分子生物学实验
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离心5min；
• 弃去上清，并倒置于吸水纸上1分钟；
• 加入1 ml的RNAiso Plus，反复振荡数次使细胞完全裂解； • 可用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 • 室温静置5分钟。
2. Total RNA的提取
• 向匀浆裂解液中加入200L氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖； • 用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）； • 待溶液充分乳化（无分层现象）后，再室温静置5分钟。
2.4 PCR产物的纯化（一组一份）
此实验方法针对DNA样品中75bp以上的DNA进行纯化，去除小分子DNA、寡核
苷酸链、单核苷酸、盐离子、蛋白质等。可用于：
① PCR产物的纯化 ② DNA酶切产物的纯化 其原理：硅柱法分离DNA
硅柱吸附法
1. 合并PCR产物至150 μl。 注：若PCR产物不足150 μl，用水补足。 2. 在PCR产物中，加入450 μl的 PCR-A。 3. 混合均匀后转移到制备管中，将制备管置于2 ml 离心管，12,000×g 离心1 min， 弃滤液。 4. 将制备管置回2 ml 离心管，加700 μl W2，10,000rpm 离心1 min，弃滤液。 5. 将制备管置回 2 ml 离心管，加 400 μl W2，10,000rpm离心1 min； 6. 将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管中，在制备管膜中央加 60 μl ddH2O (65℃预 热)，室温静置1 min。 7. 10,000rpm 离心1 min 洗脱DNA。即离心下来的溶液即为纯化的PCR样品。 8. 每组取5 μl样品1%Agarose凝胶电泳。
洗涤一次。弃滤液。
⑧ 将制备管置回2 ml 离心管中，12,000×g 离心1 min。
⑨ 取出制备管移入新的1.5 ml 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管
膜中央加30 μl 预热的去离子水，室温静置1 min。12,000×g 离心1
min。
⑩ 洗脱下来的溶液即质粒DNA样品。
11 取5 μl DNA样品1%Agarose凝胶电泳检测。
时间节点：3月19日
序号 实验内容 并行实验 1（上午） SDS-PAGE分析重组蛋白的表达 2（下午） Western Blot鉴定重组蛋白 3 20日蓝白斑筛选重组克隆：挑斑接种培养
时间节点：3月25日
1. 重组Bacmid的抽提与鉴定
时间节点：3月26日
1. Bacmid转染sf9细胞，制备重组病毒 2. 慢病毒载体转染293T细胞制备慢病毒 3. 3日后，即3月29日通过荧光显微镜观察细胞状态及发荧光情况。
4.1目的基因DNA与载体的连接（一组一份）
连接反应：
试剂 pET-28a/EcoRI +HindIII PCR/EcoRI +HindIII 连接酶Solution I 总体积 • 室温，连接过夜。
用量 2ul 8ul 10ul 20ul
4.2 BL21(DE3)感受态细胞的制备（1人一份）
1. 实验目的： • 掌握常规的化学法制备大肠杆菌感受态细胞的方法
H2O
总体积wenku.baidu.com
41l 100l
H2O
总体积
41l 100l
• 混匀上述反应体系，37C水浴60min； • 酶切产物的纯化：同PCR产物的纯化，最后用25l水洗脱。
四、 pET28a-GFP表达载体的构建（一组一份）
1. 目的：学习利用逆转录PCR克隆目的基因以及克隆基因重组表达 载体的构建； 2. 材料： • pET-28a/ EcoRI + HindIII： • 内切酶：EcoRI + HindIII • 连接酶：Solution I • Kan平板： • DNA酶切/PCR产物纯化试剂盒：
时间节点：3月12日
序号 实验内容 并行实验 1（上） pET28a+eGFP连接产物转化BL21(DE3) 2 pFastBacHTA质粒的抽提 及酶切和纯化 3（下） 构建重组质粒pFastBacHTA-eGFP：载体和克隆片段的连接 4 pFastBacHTA+eGFP连接产物转化TG1 5 13日下午挑斑接种培养
