抗肿瘤药物的筛选方法

2. 肿瘤的治疗方法
外科手术治疗 放射线治疗 化学药物治疗
3. 常用的化疗药物
❖ 烷化剂
环磷酰胺、异环磷酰胺
❖ 抗代谢药物
甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷
❖ 抗肿瘤抗生素
柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素、多柔比星
❖ 铂类化合物
顺铂、卡铂、奥沙利铂
❖ 抗肿瘤植物药
长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇
❖ 激素类 ❖ 血管新生抑制剂
肿瘤移植和给药方法：
1）无菌操作 2）接种部位：背部 3）细胞悬液的制备及接种
细胞悬液浓度1x108/mL，接种0.1mL到背部。7天左 右，瘤块达到50 mm3体积即为造模成功，开始给药。
4）给药时间：根据药效确定，一般12-60天。
阳性药
5-Fu （5-氟尿嘧啶） ADM （阿霉素） Taxol（紫杉醇） CTX（环磷酰胺）
方法：裂解肿瘤细胞，消化蛋白，提取ＤＮＡ，上
凝胶电泳，ＥＢ染色后，ＵＶ灯下观察。
结果：凋亡细胞显示ＤＮＡ梯带。
CTL DRUG1 DRUG2 MARKER
３）PI/Annexin-Ｖ-FITC双染色分析
原理：调亡细胞磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞
表面，PS结合标记荧光素FITC的Annexin-V 但细胞膜仍然完整，荧光染料ＰＩ不能进 入，而调亡晚期的细胞可同时受Annexin-V 和PI的双标记。
抗肿瘤谱
❖ Taxol
（卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、 淋巴瘤）
❖ 5-Fu
（乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、膀 胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤）
❖ ADM
（ 乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮肤癌）
沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用
(Carcinogenesis, 2013, 34:1331)
❖ 美国国立癌症研究所（NCI）从1955年开始从天然 产物中筛选抗肿瘤药物。
❖ 目前世界上被批准广泛使用的抗肿瘤药物中,５０％ 以上来源于天然产物。
二、整体动物水平的筛选
１．非实体瘤动物模型
肿瘤名称 代号
艾氏 腹水瘤
肝癌 腹水瘤
ECA HepA
白血病
P388
宿主
肿瘤名称 代号
KM小鼠 BALB/c小鼠
方法：肿瘤细胞同时加入Annexin-Ｖ和ＰＩ染色，
用流式细胞仪分析。
PI
正常细胞
Annexin-V (-)
PI
(-)
晚期凋亡细胞
Annexin-V (+)
PI
(+)
早期凋亡细胞
Annexin-V (+)
PI
(-)
Annexin-V
PI/AnnexinV-FITC 双染激光共聚焦分析结果
PI红色荧光 细胞核 AnnexinV-FITC 绿色荧光 细胞膜
对照组 凋亡细胞
对照组
正常细胞胞 质散在内质 网、核膜清 楚、染色质 均匀、核仁 明显。
凋亡细胞染色质浓 缩、致密，沿核分 布形成新月体状， 有凋亡小体出现。
线粒体肿胀
坏死
凋亡细胞胞质出 现明显的线粒体 肿胀。
坏死细胞细胞膜不 完整，核膜破裂， 染色质呈虫蚀状溶 解。
B）DNA形态观察（Hoeschst333258）
细胞形态向粒细胞方向分化。
结果：显微镜计数NBT还原阳性细胞，计算诱导分化率
对照组
药物处理组
３. 诱导肿瘤细胞凋亡实验
Ａ）形态学观察（透射电镜）
原理：细胞超微结构观察 方法：药物处理后，收集细胞，4%戊二醛固定2
h以上，PBS清洗，1%俄酸固定1 h,酒精丙 酮梯度脱水，环氧树脂包埋，切片做成铜网， 经醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜下观察 拍照。
艾氏癌 实体型
ECS
KM小鼠
肉瘤
BALB/c小鼠
S180
KM小鼠
BALB/c小鼠
肝癌 实体型 肺癌
瓦克癌 肉瘤
HepS KM小鼠
黑色素瘤 B16
BALB/c小鼠
Lewis C57BL/6小鼠 结肠癌
C26
BALB/c小鼠
W256 Wistar大鼠 结肠癌
C38
C57BL/6小鼠 BALB/c小鼠 BALB/c小鼠
2）细胞传代
贴壁细胞生长3-5天，80%融合度。用胰酶消化 1-3 min后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养 液中。
