选择性集中攻击肿瘤细胞，具有靶向性，从而减少对正常组织的损伤并减轻抗癌药物的副作用。
因此，载药单克隆抗体被誉为“生物导弹”。
③异种蛋白质问题：目前大多数单克隆抗体为鼠-鼠型，对于人体来说属于异种蛋白质，容易引起排异反应，限制了其在治疗中的应用。
④人-人型单克隆抗体的研究：为了解决排异问题，研究者正在努力研发人-人型单克隆抗体，以利于其在治疗中的广泛应用。
杂交瘤技术常见问题解析：①电融合和PEG融合的区别？PEG化学融合是利用聚乙二醇分子能够改变细胞膜结构的特性来实现细胞融合的过程。
聚乙二醇可以使两个细胞接触点质膜的脂质分子发生疏散和重组，两个细胞接触部位的质膜由于相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而发生细胞融合。
电融合则是先通过高频交流电压，使细胞成串珠状排列，实现点接触；然后施加方波脉冲，击穿两个细胞接触部位的质膜，质膜脂质分子发生重组，同时由于细胞表面张力作用，完成细胞融合。
通用生物杂交瘤测序
通用生物杂交瘤测序通用生物杂交瘤测序是一种重要的基因组学技术，可以用于研究生物体基因组的结构和功能。
本文将介绍通用生物杂交瘤测序的原理、应用和优势。
一、通用生物杂交瘤测序的原理通用生物杂交瘤测序是一种将两个不同生物体的基因组进行融合，形成杂交瘤的技术。
这种融合可以通过细胞融合剂或电脉冲等方法实现。
融合后的杂交瘤细胞具有两个不同生物体的遗传信息，包括基因组的DNA序列。
通用生物杂交瘤测序的关键在于利用高通量测序技术对杂交瘤细胞的基因组进行测序。
通过测序，可以获得杂交瘤细胞的DNA序列信息，进而了解两个不同生物体的基因组结构和功能。
通用生物杂交瘤测序在基因组学研究中具有广泛的应用。
1. 基因组结构分析：通过对杂交瘤细胞进行测序，可以获得两个不同生物体基因组的DNA序列信息，从而揭示基因组的结构和组织。
2. 基因组功能研究：通用生物杂交瘤测序可以帮助研究人员了解基因组中各个基因的功能和相互作用关系，进而揭示基因组的功能模式和调控机制。
3. 基因变异分析：通过对杂交瘤细胞进行测序，可以发现两个不同生物体基因组之间的变异情况，包括单核苷酸多态性和结构变异等。
这对于研究基因的进化和适应性具有重要意义。
三、通用生物杂交瘤测序的优势通用生物杂交瘤测序相比传统的测序方法具有以下优势：1. 高通量：通用生物杂交瘤测序可以同时测序两个不同生物体的基因组，提高了测序的效率和通量。
2. 全基因组测序：通用生物杂交瘤测序可以对整个基因组进行测序，包括编码区和非编码区，有助于全面了解基因组的结构和功能。
3. 低成本：通用生物杂交瘤测序相比传统的测序方法成本更低，可以更好地满足大规模基因组研究的需求。
四、总结通用生物杂交瘤测序是一种重要的基因组学技术，可以用于研究生物体基因组的结构和功能。
通过对杂交瘤细胞进行测序，可以获得两个不同生物体的基因组信息，进而揭示基因组的结构和功能。
通用生物杂交瘤测序具有高通量、全基因组测序和低成本等优势，广泛应用于基因组学研究领域。
杂交瘤细胞的保存与复苏技术介绍
杂交瘤细胞的保存与复苏技术介绍筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。
抗体制备有两种方法。
一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。
该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。
最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。
选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。
通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。
该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。
此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
接种细胞的数量应适当，一般为5×105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。
选出的阳性细胞株应及早冻存。
冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱则活性改变较快。
细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。
二甲亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。
冻存细胞复苏后的活性多在50％～95％之间。
如果低于50％，则说明冻存复苏过程有问题。
当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。
另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。
所以必须冷藏保存一部分。
保存方法如下：1．材料(1) 细胞：取对数生长期的细胞。
(2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。
其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。
(3) 20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