五、BL21（DE3）感受态细胞的转化(3.12)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BL21（DE3）培养物 LB培养基 100 mM CaCl2 Kan平板 Kan 质粒抽提试剂盒 内切酶 PCR试剂
5.1 BL21(DE3)感受态细胞的转化
• 取上次实验连接产物5ul加入到BL21(DE3)感受态细胞（100-200ul）中， • 轻弹管壁，混匀细胞和连接产物； • • • • • • • • • 冰上放置30min； 然后将感受态细胞置于恒温金属块中，42 C 热激BL21（DE3）感受态细胞90 sec； 取出感受态细胞冰浴5min； 加入1ml LB培养基，放入摇床中37 C ，220rpm培养45-60min； 5000rpm，离心5min；弃去上清1mL 余下100 ul菌液重悬，涂Kan平板 平板放入37 C生化培养箱中，正置培养30min后，倒置培养过夜（16hr）。 次日取出，挑斑接种LB/Kan液体培养基培养（ 37 C ，220rpm ）。 每人限挑一个斑接种（每组最多4斑）
④
⑤
加350 μl S3，温和并充分地上下颠倒数次，12,000×g 离心5 min。
吸取步骤4 中离心产生的上清并转移到制备管中（之前置于2 ml 离心管），12,000×g离心1 min， 弃滤液。
⑥ ⑦
将制备管置回离心管，加500 μl W1，12,000×g 离心1 min，弃滤液。 将制备管置回离心管，加700 μl W2，12,000×g 离心1 min，弃滤液；以同样的方法再用700 μl W2
实验注意事项
1. 接种培养示范； 2. 每组一管5ml LB液体培养基； 3. 除离心和培养外，所有操作均在超净工作台完成。
2、实验步骤
1. 于超净台中，按1%（V/V）的接种量，即取50 L大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种于5mL LB液体培养基中。
（一组接种一管）;
2. 3. 4. 37℃摇床培养1.5～2.0 h至OD600为0.4左右，此时大肠杆菌培养液呈现出一种“雾”状。 将装有大肠杆菌培养液的试管置于冰水浴中预冷10分钟。 于超净台中，取1.5mL大肠杆菌BL21(DE3)菌液至1.5mL Eppendorf管中，4℃，4,000rpm，离心5min。（每 人做一份）； 5. 弃尽上清液，加入1ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，轻弹管壁重悬菌体沉淀，使之混匀，4℃恒温， 4000rpm离心5min。 6. 7. 8. 弃尽上清液，加入0.5ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，冰水浴中放置30min。4℃恒温，4000rpm离心5min。 弃上清液，将菌体沉淀用100L预冷的的100mmol/L CaCl2甘油溶液重新轻轻悬浮。 置4℃冰箱保存，次日（4-16hr内）使用。
• 12,000 g， 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
3. RNA沉淀的清洗
• 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入DEPC配制的75％乙醇1ml（切勿触及 沉淀）； • 轻轻上下颠倒数次，12,000 g， 4℃离心5分钟后小心弃去上清；
4. RNA的溶解
• 室温自然晾干沉淀2～5分钟 • 加入20l的RNase-free水溶解沉淀 • 必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后-80℃保存，或暂时 于冰上保存。 • 取10 l总RNA与10 x Loading Buffer混合与1% agarose gel凝胶电泳。 • 100V，电泳20min，拍照记录。 • 剩余的RNA样品用于RT-PCR
试剂安排
• 69人上课 • 按照4人一组进行分组，共17组 • 教室：512；517. • 每组一套试剂和工具
一、总RNA的抽提（一人一份,3.26）
1. 目的：学习总RNA的抽提以及RNA的操作。 2. 试剂： • 细胞：每组一瓶 • Trizol：RNAiso • 氯仿： • 异丙醇 • DEPC水 • 70%的乙醇：DEPC水配制 • DNase/RNase-Free Tips and Tubes • 逆转录酶： • 引物 • DEPC水 • dNTPmix
2.3 pET28a质粒的制备(一组一份)
1. 目的：学习质粒DNA的抽提方法 2. 操作步骤
