杂交瘤技术ppt课件
合集下载
杂交瘤技术和单克隆抗体技术PPT课件模板
制备单克隆抗体
从筛选得到的杂交瘤 细胞中提取单克隆抗 体，进行纯化和定量 。
应用单克隆抗体
将单克隆抗体应用于 临床诊断、治疗和基 础研究等领域。
单克隆抗体技术的实验操作流程
免疫原制备
制备免疫原，如抗原蛋白或多糖等，并进行 纯化和定量。
免疫动物
将免疫原注射入动物体内，刺激机体产生特异 性抗体。
制备杂交瘤细胞
杂交瘤技术和单克隆
抗体技术ppt课件模
板
汇报人：可编辑
2024-01-11
目录
• 杂交瘤技术简介 • 单克隆抗体技术简介 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的比
较 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的实
验操作流程 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的应
用案例
01
杂交瘤技术简介
杂交瘤技术的定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B淋巴细胞与骨髓瘤细 胞融合，形成杂交瘤细胞的技术。
单克隆抗体的应用领域
01 肿瘤诊断与治疗
用于肿瘤的早期诊断、靶 向治疗、免疫治疗等。
03
免疫性疾病。
02 感染性疾病
用于诊断和治疗病毒性肝 炎、艾滋病等感染性疾病 。
04 心血管疾病
用于诊断和治疗冠心病、
心肌梗死等心血管疾病。
杂交瘤技术与单克隆抗体技
杂交瘤技术与单克隆抗体技
04
术的实验操作流程
杂交瘤技术的实验操作流程
准备免疫动物
选择适宜的免疫动物 ，如小鼠或大鼠，并 进行免疫接种，刺激 机体产生特异性抗体 。
制备杂交瘤细胞
将免疫动物的脾细胞 与肿瘤细胞融合，形 成杂交瘤细胞。
克隆化筛选
通过选择性培养基筛 选出能够产生所需抗 体的杂交瘤细胞，并 进行克隆化培养。
杂交瘤技术的实验原理
融合方法
通过物理或化学方法诱导 细胞融合，如电融合、聚 乙二醇等。
融合率
确保高融合率，以获得足 够数量的杂交瘤细胞。
抗体生成原理
通过筛选获得高亲和力的 特异性抗体。
产生的抗体可以是IgG、 IgM等不同类别。
杂交瘤细胞在适宜的条件 下产生特异性抗体。
抗体产生
抗体亲和力 抗体类别
抗体筛选原理
筛选方法
生物标志物发现
利用杂交瘤技术可以发现新的生物标志物，有助于深入了解生物学过程和疾病 发病机制。
THANK YOU
05
杂交瘤技术的应用前景与展望
杂交瘤技术在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤标志物检测
利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可以用于肿瘤标志物的检测，有助于肿瘤的早期发现和诊断。
免疫治疗
杂交瘤技术制备的单克隆抗体可以用于肿瘤的免疫治疗，通过与免疫细胞结合，激活免疫系统对肿瘤细胞的攻击。
杂交瘤技术在疫苗研发中的应用
1980年代
1990年代至今
随着基因工程技术的发展，出现了多 种改进的杂交瘤技术，如基因敲除、 转基因动物模型等，进一步拓展了杂 交瘤技术的应用范围。
杂交瘤技术开始应用于临床诊断和生 物治疗领域，成为单克隆抗体产业化 的基础。
02
杂交瘤技术的实验原理
细胞融合原理
01
02
03
细胞融合
将免疫细胞与肿瘤细胞融 合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤技术的实验原理
目 录
• 杂交瘤技术概述 • 杂交瘤技术的实验原理 • 杂交瘤技术的实验步骤 • 杂交瘤技术的优缺点 • 杂交瘤技术的应用前景与展望
01
杂交瘤技术概述
定义与特点
定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B细 胞和骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细 胞的技术。
杂交瘤技术制备单克隆抗体PPT医学课件
磷酸核糖转移酶-HGPRT和胸腺嘧啶核苷激酶-TK两种 酶的参与）
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要 途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT和TK 缺乏，DNA合成的替代途径受阻 融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋 巴细胞的HGPRT和TK，可采用补救途径合成DNA， 因此可在HAT培养基上存活和繁殖。
免疫脾细胞
处于免疫状态脾脏中的B淋 巴母细胞或浆母细胞
动 物：
6～12周龄 20g～25g体重
2、骨髓瘤缺陷细胞株的培养和选择
对骨髓瘤细胞的要求：