(4) 灭菌的2ml安瓶等2．操作方法(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。
杂交瘤技术
10.3 杂交瘤细胞的建株
动物免疫
免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合
HAT选择培养
阳性杂交瘤筛选
克隆化培养
10.3.1 免疫抗原
抗原物质主要分为可溶性抗原和颗粒性抗原。 可溶性抗原包括蛋白质、碳水化合物和核酸等。常与福 氏佐剂合用以增强免疫原性。
颗粒性抗原包括完整的细胞、病毒和细菌，由于它们具 有较强的免疫原性，不需加用免疫佐剂。
10.3.9 阳性杂交瘤的筛选
细胞融合后能否获得目的杂交瘤，特异、灵敏、快速、 稳定筛选方法的建立十分重要。 一般在动物免疫前，就要根据抗原的性质及实验室的 条件确定切实可行的阳性杂交瘤的筛选方法。 常用的检测方法有 酶联免疫吸附分析法 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、 放射免疫分析法（radioimmmunoassay, RIA）
按骨髓瘤细胞:免疫脾细胞为1:5的比例，吸取适当体 积的骨髓瘤细胞悬液与免疫脾细胞悬液混合于50ml离 心管中，洗涤3遍。将上清尽量弃尽，用手指弹击管底， 使两种细胞充分混匀成糊状。 将离心管臵于37℃的保温杯中，用1ml的吸管吸取已经 37℃预温的50%的PEG溶液0.7～1.0ml，将吸管的尖端 插入管底，继而边轻轻地搅动细胞，边缓缓地滴加 PEG溶液，1min内加完，并在水浴中静臵90秒钟，立 即滴加37℃预温的基础培养液。
免疫荧光分析法（immunofluorescence assay, IFA）等。
在HAT选择培养7～10天后，即可见部分杂交瘤细胞的 克隆长至1/4～1/3孔，此时即可取杂交瘤细胞的培养上 清进行特异性抗体的检测，确定有无分泌单抗的能力， 以便及时进行细胞克隆化。 进行检测的杂交瘤，最好在测定前3天不要换液，待培 养液的颜色变黄吸出测定，以免抗体被稀释而出现假 阴性，造成阳性克隆的丢失。
筛选单克隆抗体的方法
筛选单克隆抗体的方法
单克隆抗体是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的重要
工具。
然而，如何从众多的抗体中筛选出具有高亲和力和特异性的单克隆抗体一直是一个具有挑战性的问题。
下面介绍几种主要的筛选单克隆抗体的方法。
1. 杂交瘤技术
杂交瘤技术是制备单克隆抗体最常用的方法。
它包括四个主要步骤：免疫动物、细胞融合、筛选和克隆化。
该方法的优点是可以制备高亲和力和特异性较好的单克隆抗体，但其缺点是制备周期长、成本高，且适用范围受到制备抗原的限制。
2. phage display技术
phage display技术是一种通过噬菌体展示抗原表位以筛选单克隆抗体的方法。
在该方法中，抗体基因库被插入到噬菌体表面的蛋白质中，然后通过筛选可以筛选出具有高亲和力和特异性的单克隆抗体。
该方法的优点是速度快、成本低，且可以制备一系列不同抗原的单克隆抗体。
但其缺点是筛选的抗体可能存在亲和力较低或特异性较差的情况。
3. 单细胞PCR技术
单细胞PCR技术是一种通过单个B细胞进行PCR扩增和测序以制备单克隆抗体的方法。
该方法的优点是可以制备高亲和力和特异性较好的单克隆抗体，且可以避免杂交瘤技术中的克隆化步骤，但其缺点是制备周期长、成本高。
总体而言，筛选单克隆抗体的方法有多种，不同方法各有优缺点，选择合适的方法需要根据具体的实验要求进行评估。
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进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒 诱导细胞融合。
13
用 灭 活 的 病 毒 诱 导 的 动 物 细 胞 融 合 过 程 示 意 图
14
（2）聚乙二醇融合法
聚乙二醇（polyethyleneglycol ，PEG） 分子可在质膜
之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融
合。
11
诱导细胞融合的常用方法
生物方法：如仙台病毒 化学方法：如聚乙二醇（PEG） 物理方法：如电融合
12
（1）仙台病毒融合法
常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和
副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用
最为广泛。
因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促
其优点是融合成本低，勿需特殊设备；简便、融合效
率较高。因此在1975年获得成功后很快取代仙台病毒 法。
pH6,浓度50%，分子量小于1000的融合效果最好
15
16
（3）电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，将细胞置于电
场中，使它们彼此靠近紧密接触并排列呈串，然后在高 强度、短时程的直流电脉冲的作用下，相互连接的细胞 膜被击穿而导致细胞融合。
脾细胞
不能长期存活
骨髓瘤细胞
筛选出
30
HAT培养基筛选
B淋巴细胞： HGPRT+，TK+
存活但短命
骨髓瘤细胞： HGPRTˉ或TKˉ
杂交瘤细胞： HGPRT+，TK+
死亡
长期存活，
且产抗体，
31
三、单克隆抗体 的制备过程