3）细胞计数
细胞计数板
5）细胞接种
3000-10000细胞接种在96孔板，贴壁 24小时，或对数生长期
6）加药处理72 h（指定时间点） 7）MTT溶液（5 mg/ml） ，孵育2-4小时 8）弃去培养液，加入DMSO溶解生成的
BALB/c小鼠
常用小鼠、大鼠实体瘤动物模型表（细胞株及动物）
肿瘤移植方法：
1）无菌操作 2）接种部位：右前肢腋下 3）癌块的制备及接种
接种7~10天小鼠处死，酒精消毒，切开皮肤取 出肿瘤块，置于生理盐水中，冰块上保存。剪碎瘤 块成2-3 mm3的小块或组织块匀浆成细胞悬液，接 种到右前肢腋下。5天左右，小鼠出现瘤块即为造模 成功。
原理： Hoeschst333258与DNA特异性结
合发出蓝色荧光
方法：肿瘤细胞用Hoeschst333258染色
后，在荧光显微镜下观察
结果：活细胞成均匀的淡荧光，调亡细胞
核或细胞质内可见强荧光的颗粒状 物质。
对照组
药物处理组
C）染色体ＤＮＡ断裂测定
原理：凋亡细胞内源性核酸酶激活，ＤＮＡ链被切
割成200 bp不同倍数的片段，将这些片断 进行电泳，可观察到ＤＮＡ梯带
（7天死亡率≥20%或20%动物存活超过4周，实验失败 对照组存活时间14-20天）
数据Байду номын сангаас理： 生命延长率(%)＝ 治疗组存活天数－对照组存活天数
x100% 对照组存活天数
非腹腔给药生命延长率>50% 腹腔给药>75%
２. 实体瘤动物模型
1）动物移植性肿瘤
国内外推荐模型
肿瘤名称 代号 宿主
肿瘤名称 代号 宿主
SRB是粉红色的氨基甲氧杂蒽类化合物，是蛋白 结合染料，与蛋白质的碱性氨基酸结合后呈粉红色，用 酶标仪测定其吸光度。
细胞中的蛋白含量与吸光度成正比，因此可根据 光密度OD值推测出活细胞的数目和活性。
方法： 类似于ＭＴＴ法，10-20%三氯乙酸固定1 h
后，加入0.5-1%ＳＲＢ染色30 min，洗去 染料，空气干燥后，加入10 mM Tris 溶解 后，5４0 nm测定光密度
*腹水应为白色浓稠液体，若为黄色或红色应弃去
给药及药效评价：
动物分组：随机分五组（溶剂对照组、阳性药组、高、中、低 给药组）；每组8-10只。
药品制备：药品溶解生理盐水或PBS等缓冲盐溶液 给药方式：连续给药；1-2次/天;（ig,ip,iv）14天以上 评价指标：观察记录荷瘤小鼠的存活天数（30天）
选择性对照药
推荐剂量：1-20 mg/kg 给药方式：与测试药物相同;常隔天给药
药效评价：
评价指标：记录小鼠的体重变化。结束治疗后，处
死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1 g左
右）。取脾脏称重，并测定脾细
胞数目。
数据处理：
抑瘤率(%)＝对照组肿瘤体积－治疗组肿瘤体积
对照组肿瘤体积
x100%
抑瘤率>30% 认为有效
7天后对照组20%小鼠肿瘤小于400 mg或大于2g，实验失败
给药及药效评价：
给药方式：连续给药；1-2次/天;（ig,ip,iv）10-12天
评价指标：记录小鼠的体重变化。12天后，处死小
鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1 g左右）。
取脾脏和胸腺称重，并测定脾细胞数目
数据处理：
抑瘤率(%)＝
对照组瘤重－治疗组瘤重
MTT 原理示意图
甲臜生成量正比于活细胞数 采用比色法（570 nm）测定甲臜生成量
实验方法
1）细胞培养 培养液：RPMI 1640、DMEM、MEM、
M199、McCoy’s5A等
血清： FBS、NBS、 抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素、
新生霉素等 胰酶： Trypsin-EDTA 、Collagenase 缓冲液： PBS、HBSS等 生长因子：EGF、B-27、N-2等
抗肿瘤药物筛选
张冬梅
一、导论 二、整体动物水平的筛选 三、细胞水平的筛选 四、酶水平的筛选 五、展望
一、导论
1. 肿瘤发病率和死亡率
全球每年癌症 新发病例都在1200 万以上，因癌症死
其他 肺病
亡人数达760多万， 消化系统病 到2010年底全球肿
瘤病人总数已逾
5500万人 (WHO)。
脑血管病
三、细胞水平的筛选
1. 抑制肿瘤细胞增殖实验 2. 诱导肿瘤细胞分化实验 3. 诱导肿瘤细胞凋亡实验 4. 抗肿瘤血管生成实验 5. 肿瘤多药耐药性逆转实验 6. 抗肿瘤侵袭和转移实验 7. 诱导肿瘤细胞自噬实验
细胞株的选择
１. 抑制肿瘤细胞增殖实验
A) 噻唑兰实验（MTT）
原理：