（1）与免疫动物属同一品系（融合效率高、便于接种杂交瘤细胞在同一品 系小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。） （2）选择HGPRT—株（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型)或TK（胸 腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞（细胞系在核酸类似物存在时会产生 HGPRT缺乏的突变株，该突变株不能在HAT培养基上生长。） (3)在细胞融合前两周复苏骨髓瘤细胞，保证骨髓瘤细胞处于对数 生长期。
骨髓瘤细胞的培养
1、采用一般的动物细胞培养液，小牛血清的浓度一般 在10%~20%，细胞的最大密度不得超过106cells/mL。
2、骨髓瘤细胞可以悬浮或半贴壁形一 般扩大培养以1:10稀释传代。）
HAT选择培养基的原理
HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要 途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替 代途径合成DNA
杂交瘤细胞的选择性培养
细胞DNA合成途经：
1.正常途径： 糖、氨基酸 核苷酸 DNA(可被A-氨基蝶呤阻断) 2、补救途径： 核苷酸前体 核苷酸 DNA （需要次黄嘌呤鸟嘌呤
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要 途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT和TK 缺乏，DNA合成的替代途径受阻 融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋 巴细胞的HGPRT和TK，可采用补救途径合成DNA， 因此可在HAT培养基上存活和繁殖。
免疫脾细胞
处于免疫状态脾脏中的B淋 巴母细胞或浆母细胞
动 物：
6～12周龄 20g～25g体重
2、骨髓瘤缺陷细胞株的培养和选择
对骨髓瘤细胞的要求：
（1）与免疫动物属同一品系（融合效率高、便于接种杂交瘤细胞在同一品 系小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。） （2）选择HGPRT—株（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型)或TK（胸 腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞（细胞系在核酸类似物存在时会产生 HGPRT缺乏的突变株，该突变株不能在HAT培养基上生长。） (3)在细胞融合前两周复苏骨髓瘤细胞，保证骨髓瘤细胞处于对数 生长期。
骨髓瘤细胞的培养
1、采用一般的动物细胞培养液，小牛血清的浓度一般 在10%~20%，细胞的最大密度不得超过106cells/mL。
2、骨髓瘤细胞可以悬浮或半贴壁形一 般扩大培养以1:10稀释传代。）
HAT选择培养基的原理
HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要 途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替 代途径合成DNA
杂交瘤细胞的选择性培养
细胞DNA合成途经：
1.正常途径： 糖、氨基酸 核苷酸 DNA(可被A-氨基蝶呤阻断) 2、补救途径： 核苷酸前体 核苷酸 DNA （需要次黄嘌呤鸟嘌呤
第十一章动物细胞融合和杂交瘤技术 演示文稿ppt课件
• 单克隆抗体（McAb）的应用：
• 主要用于疾病的诊断、治疗和预防。 • 如各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血 吸虫等数百种疾病的诊断。 • 在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能 识别“自己”与“异己”，一旦发现致病因素便 与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制 成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部 位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。 • 与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优 点。
2、聚乙二醇诱导融合
•
继高国楠(Kao) 用PEG成功诱导植物原生
质体融合后，1975年，Potecrvo用该法成功
融合动物细胞。该法以其特有的优势迅速取代
病毒诱导动物细胞融合。
3、电诱导融合
• 同植物原生质体融合
聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤
（1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1
一、动物细胞融合技术
•Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无 脊椎动中发现了细胞合并现象。 •1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触 发动物细胞融合的效应。 •1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG） 化学融合法。
•1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细 胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤 细胞。 •20世纪80年代出现了电融合技术。
细胞膜上，并使两细胞相互凝聚； ②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此 时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2； ③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；
xb六、细胞融合与杂交瘤技术PPT课件
的制备 • 杂交瘤细胞的筛选：有限稀
释法等 • 单克隆抗体的制备和冻存 • 单克隆抗体的纯化
60
1.亲本细胞的选择
个或多个相同或不同细胞通
过膜融合形成单个细胞的过
程。
4
5
2.发生：
自然界存在很多细胞融合现象，如：
受精、成肌细胞融合，但频率低； 细胞内吞与外排也属细胞膜融合现象； 细胞内膜系统物质运输过程等。
6
3.细胞融合研究进展
Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核 的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞 现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过 程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细 胞合并现象。 1958年日本学者冈田善雄发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产 生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。
7
几种细胞融合成功的例子
生物种类
细胞来源
烟草两个种间
苷蓝——青菜 大豆——马唐草 矮牵牛——龙面花
大麦——花生 大麦——大豆 小麦——矮牵牛 油菜——大豆 玉米——大豆 大豆——野豌豆 大麦——蚕豆 大豆——草香木犀 酵母菌——鸡 大豆——烟草 大豆——秋水仙 人——胡萝卜 番茄——马铃薯 人——小鼠
52
●杂交瘤技术（hydridoma technique，也称MAb制备技术）
释法等 • 单克隆抗体的制备和冻存 • 单克隆抗体的纯化
60
1.亲本细胞的选择
个或多个相同或不同细胞通
过膜融合形成单个细胞的过
程。
4
5
2.发生：
自然界存在很多细胞融合现象，如：
受精、成肌细胞融合，但频率低； 细胞内吞与外排也属细胞膜融合现象； 细胞内膜系统物质运输过程等。
6
3.细胞融合研究进展
Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核 的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞 现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过 程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细 胞合并现象。 1958年日本学者冈田善雄发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产 生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。
7
几种细胞融合成功的例子
生物种类
细胞来源
烟草两个种间
苷蓝——青菜 大豆——马唐草 矮牵牛——龙面花
大麦——花生 大麦——大豆 小麦——矮牵牛 油菜——大豆 玉米——大豆 大豆——野豌豆 大麦——蚕豆 大豆——草香木犀 酵母菌——鸡 大豆——烟草 大豆——秋水仙 人——胡萝卜 番茄——马铃薯 人——小鼠
52
●杂交瘤技术（hydridoma technique，也称MAb制备技术）
杂交瘤技术的实验原理及其操作演示
单克隆抗体技术实验目的了解单克隆抗体的制备过程实验原理根据肿瘤细胞可以无限增殖、B细胞可以分泌抗体的特点将他们在体外融合，通过一定的筛选方法得到既可以分泌特异抗体，又可以无限增殖的融合细胞。