动物免疫 细胞融合及HAT筛选
抗体的检测
杂交瘤细胞的克隆化
基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体
通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单
核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid
cell） 。
9
细胞融合研究进展
Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地 融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组 织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的 血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细 胞发生融合的过程。
腔巨噬细胞。其中小鼠腹腔巨噬细胞使用最为 普遍，因其来源及制备较为方便，且有吞噬清 除死亡细胞及其碎片的作用。
饲养细胞的制备：
细胞融合前一天，从同系正常小鼠腹腔取巨噬细 胞，加入培养板，96孔板每孔细胞数为2×104；24孔板， 每孔为1×105个，置37℃培养。
39
4、 50%PEG配制
称20~50g PEG1500~4000粉剂，放于玻璃瓶中，
大培养。
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防染色体丢失、
变异及污染。
47
9、抗体大量生产
方法主要有两种：
体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从
上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一 般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产， 费用较高。
TK HGPRT IMP
A
TMP
核苷酸
DNA
DNA的生物合成途径与HAT选择培养基
23
凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能
利用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；
HGPRTˉ或TKˉ细胞在HAT培养基上不能存活；
HGPRTˉ与TKˉ细胞融合或与正常细胞融合后的
杂交细胞，可在HAT培养基上存活。
胞，它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力，
又具有参与融合的体细胞的一些特征。
5
杂交瘤技术（也称单克隆抗体制备技术）
是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B 淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋 巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂
交瘤细胞系的技术。
6
单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb)
测。
44
8、克隆化
由于在一个培养孔内不能保证只存在一种杂交瘤细胞系，
因此必需克隆化。一般需多次克隆化3~5次，才能获得 稳定型基因和稳定分泌特异性抗体的细胞。
要尽早克隆化，以防止单克隆抗体细胞系被竞争淘汰。
分泌抗体的克隆一般生长较慢。
克隆化后的杂交瘤细胞也需定期再克隆，以防突变和染
色体丢失。
拌。
（3）继续搅动1分钟，目的使所有的细胞尽可能地与PEG 接触。
41
（4）慢慢加入预热的无血清1640 1ml ，1min，目的是稀释 PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml ，2-3min内加完，
并持续轻轻搅动，此时细胞对机械损伤非常敏感。
（5）离心1000rpm，室温10 min，去上清。 （6）取预热的15%牛血清1640，先加10ml，对准细胞团加液， 使细胞颗粒均匀分布于悬液中；再加90ml。制成约 2×106/ml细胞悬液。
高压灭菌（121℃~132℃）20min，溶化呈液状，
PEG尚未凝固时，加入RPMI-1640 20~50ml（与PEG
重量相当）立即充分混合。此为50%PEG保存于室温，
呈碱性，不必调节pH。
40
5、细胞融合
（1）SP2/0细胞和免疫脾细胞按1:4的比例放于一个50ml离 心管中，充分混匀，离心后尽量吸尽上清，置于37℃玻 璃杯水浴中。 （2）用1ml吸管将1ml 37 ℃预热的50%PEG溶液，逐滴缓 慢加入混合细胞管中（1min以内加完），边加边轻轻搅
抗性标记、营养缺陷、温度敏感等）。19HAT是最常用的筛选系统
原理
细胞DNA合成有两条途径：
主要合成途径
补救合成途径
20
主要合成途径
即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取
的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷酸，进
而合成DNA。
这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基，