实验步骤
1. 硅膜法抽提质粒DNA
① ② ③
取3 ml TG1挑斑培养过夜的菌液，12,000×g,离心1 min，弃尽上清。 加250 μl S1 重悬细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。 加250 μl S2，温和并充分地上下颠倒数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此 步骤不宜超过5 min。
分子生物学实验安排
实验项目
1. E.coli重组表达GFP； 2. 利用杆状病毒在昆虫细胞中表达GFP； 3. 组装慢病毒表达目的蛋白。
三周（周六、周日）
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 总RNA的抽提：从病毒感染的sf9中抽提总RNA RT-PCR：以总RNA为模板克隆eGFP基因 原核表达载体的构建：构建pET28a-GFP 感受态细胞的制备：制备BL21（DE3）感受态细胞 原核诱导表达GFP： 构建克隆GFP的重组杆状病毒：在sf9细胞中表达GFP。 构建克隆RFP的慢病毒： GFP的表达与鉴定
操作注意事项：
1. 2. 3. 4. 全程戴一次性手套操作； 涉及RNA的操作时尽量不要开口说话； 涉及RNA的操作时尽量不要在四周走动； 取用试剂后及时封盖。
操作步骤
1. 细胞匀浆：感染病毒4天的sf9细胞 • 剧烈摇晃细胞瓶使细胞脱落下来；
• 每人取1ml细胞培养物于RNase和DNase Free的EP管中；1000rpm，4C
三、载体与目的DNA克隆片段的制备(一组一份)
1. 目的：利用双酶切PCR产物制备载体与目的DNA克隆片段 2. 材料： • QuickCut-EcoRI • QuickCut-HindIII • QuickCut-Buffer
双酶切体系：
试剂 载体 QuickCut-EcoRI QuickCut-HindIII 10 x QuickCut Buffer 用量 50l 2l 2l 5l 试剂 PCR纯化产物 QuickCut-EcoRI QuickCut-HindIII 10 x QuickCut Buffer 用量 50l 2l 2l 5l
• 12,000 g， 4℃离心15分钟。
• 从离心机中小心取出离心管（勿晃动），此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、 中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。 • 吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 • 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10分钟。
第2周
第3周
第4周
时间节点：3月11日
序号 实验内容 1（上午） 总RNA的抽提 2 RT-PCR克隆 3（下午） PCR产物的纯化 4 5 6 并行实验 pET28a质粒的制备
PCR产物的酶切和回收 pET28a质粒的酶切回收 构建重组质粒pET28a-eGFP：载体和克隆片段的连接 BL21(DE3) 感受态细胞制备
时间节点：3月18日
序号 实验内容 1（上午） 菌液PCR鉴定重组克隆 2 pET28a-eGFP的抽提 3（下午） 重组质粒的酶切鉴定 4 5 6 pET28a-eGFP双酶切 pFastBacHTA-eGFP转化DH10Bac 重组克隆诱导表达 并行实验 pFastBacHTA-eGFP的抽提 pFastBacHTA-eGFP双酶切
二、 RT-PCR克隆目的基因
1. 2. 3. 4. 逆转录合成第一链cDNA； PCR扩增目的基因； PCR产物的纯化； 制备目的DNA克隆片段
2.1 逆转录合成第一链cDNA（一组一份）
建议：大家使用3L总RNA样品
2.2 PCR扩增目的基因（一人一份）
1、PCR反应体系
试剂 浓度 用量
H2O 10 x PCR buffer d NTP mix
/ / 10mM
35 5 1
引物1 引物2 1st cDNA
Taq DNA酶 总体积
10M 10M
2 U/l
2 2 3 1 50
2. 充分混匀后用marker笔标记好，然后放入PCR仪中，按下列条 件进行反应： • 94 C, 5min • 94 C, 0.5min • 55 C, 30 sec 30次循环 • 72 C, 1min • 72 C, 10min • 4 C, 3. 取5 l PCR产物1% agarose gel电泳分析PCR：有或无？大小？