细胞融合技术： B 淋巴细胞 骨髓瘤细胞杂交瘤细胞不分泌抗体 长命 分泌抗体短命分泌抗体长命Köhler 和Milstein, 19751984年Nobel 医学奖杂交瘤细胞的筛选：B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/⨯脾细胞骨髓瘤细胞/⨯骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活HAT 培养基筛选 H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶 DNA 内源性途径(主要途径)谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸 二氢叶酸还原酶 AH T 外源性途径(旁路途径)(H ypoxanthine g uznine p hospho r ibosyl t ransferase)次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (T hymidine k inase)B 淋巴细胞： HGPRT + ， TK +骨髓瘤细胞： HGPRT - ， TK - 存活 死亡外源性途径(旁路途径)培养上清中X 抗体的检测 克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X 抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养 获得大量单克隆抗体动物免疫细胞融合 混合细胞的HAT 筛选)分泌X 抗体 B 淋巴细胞骨髓瘤细胞 X 抗原 B 淋巴细胞 瘤的突变株 培养数天后细胞死亡 无限生长细胞分泌 X 抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c 杂交瘤技术操作流程图解实验过程目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞。
特定目标抗原动物免疫 脾脏中B 淋巴细胞 B 淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体一、抗体分泌细胞的分离以纯化抗原常规免疫小鼠，回收血清作为阳性对照。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
80%
筛选与培养
筛选出能产生所需抗体的杂交瘤 细胞，进行培养和扩增。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
抗体检测
采用酶联免疫吸附试验等方法 检测杂交瘤细胞产生的抗体。
阳性克隆筛选
筛选出能产生所需抗体的阳性 克隆。
克隆化
采用有限稀释法等方法对阳性 克隆进行克隆化，获得单克隆 抗体。
03
单克隆抗体的制备
细胞培养与单克隆抗体的产生
抗体鉴定
通过抗原-抗体反应、免疫电泳、质谱分析等方法，对单克隆抗体 的特异性、亲和力和分子量进行鉴定。
单克隆抗体的应用
01
02
03
04
生物医学研究
用于研究生物体内抗原、抗体 反应机制，以及疾病发生、发 展的机制。
诊断试剂
用于检测生物样本中的特定抗 原或抗体，辅助临床诊断。
靶向治疗
利用单克隆抗体与特定抗原的 结合能力，将药物或放射性物 质导向肿瘤等病变组织，提高 治疗效果和降低副作用。
杂交瘤技术的原理
杂交瘤技术的原理是利用细胞融合技术将免疫细胞与肿瘤细胞融合，形成 杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞既具有免疫细胞的抗体分泌能力，又具有肿瘤细胞的无限 增殖能力。
通过选择性培养基筛选出能够稳定分泌所需抗体的杂交瘤细胞，并进行克 隆化培养，最终获得高纯度、高亲和力的单克隆抗体。
02
杂交瘤的制备
商业前景与市场应用
诊断试剂
单克隆抗体可用于诊断试剂的研发来自提高检测的 特异性和灵敏度。生物治疗
单克隆抗体可用于肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾 病治疗等领域。
药物研发
单克隆抗体可用于药物靶点的发现和验证，加速 新药研发进程。
未来发展方向与展望
01
杂交瘤技术与单克隆抗体
人—鼠杂交瘤：融合方法根本与鼠—鼠杂交瘤一样。 亲本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本B细胞那么来 源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但 是，人—鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性能很不稳 定，多数情况下杂交瘤会很快失去抗体分泌能力。 人—人杂交瘤：可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系 与人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体。人源性融合 亲本细胞需具有较高的融合率、产生的杂交瘤核型稳 定并能产生一定量的具有特异性的抗体等特征。人— 人杂交瘤核型稳定，然而遗憾的是可供利用的人类骨 髓瘤细胞种类非常有限。
