核酸分离纯化的原则
核酸分离纯化的原则
磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。
硅磁（Magnet ic Silic a Partic le）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。
离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COO H）等，从而达到吸附核酸目的。
不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。
使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。
磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。
Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。
核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。
在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。
核酸分离与纯化的步骤大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。
细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。
(1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。
有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。
(2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。
上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。
核酸分离纯化-经典版
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——RNA的保存
➢RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70℃保存 ➢长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ➢在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
➢ 保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——DNA的保存
➢DNA样品溶于pH8.0的TE缓冲液中，4℃或-20℃保存， -70℃冰箱可保存数年。
➢TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时 DNA易变性
➢分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分 开，同时避免核酸降解。
（三）核酸的分离纯化
应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物
蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质 2.非目的的核酸分子
分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子
核酸分离纯化的基本方法
1.加入浓盐溶液（如NaCl）
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
4.RNA酶（RNAase)抑制剂 （3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside
Complex, VRC)
一、核酸分离、纯化原则
(二)尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度 纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂 或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的 污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如 提DNA分子时，应去除RNA分子。
核酸的分离与纯化
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
2018/7/20
2
核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
34
2018/7/20
5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
2018/7/20
35
（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
2018/7/20
21
为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸提取的原则和流程
核酸提取的原则和流程嘿，朋友！今天咱们来聊聊核酸提取这个超有趣又超级重要的事儿。
一、核酸提取的原则1. 保证核酸的完整性这就像是保护一件精美的艺术品一样。
你想啊，如果核酸断成了一节一节的，那它就像一幅被撕得七零八落的画，可就没法好好发挥作用了。
我们得小心翼翼地处理样本，避免那些物理因素，像过度的震荡、剪切力，就好比你不能拿着那幅画胡乱摇晃，不然画就毁了。
还有化学因素，不合适的酸碱度就像给这幅画泼上了腐蚀性的液体，会把核酸给弄坏的。
温度也很关键呢，太热或者太冷都可能让核酸像脆弱的花朵在恶劣天气里一样受到伤害。
2. 纯度要高这纯度啊，就像是你做饭时用的原料得特别干净一样。
如果核酸提取出来混着好多杂质，就像你煮的粥里混着沙子，那怎么能行呢？杂质会干扰后续对核酸的各种研究和检测。
比如说那些蛋白质杂质，就像不速之客，它们可能会和核酸“抢地盘”，影响核酸在实验中的表现。
还有其他的小分子杂质，就像捣乱的小虫子，在我们想要精准研究核酸的时候，它们在旁边搅和得一团糟。
3. 得率要高想象一下你在果园里摘果子，你肯定希望把树上的果子尽可能多地摘下来呀。
核酸提取的得率高，就意味着我们能从样本里拿到更多可用的核酸。
要是得率低，就像你去果园忙活了半天，只摘到寥寥几个果子，那多不划算啊。
这得率和我们最初选择的样本量、提取的方法以及操作的精细程度都有关系呢。
二、核酸提取的流程1. 样本采集这是核酸提取的第一步，就像盖房子打地基一样重要。
不同的样本来源可有不同的采集方法哦。
如果是采集血液样本，护士就像专业的探险家一样，用针管精准地抽取适量的血液。
那动作必须熟练又小心，要是抽多了，病人可能会不舒服，抽少了又可能不够用。
要是采集的是组织样本，医生就像是技艺精湛的工匠，用特殊的工具精准地切取需要的组织部分。
这时候啊，旁边的助手就会在旁边提醒，“这个部位取的量要合适哦，不然会影响核酸的量呢。
”采集的样本要尽快处理，就像刚摘下来的新鲜水果得赶紧吃或者做成罐头保存一样，不然核酸可能会开始降解啦。
DNA提取注意事项
2、核酸制备的一般原则
分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
一、实验原理
3、核酸制备的一般原则
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶
二、材料、设备及试剂
菌种 ：DBT降解菌 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式 高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：LB液体培养基 、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸 钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5M NaCl 、Tris-饱和酚、氯仿、 RNA酶A 、无水乙醇
三、操作步骤
1、1.5ml菌液（每组两管）4 ℃ 12000rpm离心30sec， 弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。 2、每管加入400µ l裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅 助裂解，37 ℃水浴30min。 3、每管加入132µ l的5M NaCl溶液，颠倒试管，充分混 匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪 去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的 eppendorf管中。 4、加入等体积的饱和苯酚/氯仿，充分混匀后， 12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则说明仍含 有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤 直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止 （约2次）。
核酸分离与纯化的技术路线与原则
核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。
DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。
一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。
生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。
所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。
因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。
(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。
(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。
二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。
破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。
机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。
由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。
这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。
操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。
核酸的分离纯化(1)
Kanamycin resistance gene
Stanley Cohen & Annie Chan
Plasmi d
pSC10 1
Tetracycline resistance gene
E. coli transformed with recombinant plasmid
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline
（五）核酸的保存
完整版课件ppt
21
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
Home
完整版课件ppt
22
一、核酸分离、纯化原整版课件ppt
10
一把特殊的剪刀 —限制性内切酶的发现
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)， 获1978年诺贝尔生理学和医学奖
完整版课件ppt
11
Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年获得第一 个重组DNA分子 (实现不同来源 DNA的重组)
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
2 分离核酸原则：
1）温度不要过高；
2）控制一定的pH值范围(pH值5-9);
3）保持一定的离子强度;
4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.