• 弃去上清，并倒置于吸水纸上1分钟；
• 加入1 ml的RNAiso Plus，反复振荡数次使细胞完全裂解； • 可用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 • 室温静置5分钟。
2. Total RNA的提取
• 向匀浆裂解液中加入200L氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖； • 用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）； • 待溶液充分乳化（无分层现象）后，再室温静置5分钟。
2.4 PCR产物的纯化（一组一份）
此实验方法针对DNA样品中75bp以上的DNA进行纯化，去除小分子DNA、寡核
苷酸链、单核苷酸、盐离子、蛋白质等。可用于：
① PCR产物的纯化 ② DNA酶切产物的纯化 其原理：硅柱法分离DNA
硅柱吸附法
1. 合并PCR产物至150 μl。 注：若PCR产物不足150 μl，用水补足。 2. 在PCR产物中，加入450 μl的 PCR-A。 3. 混合均匀后转移到制备管中，将制备管置于2 ml 离心管，12,000×g 离心1 min， 弃滤液。 4. 将制备管置回2 ml 离心管，加700 μl W2，10,000rpm 离心1 min，弃滤液。 5. 将制备管置回 2 ml 离心管，加 400 μl W2，10,000rpm离心1 min； 6. 将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管中，在制备管膜中央加 60 μl ddH2O (65℃预 热)，室温静置1 min。 7. 10,000rpm 离心1 min 洗脱DNA。即离心下来的溶液即为纯化的PCR样品。 8. 每组取5 μl样品1%Agarose凝胶电泳。
洗涤一次。弃滤液。
⑧ 将制备管置回2 ml 离心管中，12,000×g 离心1 min。
⑨ 取出制备管移入新的1.5 ml 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管
膜中央加30 μl 预热的去离子水，室温静置1 min。12,000×g 离心1
min。
⑩ 洗脱下来的溶液即质粒DNA样品。
11 取5 μl DNA样品1%Agarose凝胶电泳检测。
时间节点：3月19日
序号 实验内容 并行实验 1（上午） SDS-PAGE分析重组蛋白的表达 2（下午） Western Blot鉴定重组蛋白 3 20日蓝白斑筛选重组克隆：挑斑接种培养
时间节点：3月25日
1. 重组Bacmid的抽提与鉴定
时间节点：3月26日
1. Bacmid转染sf9细胞，制备重组病毒 2. 慢病毒载体转染293T细胞制备慢病毒 3. 3日后，即3月29日通过荧光显微镜观察细胞状态及发荧光情况。
4.1目的基因DNA与载体的连接（一组一份）
连接反应：
试剂 pET-28a/EcoRI +HindIII PCR/EcoRI +HindIII 连接酶Solution I 总体积 • 室温，连接过夜。
用量 2ul 8ul 10ul 20ul
4.2 BL21(DE3)感受态细胞的制备（1人一份）
1. 实验目的： • 掌握常规的化学法制备大肠杆菌感受态细胞的方法
H2O
总体积wenku.baidu.com
41l 100l
H2O
总体积
41l 100l
• 混匀上述反应体系，37C水浴60min； • 酶切产物的纯化：同PCR产物的纯化，最后用25l水洗脱。
四、 pET28a-GFP表达载体的构建（一组一份）
1. 目的：学习利用逆转录PCR克隆目的基因以及克隆基因重组表达 载体的构建； 2. 材料： • pET-28a/ EcoRI + HindIII： • 内切酶：EcoRI + HindIII • 连接酶：Solution I • Kan平板： • DNA酶切/PCR产物纯化试剂盒：
时间节点：3月12日
序号 实验内容 并行实验 1（上） pET28a+eGFP连接产物转化BL21(DE3) 2 pFastBacHTA质粒的抽提 及酶切和纯化 3（下） 构建重组质粒pFastBacHTA-eGFP：载体和克隆片段的连接 4 pFastBacHTA+eGFP连接产物转化TG1 5 13日下午挑斑接种培养