红霉素不敏感几乎到达100%，青霉素达 86%。
1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗 PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童的 7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世 。目前已经接种3亿剂，世界第一大单 个疫苗。
2003年 SARS病毒
SARS病毒属于冠状病毒 科，病毒粒子多呈圆形， 有囊膜，外周有冠状排列 的纤突，病毒直径在80120nm之间。 感染病毒的细胞线粒体肿 胀，局部线粒体外膜或嵴 溶解，病毒颗粒主要分布 在胞浆的内质网池、胞浆 空泡内和细胞外，多聚集 成堆。
科勒〔Kohler〕
米尔斯坦〔Milstein〕
12-2 单克隆抗体
〔一〕免疫学根底
1 抗原：
进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用 的外源物质。 包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各 种细胞等。 特点：构造表位性〔抗原决定簇 〕
免疫原特异性：〔抗原与抗体的反响〕抗原---刺激 免疫系统---发生免疫应答-----产生应答产物。
免疫系统：包括体液免疫和细胞免疫，参与的细 胞包括 B淋巴细胞——发育成浆细胞，分泌抗体，参与 体液免疫，脾脏可以分泌。 T淋巴细胞——发育成吞噬细胞，直接参与细胞 免疫，经胸腺分泌。不能产生抗体，帮助B淋巴 细胞产生抗体。
第四章 单克隆抗体杂交瘤技术课件
ห้องสมุดไป่ตู้
抗原决定簇 Antigenic determinant
图4-5 抗原决定簇 Fig. Antigenic determinant
•Antigenic determinant
是决定抗原性的特 殊化学基团。 •抗原分子越大，决 定簇的数目越多。 •如白喉类毒素有8 个抗原决定簇，流 感病毒有40多个抗 原决定簇。
体液免疫humoralimmunity细胞免疫cellularimmunity作用对象清除游离在寄主细胞外的抗原及其产生的有毒物质摧毁侵入到寄主细胞内的病毒胞内寄生菌或外来的组织团块癌变的细胞等作用方式通过效应b细胞浆细胞分泌抗体并与抗原发生特异性结合来清除抗原通过效应t细胞杀伤t细胞分泌穿孔素perforin使靶细胞溶解死亡2体液免疫与细胞免疫的区别与关系体液免疫与细胞免疫的区别鼻粘膜细胞上有很多微细绒毛因此大大增大了药物吸收的有效面积粘膜细胞下有着丰富的血管和淋巴管药物通过粘膜吸收后可以直接进入体循环减少了药物发挥功效的时间
由于一个抗原有多各决定簇，所以用抗原免疫 动物后获得的免疫血清均为多克隆抗体。
有时抗原上某些决定簇是很强的免疫反应触发 剂，使同一抗原上其他决定簇可能引发更强的 免疫反应，所以每次制备的多克隆抗体效价各 不相同;
前一次制备的多克隆抗体对某一决定簇的抗体 含量高，下次制备的真对该决定簇的抗体又可 能较低。
McAb具专一性、誉为 “生物导弹”。
McAb--顾名思义与“多克隆抗体”相对而 言.
多克隆抗体（polyclonal antibody）:由同一 抗原诱导而产生的针对多个不同抗原决定 簇的抗体即称为多克隆抗体。
动物机体一生会接触到许多种抗原物质， 同时一个抗原分子表面也会有几个抗原决 定簇。每一个抗原决定簇都会使机体产生 一种特异性的抗体。
抗原决定簇 Antigenic determinant
图4-5 抗原决定簇 Fig. Antigenic determinant
•Antigenic determinant
是决定抗原性的特 殊化学基团。 •抗原分子越大，决 定簇的数目越多。 •如白喉类毒素有8 个抗原决定簇，流 感病毒有40多个抗 原决定簇。
体液免疫humoralimmunity细胞免疫cellularimmunity作用对象清除游离在寄主细胞外的抗原及其产生的有毒物质摧毁侵入到寄主细胞内的病毒胞内寄生菌或外来的组织团块癌变的细胞等作用方式通过效应b细胞浆细胞分泌抗体并与抗原发生特异性结合来清除抗原通过效应t细胞杀伤t细胞分泌穿孔素perforin使靶细胞溶解死亡2体液免疫与细胞免疫的区别与关系体液免疫与细胞免疫的区别鼻粘膜细胞上有很多微细绒毛因此大大增大了药物吸收的有效面积粘膜细胞下有着丰富的血管和淋巴管药物通过粘膜吸收后可以直接进入体循环减少了药物发挥功效的时间
由于一个抗原有多各决定簇，所以用抗原免疫 动物后获得的免疫血清均为多克隆抗体。
有时抗原上某些决定簇是很强的免疫反应触发 剂，使同一抗原上其他决定簇可能引发更强的 免疫反应，所以每次制备的多克隆抗体效价各 不相同;
前一次制备的多克隆抗体对某一决定簇的抗体 含量高，下次制备的真对该决定簇的抗体又可 能较低。
McAb具专一性、誉为 “生物导弹”。
McAb--顾名思义与“多克隆抗体”相对而 言.