完整版课件ppt
23
Home
（二）防止核酸的生物降解
第六章核酸的分离与纯化
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
核酸的分离与纯化讲解
• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
核酸的分离和纯化
琼脂糖凝胶电泳操作注意细节
1） 根据片段大小配制不同浓度的胶（改变分辨率），片段越小， 需要胶浓度越大。 2） 胶要现制先用 3） 选择合适的Marker 4） 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种，且浓度一致（1倍） 5） 点样时要加入loading buffer，并注意，不要将样点到点样 孔之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样） 6） 根据片段大小及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间 7）EB染色。
检测原理：
溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中， 在紫外光照射下，发射荧光。
EB: 先染与后染
核酸凝胶电泳技术
溴化乙锭染料的化学结构及 其 对 DNA 分 子 的 插 入 作 用 。 由于插入了溴化乙锭分子， 在紫外光照射下，琼脂糖凝 胶 电 泳 中 DNA 的 条 带 便 呈 现 出荧光，易于鉴定。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的 能力
凝胶类型及浓度 （bp）
分离DNA的大小范围
0.3%琼脂糖
50 000~1 000
0.7%琼脂糖
20 000~1 000
1.4%琼脂糖
6 000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1 000~100
10.0%聚~1
琼脂糖凝胶电泳的原理
rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列， 特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总 RNA纯度和完整性的重要参数。
3、 琼脂糖凝胶电泳
• 3. 1 原理： • 3. 2 用途：
琼脂糖凝胶电泳的原理
DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益
（1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构 型（超螺旋 > 线性 > 开环）； （3） 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成 反比（分子量越大，跑得越慢）；
动物组织基因组DNA的提取
二、实验原理
7、核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： ① 4℃ ——最佳最简单； ② -70℃——长期保存的良好温度； ③ -20℃ ； 保存介质： TE缓冲液（最常用） 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 1mmol/L EDTA pH 8.0
三、实验试剂、仪器和耗材
6、核酸制备的步骤 破碎细胞
提取
纯化
二、实验原理
6、核酸制备的步骤 破碎细胞
① 微生物：溶酶菌、SDS裂解； ② 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法——蛋白酶、胰蛋白酶； 冰冻法 —— 反复冻融或液氮冻后 组织捣碎； ③ 动物：液氮处理后用匀浆器破碎； 以上原理
2、核酸制备的一般原则
核酸制备时应注意的事项： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程； ② 减少化学因素对核酸的讲解； ③ 减少物理因素的核酸的讲解：机械剪切力和 高温； ④ 防止核酸的生物讲解；
二、实验原理
3、核酸酶的抑制和抑制剂
降低温度，改变pH值，及盐的浓度，都利于对 核酸酶活性的抑制，但均不如用核酸酶抑制剂更 有利，几个条件并用更好。 DNA ，抑制 Dnase 活力很容易，但防止机械拉 力张力更重要； RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但 抑制 Rnase 活力较难，故在 RNA 提取中设法抑制 Rnase更重要。
二、实验原理
4、核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质， 用于核酸提取的去垢剂一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： ① 溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； ② 溶解核糖体上面的蛋白，使其解聚，将核酸 释放出来； ③ 对Rnase和Dnase有一定的抑制作用； 如: SDS，脱氧胆酸钠，4-氨基水杨酸钠，萘-1， 5-二磺酸钠等
核酸分离纯化的总原则
核酸分离纯化的总原则
核酸分离纯化的总原则主要包括以下几点：
1. 选择适当的提取方法：根据样品类型和目标核酸的特点选择合适的提取方法，如CTAB法、硅胶柱法、磁珠法等。
2. 去除污染物：通过选择合适的缓冲液和添加试剂来去除可能存在的污染物，如蛋白质、RNA、PCR抑制物等。
3. 确保纯化的选择性：选择合适的纯化方法来分离目标核酸，如凝胶电泳、柱层析、磁珠萃取等，使目标核酸与其他杂质分离。
4. 去除RNA和DNA降解酶：为了保护目标核酸的完整性和稳定性，在分离纯化过程中要避免使用RNase和DNase酶。
