分子生物学实验

时间节点：3月12日
序号 实验内容 并行实验 1（上） pET28a+eGFP连接产物转化BL21(DE3) 2 pFastBacHTA质粒的抽提 及酶切和纯化 3（下） 构建重组质粒pFastBacHTA-eGFP：载体和克隆片段的连接 4 pFastBacHTA+eGFP连接产物转化TG1 5 13日下午挑斑接种培养
4.1目的基因DNA与载体的连接（一组一份）
连接反应：
试剂 pET-28a/EcoRI +HindIII PCR/EcoRI +HindIII 连接酶Solution I 总体积 • 室温，连接过夜。
用量 2ul 8ul 10ul 20ul
4.2 BL21(DE3)感受态细胞的制备（1人一份）
1. 实验目的： • 掌握常规的化学法制备大肠杆菌感受态细胞的方法
时间节点：3月19日
序号 实验内容 并行实验 1（上午） SDS-PAGE分析重组蛋白的表达 2（下午） Western Blot鉴定重组蛋白 3 20日蓝白斑筛选重组克隆：挑斑接种培养
时间节点：3月25日
1. 重组Bacmid的抽提与鉴定
时间节点：3月26日
1. Bacmid转染sf9细胞，制备重组病毒 2. 慢病毒载体转染293T细胞制备慢病毒 3. 3日后，即3月29日通过荧光显微镜观察细胞状态及发荧光情况。
五、BL21（DE3）感受态细胞的转化(3.12)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BL21（DE3）培养物 LB培养基 100 mM CaCl2 Kan平板 Kan 质粒抽提试剂盒 内切酶 PCR试剂
5.1 BL21(DE3)感受态细胞的转化
• 取上次实验连接产物5ul加入到BL21(DE3)感受态细胞（100-200ul）中， • 轻弹管壁，混匀细胞和连接产物； • • • • • • • • • 冰上放置30min； 然后将感受态细胞置于恒温金属块中，42 C 热激BL21（DE3）感受态细胞90 sec； 取出感受态细胞冰浴5min； 加n； 5000rpm，离心5min；弃去上清1mL 余下100 ul菌液重悬，涂Kan平板 平板放入37 C生化培养箱中，正置培养30min后，倒置培养过夜（16hr）。 次日取出，挑斑接种LB/Kan液体培养基培养（ 37 C ，220rpm ）。 每人限挑一个斑接种（每组最多4斑）
第2周
第3周
第4周
时间节点：3月11日
序号 实验内容 1（上午） 总RNA的抽提 2 RT-PCR克隆 3（下午） PCR产物的纯化 4 5 6 并行实验 pET28a质粒的制备
PCR产物的酶切和回收 pET28a质粒的酶切回收 构建重组质粒pET28a-eGFP：载体和克隆片段的连接 BL21(DE3) 感受态细胞制备
2.3 pET28a质粒的制备(一组一份)
1. 目的：学习质粒DNA的抽提方法 2. 操作步骤
实验步骤
1. 硅膜法抽提质粒DNA
① ② ③
取3 ml TG1挑斑培养过夜的菌液，12,000×g,离心1 min，弃尽上清。 加250 μl S1 重悬细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。 加250 μl S2，温和并充分地上下颠倒数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此 步骤不宜超过5 min。
二、 RT-PCR克隆目的基因
1. 2. 3. 4. 逆转录合成第一链cDNA； PCR扩增目的基因； PCR产物的纯化； 制备目的DNA克隆片段
2.1 逆转录合成第一链cDNA（一组一份）
建议：大家使用3L总RNA样品
2.2 PCR扩增目的基因（一人一份）
1、PCR反应体系
试剂 浓度 用量
分子生物学实验安排
实验项目
1. E.coli重组表达GFP； 2. 利用杆状病毒在昆虫细胞中表达GFP； 3. 组装慢病毒表达目的蛋白。
三周（周六、周日）
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 总RNA的抽提：从病毒感染的sf9中抽提总RNA RT-PCR：以总RNA为模板克隆eGFP基因 原核表达载体的构建：构建pET28a-GFP 感受态细胞的制备：制备BL21（DE3）感受态细胞 原核诱导表达GFP： 构建克隆GFP的重组杆状病毒：在sf9细胞中表达GFP。 构建克隆RFP的慢病毒： GFP的表达与鉴定
• 12,000 g， 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
3. RNA沉淀的清洗
• 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入DEPC配制的75％乙醇1ml（切勿触及 沉淀）； • 轻轻上下颠倒数次，12,000 g， 4℃离心5分钟后小心弃去上清；
4. RNA的溶解
• 室温自然晾干沉淀2～5分钟 • 加入20l的RNase-free水溶解沉淀 • 必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后-80℃保存，或暂时 于冰上保存。 • 取10 l总RNA与10 x Loading Buffer混合与1% agarose gel凝胶电泳。 • 100V，电泳20min，拍照记录。 • 剩余的RNA样品用于RT-PCR
洗涤一次。弃滤液。