多克隆抗体（polyclonal antibody）:由同一 抗原诱导而产生的针对多个不同抗原决定 簇的抗体即称为多克隆抗体。
动物机体一生会接触到许多种抗原物质， 同时一个抗原分子表面也会有几个抗原决 定簇。每一个抗原决定簇都会使机体产生 一种特异性的抗体。
单克隆抗体的制备和应用PPT课件
McAb的纯化
➢盐析沉淀 ➢亲和层析 ➢离子交换层析
McAb的鉴定
➢Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 ➢特异性测定：抗原类似物的交叉反应 ➢效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 ➢表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑 制法，相加指数法及微机集群分析 ➢亲和性测定：测定亲和常数K ➢杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色 体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 ➢McAb靶抗原分子量：常用western blot
流程
培养液
➢RPM1640培养液 ➢DMEMPEG是最常用的细胞融合 剂 ➢ 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使 细胞膜易打开而有助于细胞融合 ➢ 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子 量的PEG，其纯度与毒性有所不同
HGPRT酶与TK酶
细胞冷冻的意义
➢防止污染 ➢避免染色体丢失 ➢防止非分泌细胞的过度生长 ➢防止细胞密度过高而死亡
第二节 单克隆抗体制备
培养骨髓瘤细胞
➢选择对数生长期的细胞进行传代培养 ➢细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 ➢避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 ➢注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃ 或液氮及干冰中
➢动物接种 每次用BALB/c或F1代小鼠，5-10 ╳105/只
免疫小鼠
➢ 细胞性抗原：1-2 × 107/只，不加佐剂，2-3周重复一次
➢ 可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3-6周 ➢ 100-200微克抗原，融合前3天，加强免疫
腹腔注射法
高滴度腹水
➢前5天进行,预先腹腔注射pristane ➢1~5×106细胞 ➢1~3w形成腹水
。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
需，氨基碟呤是一种叶酸拮抗物，它可阻断细胞内DNA生物
合成的主要途径。
此时若培养液中含有核苷酸合成的中间产物次黄嘌呤和胸腺 嘧啶，则细胞的DNA合成可通过另一条替代途径进行，即在 HGPRT和 TK（thymidine ）的催化下，利用外源 性的次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成核苷酸。若缺乏其中一种酶， 该合成途径被阻断。
抗原的初次免疫能使机体产生多价的低亲和力的lgM。 随着相同抗原的反复免疫，所产生的免疫球蛋白类型多 由lgM转为IgG，该种免疫球蛋白的亲和力及在血清中的 滴度会随着免疫次数的增多而增强。
10.3.2 动物选择与免疫
细胞融合
单抗Ig类型鉴定
HAT选择培养
阳性克隆的扩增与冻存
单克隆抗体的鉴定
筛选阳性克隆
2次亚克隆
单克隆抗体的生产纯化
克隆化培养
再鉴定
单克隆抗体的生物学功能研究
10.2 杂交瘤技术所需的主要物品
主要仪器设备
超净工作台、CO2恒温培养箱、倒置显微镜、离心机、 水浴恒温装置、冰箱、细胞混匀器、液氮罐、酶标测定 仪、荧光显微镜或流式细胞仪等。
10.1 杂交瘤技术的基本原理
根据Burnet的抗体选择学说，一个B淋巴细胞只能产生一种针对它 能够识别的特异性抗原决定簇的抗体，从一株克隆系产生的性质相 同的均一抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb），具 有完全相同的分子结构和生物学特性； 但这种具有分泌功能的B淋巴细胞难以在体外长期存活。 利用细胞融合技术，将上述B淋巴细胞与在体外能长期增殖的骨髓 瘤细胞进行融合，经过选择培养获取的杂交细胞称为杂交瘤细胞 （Hybridoma）。 该细胞既有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的功能，又具有骨髓瘤 细胞无限增殖的能力，应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