5. 确保纯化的高效性和高纯度：通过优化纯化条件和使用高质量纯化试剂来确保核酸的高效纯化和高纯度。
6. 储存和保存：纯化的核酸要储存和保存在合适的条件下，如使用低温冰箱或液氮保存，并注意避免冻融循环。
核酸检测技术讲解
多重PCR（multiplex PCR）
A Typical Multiplex PCR Reaction
Sterile Water 10X PCR Buffer MgCl2 (50mM) dNTP’s (10mM each)
Primer1FWD Primer1REV Primer2FWD Primer2REV Primer3FWD Primer3REV DNA Polymerase DNA Template
荧光定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个 循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系 对起始模板进行定量分析。
与常规 PCR技术比较：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无 法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
（1）定量原理
如何对起始模板定量？
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人 发明了聚合酶链反应（PCR）
• 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由 于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力， 且易出错
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率 的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台 PCR自动化热循环仪
第2章 核酸检测技术
核酸检测技术
直接对动植物有害生物基因序列和结构进
行测定。
核酸的分离纯化 PCR技术 核酸杂交技术
第1节 核酸的分离纯化
核酸的分离纯化的原则
1. 保持核酸一级结构的完整性 2. 提高核酸制品的纯度
技术路线的设计
机械 （匀浆、超声破、研磨等）
破碎细胞的方法
核酸与蛋白质的分离与纯化
沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。 沉淀的特点 1.易将核酸溶液调至所需浓度 2.改变溶解核酸的缓冲液种类 3.去除部分杂质与某些盐离子 可选择有机溶剂沉淀核酸 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后可用有机溶剂（如乙醇、 异丙醇等）沉淀核酸，少量共沉淀的盐，可使用70~75%的乙醇洗涤。
质粒DNA (双链环状)
核酸分离与纯化的基本原则
1 保持核酸结构的完整性
控制缓冲液酸碱度：pH 4~10 注意机械剪切力 提取温度：0~4度 注意核酸酶
2 尽量排除其他分子的污染
蛋白质、多糖和脂质这类生物大分子杂质 对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子 其他核酸分子
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线
核酸分离与纯化的技术路线
5 核酸的保存
（1）DNA的保存
TE缓冲液中-70℃保存数年 TE缓冲液的 pH与DNA 贮存有关，pH为8.0时，可减少
DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。 在DNA溶液中加少量氯仿可有效防止细菌和核酸的污染
（2）RNA的保存
可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液，-70℃保存 可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 ℃保存。 以焦碳酸二乙酯水溶解可抑制RNA酶对RNA的降解。
核酸分离与纯化的技术路线
3 核酸的浓缩、沉淀与洗涤
（1）核酸的浓缩
核酸浓缩常选用有机溶剂沉淀法 ①固体聚乙二醇（PEG）浓缩 将DNA溶液装入透析袋，包埋于PEG使DNA脱水。 ②丁醇抽提浓缩 正丁醇或仲丁醇具有吸水能力，但DNA不溶于丁醇，振荡 混合后离心，去除有机相，可显著减少DNA体积。
核酸分离与纯化的技术路线
只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液
生物大分子的分离
二、技术路线的设计
总技术路线： 核酸的释放
核酸的分离、纯化(包括粗分离和细分离)
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
核酸的鉴定与保存
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
（一）核酸的释放
分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分 子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出 来，并保持原来的天然状态和生物活性。
核内染色体DNA、细胞器DNA；细胞质RNA 原核生物核酸的分布：
“染色体”DNA、质粒DNA 病毒核酸：
DNA、RNA病毒 单、双链（环或线状）
核酸的理化性质
分离对象的基本情况
核酸存在形式 核酸的细胞定位、结构
核酸的理化性质 基因组大小：病毒、原核、真核生物基因组 化学性质：在一定pH范围内 DNA对碱相对稳定 RNA对酸相对稳定
非机械法裂解细胞：
干燥法
溶胞法 化学试剂与蛋白水解酶裂解细 胞，方法温和，有较高得率和较好核酸 完整性，普遍采用，如SDS-PK（蛋白酶K） 裂解细胞。