活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的MTT，生 成蓝紫色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可 以用酶标仪在570 nm 处进行测定。甲臜生成量与活细胞 数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
KM小鼠 BALB/c小鼠
肉瘤 腹水型
白血病
S180A L1210
KM小鼠
白血病
P615
BALB/c小鼠
宿主
KM小鼠 BALB/c小鼠 DBA小鼠
615小鼠
常用小鼠腹水瘤动物模型表（细胞株及动物） 国内外推荐模型
肿瘤移植方法：
1）无菌操作 2）接种部位：腹腔 3）癌细胞悬液的制备及接种
接种7~10天小鼠处死，酒精消毒，穿过腹 部肌肉吸取腹水2~4 mL*，置冰块上保存。细胞 计数后，PBS稀释制备1x107/0.1 mL细胞浓度悬 液，每只小鼠注射0.2 mL 肿瘤细胞悬液注射到 腹腔。5天左右，小鼠出现腹水即为造模成功。
死亡原因 死亡率 占总死亡 (1/10万) 人数百分率
恶性肿瘤 135 22%
脑血管病 111 20%
心脏病 96 18%
呼吸系统病 72
15%
损伤和中毒 31
5%
消化系统病 17
5%
糖尿病
17
1%
２００9年中国常见恶性肿瘤的死亡率
我国居民常见 癌症死亡率:
胃癌列肿瘤 死亡率首位;
其次肝癌、 肺癌、食管癌、 结直肠癌等。
对照组活细胞数
X100%
２. 诱导肿瘤细胞分化实验
NBT还原法
原理：硝基蓝四氮唑兰(NBT) 还原法测定细胞株分化
诱导。正常的中性粒细胞内磷酸戊糖支路活跃, 细胞内还原型辅酶含量增加, 将可溶性NBT还原 为不溶性蓝紫色颗粒, 而沉积于细胞浆内。
方法：HL-60 细胞株是筛选分化诱导剂的,药物作用后,
心脏病
肿瘤 25%
2005年全球常见疾病死亡率
2009年中国居民主要疾病死亡率及死亡原因构成
中国每年新增肿瘤病人
(中国卫生年鉴)
200万人，死亡130170多万人左右，目前 全国肿瘤患者总数约 450万人，并以每年3% 的速度递增。肿瘤已经 成为中国公民的头号杀 手，每年因恶性肿瘤而 死亡的人口占到总死亡 率的22%。
结果处理：同ＭＴＴ法
Ｃ）细胞排染法（酞酚蓝） 原理：
细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正 常细胞排染，而死亡细胞染成蓝色。
伊红、苯胺黑 等染料
方法：
细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀，用细胞计数板， 分别计数活细胞（未染色）和死细胞数目（蓝色）
结果：
细胞死亡率= 对照组活细胞数－给药组活细胞数
（%）
甲臜 9）酶标仪测定OD值
结果处理：
肿瘤细胞存活率（%）=
OD实验 OD对照
X 100%
肿瘤细胞生长 抑制率（%）
=
（ OD对照-OD实验） OD对照
X 100%
根据生长抑制的量效曲线求出IC50 值
B
A
问题：根据上图中细胞生长抑制曲线， 判断化合物A和B哪一个具有较好的 肿瘤生长抑制作用？
Ｂ）磺酰罗丹明B （SRB）实验 原理：
贝伐珠单抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼
化疗药物的主要不良反应
骨髓抑制（血细胞减少） 胃肠道反应（恶心、呕吐、食欲不振等） 全身反应（脱发、发热、皮疹） 对各器官影响 （心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性） 泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性肾病） 局部静脉炎 致畸、致突变、致癌
4. 天然产物与抗肿瘤药物
❖ 天然产物在新药及新药先导化合物的发现中起着不 可替代的作用，是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化 合物的重要来源。
对照组 PI
药物处理组
Annexin-V-FITC
４. 抗肿瘤血管生成实验
肿瘤发生、生长和转移与新生血管形成密切相关， 当肿瘤直径超过2 mm时,直接由微环境提供的营养就 不能满足其生长需要,此时肿瘤的生长依赖于新生血管 运送营养物质。
肿瘤血管生成抑制剂能抑制血管生成,阻止肿瘤生长 和转移，在治疗肿瘤中具有高效、广普、副作用小、 不易产生耐药性等优点。
对照组瘤重
x100%
抑瘤率>30% 认为有效
２）人癌异种移植模型
细胞：人源肝癌，胃癌，肺癌，结肠癌等肿瘤细胞 动物： 裸鼠 （nude mice）
T淋巴功能缺陷 先天性无胸腺小鼠
11号染色体上隐性 突变裸基因（nu）
特点： 1）裸体，行似无毛； 2）不能执行正常T细胞功能，免疫力低下 3）B细胞功能正常，NK细胞活性高