10.1.1 融合用骨髓瘤细胞
用于融合的骨髓瘤细胞大多能耐受抑制细胞代谢的毒性药物 8- 氮鸟嘌呤，是一种缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT）
的遗传缺陷型肿瘤细胞,在HAT选择培养液中不能生长。
免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后的 细胞类型
未发生融合骨髓瘤细胞及其同核融合体在HAT 培养液中， 其 DNA合成的主要途径被 A阻断后，由于缺乏HGPRT 而不能利用培养液中的H，虽TK可利用T，但不能完成 完整的DNA合成过程。 未发生融合的脾细胞及其同核融合体：培养液中不能长 期生长，7天左右即死亡
脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞，既 从脾细胞获得了HGPRT和 TK，从而利用培养液中的H 和T合成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力， 因此能在HAT选择培养液中生存下来。
抗原免疫小鼠
血清抗体效价测定
培养SP2/0
抗原位点竞争抑制试验
取小鼠脾细胞
收集SP2/0
Western blot 杂交瘤核型分析
杂交瘤技术的定义和起源
1. 定义：一般是指B淋巴细胞杂交瘤技术。即采用细胞融合技术 将免疫脾脏细胞与同系动物的骨髓瘤细胞进行杂交，通过筛选获 取分泌预定特异性抗体杂种细胞的实验技术。 2. 1975年 Kohler和 Milstein两位学者在细胞融合技术的基础上创 建了这一技术,体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞 （SRBC）免疫的同系小鼠脾细胞融合，建立了能分泌抗SRBC单 克隆抗体(mAb) 的杂交瘤细胞株，并指出其可在体外持续培养， 开创了抗体制备及使用的新纪元。 3. 杂交瘤技术是一项周期长、连续性强的实验技术系统。主要包 括动物免疫、骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的准备、细胞融合、阳性 杂交瘤的筛选、克隆化培养以及单克隆抗体的制备、纯化、鉴定 等系列实验。
10.3 杂交瘤细胞的建株
动物免疫
免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合
HAT选择培养
阳性杂交瘤筛选
克隆化培养
10.3.1 免疫抗原
抗原物质主要分为可溶性抗原和颗粒性抗原。 可溶性抗原包括蛋白质、碳水化合物和核酸等。常与福 氏佐剂合用以增强免疫原性。
颗粒性抗原包括完整的细胞、病毒和细菌，由于它们具 有较强的免疫原性，不需加用免疫佐剂。
融合用的小鼠骨髓瘤细胞株有NS-1、SP2/0和X63等。
Байду номын сангаас
HAT代表次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基碟呤
（aminopterin，A）和胸腺嘧啶（thymidine, T）三种物质。
10.1.2 HAT选择性培养
肿瘤细胞的DNA生物合成有两条途径，一是生物合成的主要
途径，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进而合 成DNA。在核酸合成过程中，叶酸衍生物为合成核苷酸所必
其它主要器械
培养器皿及其它 96 、24 孔培养板、培养瓶、离心管、平 皿、保温杯、培养液过滤装置、不锈钢网及手术剪刀、 镊子等。
主要试剂
1） 牛血清： 实验前必须对不同来源及批号的血清进行仔细的筛选检查，筛选 出能支持单细胞生长或使细胞迅速增殖的胎牛或新生小牛血清；。 购买来的牛血清，使用前最好进行灭活处理。 2）培养基 DMEM、RPMI 1640 及无血清培养基等。 DMEM有高糖（4500mg／L）及低糖（1000mg／L）之分。 3）HT及A母液（x100） ； 4）HAT及HT培养液 5）聚乙二醇（PEG）溶液 ；6）8-氮鸟嘌呤溶液 7）福氏佐剂 福氏佐剂分福氏完全佐剂（complete Freund’adjuvant,CFA） 和福氏不完全佐剂（incomplete Frend’adjuvant,IFA）
杂交瘤技术
1975年8月Kohler GE和 Milstein C第一次报道了 单克隆抗体技术，后不断推广、完善， 1984年获得Nobel医学生理学奖。
单克隆抗体技术不仅在免疫学成为重要的常规技术， 而且在其它生命学科，如细胞生物学、遗传学、微 生物学、生物化学、肿瘤学等领域广泛应用； 目前已不局限于科学研究领域，单克隆抗体所引起 的诊断学内的革命， 在临床治疗学上的意义和其它经济领域内所产生的 作用，也将愈来愈显著。