⑧ 将制备管置回2 ml 离心管中，12,000×g 离心1 min。
⑨ 取出制备管移入新的1.5 ml 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管
膜中央加30 μl 预热的去离子水，室温静置1 min。12,000×g 离心1
min。
⑩ 洗脱下来的溶液即质粒DNA样品。
11 取5 μl DNA样品1%Agarose凝胶电泳检测。
H2O
总体积
41l 100l
H2O
总体积
41l 100l
• 混匀上述反应体系，37C水浴60min； • 酶切产物的纯化：同PCR产物的纯化，最后用25l水洗脱。
四、 pET28a-GFP表达载体的构建（一组一份）
1. 目的：学习利用逆转录PCR克隆目的基因以及克隆基因重组表达 载体的构建； 2. 材料： • pET-28a/ EcoRI + HindIII： • 内切酶：EcoRI + HindIII • 连接酶：Solution I • Kan平板： • DNA酶切/PCR产物纯化试剂盒：
离心5min；
• 弃去上清，并倒置于吸水纸上1分钟；
• 加入1 ml的RNAiso Plus，反复振荡数次使细胞完全裂解； • 可用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 • 室温静置5分钟。
2. Total RNA的提取
• 向匀浆裂解液中加入200L氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖； • 用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）； • 待溶液充分乳化（无分层现象）后，再室温静置5分钟。
2.4 PCR产物的纯化（一组一份）
此实验方法针对DNA样品中75bp以上的DNA进行纯化，去除小分子DNA、寡核
苷酸链、单核苷酸、盐离子、蛋白质等。可用于：
① PCR产物的纯化 ② DNA酶切产物的纯化 其原理：硅柱法分离DNA
硅柱吸附法
1. 合并PCR产物至150 μl。 注：若PCR产物不足150 μl，用水补足。 2. 在PCR产物中，加入450 μl的 PCR-A。 3. 混合均匀后转移到制备管中，将制备管置于2 ml 离心管，12,000×g 离心1 min， 弃滤液。 4. 将制备管置回2 ml 离心管，加700 μl W2，10,000rpm 离心1 min，弃滤液。 5. 将制备管置回 2 ml 离心管，加 400 μl W2，10,000rpm离心1 min； 6. 将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管中，在制备管膜中央加 60 μl ddH2O (65℃预 热)，室温静置1 min。 7. 10,000rpm 离心1 min 洗脱DNA。即离心下来的溶液即为纯化的PCR样品。 8. 每组取5 μl样品1%Agarose凝胶电泳。
④
⑤
加350 μl S3，温和并充分地上下颠倒数次，12,000×g 离心5 min。
吸取步骤4 中离心产生的上清并转移到制备管中（之前置于2 ml 离心管），12,000×g离心1 min， 弃滤液。
⑥ ⑦
将制备管置回离心管，加500 μl W1，12,000×g 离心1 min，弃滤液。 将制备管置回离心管，加700 μl W2，12,000×g 离心1 min，弃滤液；以同样的方法再用700 μl W2
试剂安排
• 69人上课 • 按照4人一组进行分组，共17组 • 教室：512；517. • 每组一套试剂和工具
一、总RNA的抽提（一人一份,3.26）
1. 目的：学习总RNA的抽提以及RNA的操作。 2. 试剂： • 细胞：每组一瓶 • Trizol：RNAiso • 氯仿： • 异丙醇 • DEPC水 • 70%的乙醇：DEPC水配制 • DNase/RNase-Free Tips and Tubes • 逆转录酶： • 引物 • DEPC水 • dNTPmix
实验注意事项
1. 接种培养示范； 2. 每组一管5ml LB液体培养基； 3. 除离心和培养外，所有操作均在超净工作台完成。
2、实验步骤
1. 于超净台中，按1%（V/V）的接种量，即取50 L大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种于5mL LB液体培养基中。
（一组接种一管）;
2. 3. 4. 37℃摇床培养1.5～2.0 h至OD600为0.4左右，此时大肠杆菌培养液呈现出一种“雾”状。 将装有大肠杆菌培养液的试管置于冰水浴中预冷10分钟。 于超净台中，取1.5mL大肠杆菌BL21(DE3)菌液至1.5mL Eppendorf管中，4℃，4,000rpm，离心5min。（每 人做一份）； 5. 弃尽上清液，加入1ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，轻弹管壁重悬菌体沉淀，使之混匀，4℃恒温， 4000rpm离心5min。 6. 7. 8. 弃尽上清液，加入0.5ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，冰水浴中放置30min。4℃恒温，4000rpm离心5min。 弃上清液，将菌体沉淀用100L预冷的的100mmol/L CaCl2甘油溶液重新轻轻悬浮。 置4℃冰箱保存，次日（4-16hr内）使用。