热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α 突触核蛋白毒性的作用

热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中

a突触核蛋白毒性的作用

（作者： _________ 单位：___________ 邮编：___________ ）

【摘要】目的探讨HSP70在因a-突触核蛋白过表达或突变所致的帕金森病（PD）细胞模型中的作用及其机制。方法构建过表达野生型和PD相关突变型（A53T）a-突触核蛋白质粒，转染人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）细胞后得PD细胞模型;然后在细胞模型中转染表达HSP70的质粒。采用免疫印迹检测转染HSP70细胞模型中a- 突触核蛋白表达量的改变；采用MTT法检测转染HSP70后细胞模型活力的变化。结果转染HSP70后，细胞模型a-突触核蛋白表达减少，细胞活性增加。结论HSP70通过降低a-突触核蛋白表达水平对PD 细胞模型发挥保护作用。

【关键词】a-突触核蛋白；热休克蛋白70;过表达

a-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白，具有调节膜稳定性和神经可塑性等生理功能。近年研究发现，a -突触核蛋白基因过表达或突变可引起a -突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成，使其结构和功能障碍，从而启动一系列级联

反应致多巴胺能系统损伤，最终导致帕金森病(PD)。研究认为神经保护剂可能是治疗PD的一个新的有效途径，而热休克蛋白70(HSP70) 就是其中之一。HSP70是分子伴侣家族中的一员，作为一种重要的应激蛋白，能与错误折叠的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成；除此之

外，HSP70还有助于错误折叠蛋白的降解〔1, 2〕。在果蝇及酵母的PD模型中发现，HSP70能减轻a-突触核蛋白的毒性及其引起的神经细胞凋亡〔3，4〕，而HSP70抑制a-突触核蛋白毒性可能与其能够与a-突触核蛋白相互作用，阻止a -突触核蛋白纤维样聚集，降低a -突触核蛋白表达量有关〔5, 6〕。为进一步证实HSP70在a-突触核蛋白所致PD的作用，本实验首次在神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)PD模型中检测了HSP70的作用及机制，发现HSP70可以通过降低a -突触核蛋白水平发挥对PD细胞模型的保护作用。

1材料与方法

1.1实验材料SH-SY5Y细胞购自ATCC公司;限制性内切酶购

自Takara 公司;QIAprep TIP100 Kit 购自QIAGEN 公司;人胎脑cDNA 文库、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000 购自Invitrogen 公司;蛋白酶抑制剂cocktail 购自Sigma 公司;anti- a-synuclein 204 抗体、anti-beta-actin抗体购自Santa cruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore 公司。

1.2方法

1.2.1质粒构建以人胎脑cDNA文库为模板，PCR获得a-突触核蛋白可编码序列(CDS序列)以Not I和Hi nd皿连接到pCDNA3.1真核表达载体中，通过overlap PCR方法，构建A53T突变体，同样以Not I禾和Hi nd皿连接到pCDNA3.1 真核表达载体中。按照QIAprep TIP100 Kit Protocol抽取并纯化质粒，测序证实。pCDNA3.1-HSP70 质粒由湘雅二医院肝移植中心李杰群博士惠赠。

1.2.2细胞培养与转染SH-SY5Y细胞采用含10%FBS的高糖DMEM培养液，置于37 °C，5%CO2的培养箱培养。转染严格按照Lipofectamine2000说明书进行。用不含FBS的DMEM培养基洗涤细胞2次，24孔细胞培养板每孔加入含2山Lipofectamine2000及0.8⑷质粒DNA、不含FBS的DMEM培养基500 山在37 C，5%CO2的培养箱中孵育3 h，改用含10%FBS的DMEM 培养基继续孵育48 h。

1.2.3免疫荧光将稳定表达蛋白的SH-SY5Y细胞接种到有盖玻片的24孔板中，用含10% FBS的DMEM培养于37C、5% CO2 培养箱中36 h后，弃去培养基，3.7%的多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS) 室温下固定15 min。PBS 洗2次，每次5 min。0.2%的Trit on X-100/PBS 透化10 min，PBS 洗2 次，5% 牛血清白蛋白(BSA) 圭寸闭液，室温圭寸闭30 min。加入1 400稀释的anti- a-synuclein204 一抗室温孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min。5%BSA封闭液，室温封闭20 min。加入

1 ：00稀释的anti-鼠lgG-Cy2二抗100 “，避光室温下孵育60 min。1 XPBS洗3次，每次5 min。4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核，

室温，避光反应 2 min。 PBS洗2次, 每次5 min。去离子水洗1次，封片，用激光共聚焦显微镜扫描和照

相。

124免疫印迹取细胞，吸去培养基，加入2X十二烷基硫酸钠(SDS)sample buffer(125 mmol/L Tris HCI , 20% Glycerol , 4% SDS , 0.1% bromphenol blue, pH 6.8)加入蛋白酶抑制剂cocktail裂解细胞，超声后，使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。均取20⑷总蛋

白经18% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并电转移至PVDF膜上。以5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入相应一抗，4 C过夜，Tris缓冲生理盐水溶液(TBST)洗膜后，加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育60 min，TBST洗膜后，电化学发光免疫分析法(ECL)发光，曝光。内参照为鼠抗-actin单克隆抗体。

1.2.5细胞活力测定调节SH-SY5Y细胞密度约5X104/ml，以100 "/孔接种于96孔板，24 h后分别转染pCDNA 3.1+HSP70;

a-突触核蛋白野生型+ PCDNA3.1；a-突触核蛋白野生型+HSP70; a-突触核蛋白A53T+PCDNA3.1; a-突触核蛋白A53T+HSP70;每种处理设3个复孔，24 h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)，继续培养 4 h。弃培养基，每孔加二甲基亚砜(DMSO)100 “振荡混匀，待颗粒溶解后置于酶标仪上，空白孔调零，以570 nm波长检测各孔吸光度值。

1.3统计学分析利用SPSS11.5软件进行统计分析，用t检验进行两组间差异比较。

2结果2.1PD细胞模型的构建a -突触核蛋白野生型和突变型