（二）核酸的分离与纯化
分离与纯化：利用一个或多个理化性质上的区别、 独特的生物学特性及细胞定位等，从复杂的细胞裂 解物中提取核酸或除去污染物的过程。
（二）保持核酸的完整性和纯度
影响完整性的因素： 物理 机械力、高温、辐射等 化学 强酸、强碱、有机溶剂 生物学 DNA酶(DNase) 、RNA酶(RNase)
措施：
为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 :
1．保持低温（0º～4℃），避免剧烈搅拌，避免辐射。 2．防止过酸、过碱。
缓冲液pH 4-10（DNA的pH8.3，RNA的pH4.5-5.5） 3．防止核酸酶的作用。
背景扣除： A260- A310(盐吸光度)
核酸的分离和纯化
RNA制备前的准备
玻璃器皿 在使用前应180℃烤至少4小时 塑料器皿 用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）或用氯仿洗涤 电泳槽 用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于
3%H2O2 液中10分钟，然后0.1%DEPC处理水彻 底冲洗。 配制的溶液应用0.1% DEPC在37℃处理12小时以上，再高 压灭菌去除 DEPC。 不能高压灭菌的溶液用
EDTA/0.1 SDS的试管收集洗脱的RNA溶液。
35
6）按步骤2重新平衡柱子，重复步骤2-4的poly(A)选 择吸附和洗脱过程。
7）调整收集的RNA溶液的乙酸钠浓度至 0.3mol/L, 加2.5倍体积乙醇，移至2个硅化的SW-55离心管 中，-20℃放置过夜 。
8）4℃离心, 30, 000g 30分钟沉淀RNA（极稀浓 度 ）。弃去乙醇，晾干沉淀，重溶于150微升无 RNA酶的TE缓冲液，合并样品。取5微升在70℃ 加热5分钟后，在1%琼脂糖凝胶电泳中检查RNA 的质量。
31
方法 一、异硫氰酸胍法制备总RNA
二、TRIzol试剂提取细胞总RNA
步骤：
1） 组织标本需在预冷的碾钵中捣碎，收获1x106-5x106细
胞, 移入1.5 ml管中。
2） 加TRIzol试剂1 ml，混匀，冰浴5 mins。
3） 加氯仿0.2毫升，混匀，冰浴10 mins。
4） 4℃,10, 000g离心5 mins。
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
植物 环状 100~150 kb
动物(扁虫到人)环状 15~18 kb
锥虫 网状
第五章 核酸的分离纯化
六、 DNA片段的回收
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 （二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段
六、 DNA片段的回收
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法
电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有 负电荷的DNA分子。 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳 至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但 不适用于分子量超过10kb和单链DNA。
哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线
第二节 真核基因组DNA的分离纯化
一、酚抽提法 二、甲酰胺解聚法 三、玻棒缠绕法 四、其它方法 五、DNA片段的纯化 六、DNA片段的回收
一、酚抽提法
DNA酚抽提法示意图
一、酚抽提法
• 该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使 用的是改进的方法
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放 （二）核酸的分离与纯化 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放
DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因 此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释 放核酸。
表５-１ 各种组织细胞破碎方法
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
第五章 核酸的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 RNA的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
核酸分离纯化的原则
核酸的分离纯化原则主要包括以下几个方面：
1. 根据物理化学性质分离：包括碱基成分、大小、形态等，如使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA和RNA；利用离心、超滤和电泳等技术可分离DNA、RNA和蛋白质。
2. 根据碱基组成分离：由于不同物种、不同个体的DNA碱基组成不同，因此可以利用这一差异利用测序、杂交、PCR等方法进行分离。
3. 根据功能分离：可以根据DNA和RNA的功能和特异性进行分离。
例如，使用特异性结合染料或核酸探针选择性地富集DNA或RNA。
4. 根据生化特性分离：DNA和RNA在不同条件下的生化特性差异较大，可以利用这一特点进行分离纯化，如利用酸性或碱性溶液进行分离纯化。
5. 根据亲和性分离：根据DNA或RNA与某些物质的亲和性选择性地富集、分离纯化DNA或RNA，例如使用特异性结合蛋白质来富集特定DNA或RNA序列。