因此该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断。
培养筛选 骨髓瘤细胞系
融合
饲 养 细 胞
35
1、免疫小鼠和脾细胞的制备
免疫动物：6~8周龄BALB／c小鼠 免疫抗原：纯度越高越好，各种病毒、细菌、细胞或可溶性抗原。 一般可溶性抗原用完全佐剂效果较好。甚至PAGE胶条带直接研 磨亦可。
免疫途径：皮下、腹腔或静脉注射 免疫程序：基础免疫2~3次，静脉再加强免疫1次。 加强免疫后3~5天解剖，取脾细胞配制成适量浓度细胞悬液用于 融合。
43
7、抗体的筛查
细胞融合后两周即可筛查抗体。选择检测方法以快速、
简便、特异、敏感和便于一次处理大量样品为原则。
常用的方法有：
ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等
McAb的检测。
RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
FACS(流式细胞术)用于检查细胞表面抗原的McAb检
髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数
分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加
入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞 称为饲养细胞（Feeder cells）。
机制尚不明了，一般认为：
可能释放非种属特异性的生长刺激因子； 也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
38
常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹
其优点是：
融合率高、重复性强、对细胞伤害小；
可在显微镜下观察融合过程； 诱导过程可控性强。
17
电融合示意图
18
（二）杂种细胞的筛选
人工诱导细胞融合是一个随 机的过程，可能产生多种类型的 细胞，筛选的目的是获得优良的 杂种细胞。 应根据其细胞特性来选择适 当的筛选方法（如酶缺陷、药物
26
（三）杂交瘤技术产生的三个技术基础 1、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性
B淋巴细胞（B lymphocytes）：
接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异
性抗体，在体液免疫中具有重要功能。
本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细
胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命 细胞。
27
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)： 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可
24
HGPRTˉ细胞的筛选
可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏 HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤
（8-azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可筛选出
HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8-
AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。
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由此可见，HAT选择培养基及补救合成途 径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后 选择出杂交细胞株的关键因素。
（7）加入已含有饲养细胞的96孔板或24孔板（每孔加入细胞
数分别为2×105 和1×106 ）。
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6、HAT 和HT选择培养
（1）接种24h后加入HAT选择培养液。 （2）融合后7~10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加
一半新的)，以后每2~3天半量换液一次。
（3）两周后换HT培养液（目的是洗出残留于细胞内的氨 基喋呤），以后每3~4天换液一次。 （4）再维持培养两周改用一般培养液。
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2、骨髓瘤细胞的准备
常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2/0、X63等。 选择要点：稳定易培养、自身不分泌抗体、融
合率高、HGPRT缺陷株（8-氮鸟嘌呤定期筛选 出正常细胞）。
融合条件：对数生长期，良好的细胞形态，活
力细胞达95%。融合前肯定不能少于1周。
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3、饲养细胞的准备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