五、BL21（DE3）感受态细胞的转化(3.12)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BL21（DE3）培养物 LB培养基 100 mM CaCl2 Kan平板 Kan 质粒抽提试剂盒 内切酶 PCR试剂
5.1 BL21(DE3)感受态细胞的转化
• 取上次实验连接产物5ul加入到BL21(DE3)感受态细胞（100-200ul）中， • 轻弹管壁，混匀细胞和连接产物； • • • • • • • • • 冰上放置30min； 然后将感受态细胞置于恒温金属块中，42 C 热激BL21（DE3）感受态细胞90 sec； 取出感受态细胞冰浴5min； 加入1ml LB培养基，放入摇床中37 C ，220rpm培养45-60min； 5000rpm，离心5min；弃去上清1mL 余下100 ul菌液重悬，涂Kan平板 平板放入37 C生化培养箱中，正置培养30min后，倒置培养过夜（16hr）。 次日取出，挑斑接种LB/Kan液体培养基培养（ 37 C ，220rpm ）。 每人限挑一个斑接种（每组最多4斑）
④
⑤
加350 μl S3，温和并充分地上下颠倒数次，12,000×g 离心5 min。
吸取步骤4 中离心产生的上清并转移到制备管中（之前置于2 ml 离心管），12,000×g离心1 min， 弃滤液。
⑥ ⑦
将制备管置回离心管，加500 μl W1，12,000×g 离心1 min，弃滤液。 将制备管置回离心管，加700 μl W2，12,000×g 离心1 min，弃滤液；以同样的方法再用700 μl W2
实验注意事项
1. 接种培养示范； 2. 每组一管5ml LB液体培养基； 3. 除离心和培养外，所有操作均在超净工作台完成。
2、实验步骤
1. 于超净台中，按1%（V/V）的接种量，即取50 L大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种于5mL LB液体培养基中。
（一组接种一管）;
2. 3. 4. 37℃摇床培养1.5～2.0 h至OD600为0.4左右，此时大肠杆菌培养液呈现出一种“雾”状。 将装有大肠杆菌培养液的试管置于冰水浴中预冷10分钟。 于超净台中，取1.5mL大肠杆菌BL21(DE3)菌液至1.5mL Eppendorf管中，4℃，4,000rpm，离心5min。（每 人做一份）； 5. 弃尽上清液，加入1ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，轻弹管壁重悬菌体沉淀，使之混匀，4℃恒温， 4000rpm离心5min。 6. 7. 8. 弃尽上清液，加入0.5ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，冰水浴中放置30min。4℃恒温，4000rpm离心5min。 弃上清液，将菌体沉淀用100L预冷的的100mmol/L CaCl2甘油溶液重新轻轻悬浮。 置4℃冰箱保存，次日（4-16hr内）使用。
• 12,000 g， 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
3. RNA沉淀的清洗
• 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入DEPC配制的75％乙醇1ml（切勿触及 沉淀）； • 轻轻上下颠倒数次，12,000 g， 4℃离心5分钟后小心弃去上清；
4. RNA的溶解
• 室温自然晾干沉淀2～5分钟 • 加入20l的RNase-free水溶解沉淀 • 必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后-80℃保存，或暂时 于冰上保存。 • 取10 l总RNA与10 x Loading Buffer混合与1% agarose gel凝胶电泳。 • 100V，电泳20min，拍照记录。 • 剩余的RNA样品用于RT-PCR
试剂安排
• 69人上课 • 按照4人一组进行分组，共17组 • 教室：512；517. • 每组一套试剂和工具
一、总RNA的抽提（一人一份,3.26）
1. 目的：学习总RNA的抽提以及RNA的操作。 2. 试剂： • 细胞：每组一瓶 • Trizol：RNAiso • 氯仿： • 异丙醇 • DEPC水 • 70%的乙醇：DEPC水配制 • DNase/RNase-Free Tips and Tubes • 逆转录酶： • 引物 • DEPC水 • dNTPmix
2.3 pET28a质粒的制备(一组一份)
1. 目的：学习质粒DNA的抽提方法 2. 操作步骤
实验步骤
1. 硅膜法抽提质粒DNA
① ② ③
取3 ml TG1挑斑培养过夜的菌液，12,000×g,离心1 min，弃尽上清。 加250 μl S1 重悬细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。 加250 μl S2，温和并充分地上下颠倒数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此 步骤不宜超过5 min。
分子生物学实验安排
实验项目
1. E.coli重组表达GFP； 2. 利用杆状病毒在昆虫细胞中表达GFP； 3. 组装慢病毒表达目的蛋白。
三周（周六、周日）
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 总RNA的抽提：从病毒感染的sf9中抽提总RNA RT-PCR：以总RNA为模板克隆eGFP基因 原核表达载体的构建：构建pET28a-GFP 感受态细胞的制备：制备BL21（DE3）感受态细胞 原核诱导表达GFP： 构建克隆GFP的重组杆状病毒：在sf9细胞中表达GFP。 构建克隆RFP的慢病毒： GFP的表达与鉴定
操作注意事项：
1. 2. 3. 4. 全程戴一次性手套操作； 涉及RNA的操作时尽量不要开口说话； 涉及RNA的操作时尽量不要在四周走动； 取用试剂后及时封盖。
操作步骤
1. 细胞匀浆：感染病毒4天的sf9细胞 • 剧烈摇晃细胞瓶使细胞脱落下来；
• 每人取1ml细胞培养物于RNase和DNase Free的EP管中；1000rpm，4C
三、载体与目的DNA克隆片段的制备(一组一份)
1. 目的：利用双酶切PCR产物制备载体与目的DNA克隆片段 2. 材料： • QuickCut-EcoRI • QuickCut-HindIII • QuickCut-Buffer
双酶切体系：
试剂 载体 QuickCut-EcoRI QuickCut-HindIII 10 x QuickCut Buffer 用量 50l 2l 2l 5l 试剂 PCR纯化产物 QuickCut-EcoRI QuickCut-HindIII 10 x QuickCut Buffer 用量 50l 2l 2l 5l
• 12,000 g， 4℃离心15分钟。
• 从离心机中小心取出离心管（勿晃动），此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、 中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。 • 吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 • 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10分钟。
第2周
第3周
第4周
时间节点：3月11日
序号 实验内容 1（上午） 总RNA的抽提 2 RT-PCR克隆 3（下午） PCR产物的纯化 4 5 6 并行实验 pET28a质粒的制备
PCR产物的酶切和回收 pET28a质粒的酶切回收 构建重组质粒pET28a-eGFP：载体和克隆片段的连接 BL21(DE3) 感受态细胞制备
时间节点：3月18日
序号 实验内容 1（上午） 菌液PCR鉴定重组克隆 2 pET28a-eGFP的抽提 3（下午） 重组质粒的酶切鉴定 4 5 6 pET28a-eGFP双酶切 pFastBacHTA-eGFP转化DH10Bac 重组克隆诱导表达 并行实验 pFastBacHTA-eGFP的抽提 pFastBacHTA-eGFP双酶切
二、 RT-PCR克隆目的基因
1. 2. 3. 4. 逆转录合成第一链cDNA； PCR扩增目的基因； PCR产物的纯化； 制备目的DNA克隆片段
2.1 逆转录合成第一链cDNA（一组一份）
建议：大家使用3L总RNA样品
2.2 PCR扩增目的基因（一人一份）
1、PCR反应体系
试剂 浓度 用量
H2O 10 x PCR buffer d NTP mix
/ / 10mM
35 5 1
引物1 引物2 1st cDNA
Taq DNA酶 总体积
10M 10M
2 U/l
2 2 3 1 50
2. 充分混匀后用marker笔标记好，然后放入PCR仪中，按下列条 件进行反应： • 94 C, 5min • 94 C, 0.5min • 55 C, 30 sec 30次循环 • 72 C, 1min • 72 C, 10min • 4 C, 3. 取5 l PCR产物1% agarose gel电泳分析PCR：有或无？大小？