生化分离技术思考题答案解析(1-6章)

生化分离技术思考题答案解析生化分离第一章1. 简述生化分离技术在生物技术中的地位和主要作用。

2.生化分离技术的主要种类及特点。

种类：细胞破碎(cell disruption) 、沉淀分离(precipitation) 膜过滤(membrane filtration) 层析分离(chromatography)、电泳分离(electrophoresis)、离心分离（centrifugation）特点：成分复杂、含量甚微、易变性，破坏、具经验性、均一性的相对性3．何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。

1) 利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成) 2) 或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。

如膜过滤与亲和配基、离子交换基团相结合，形成了亲和膜过滤技术、亲和膜色谱、离交膜色谱；亲和配基和聚合物沉淀作用相结合，形成亲和沉淀技术等等。

（P5）4.说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处。

1选材，来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少2.提取：将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态有关。

3.分离纯化：核心操作，须据目的物的理化性质，生物学性质及具体条件定。

4.浓缩、结晶、干燥。

5、保存。

整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度）。

胞内产物需要破壁的过程：需要将目的物从胞内转移到外界溶液中，需要细胞提取物破碎、匀浆、离心，如果是液体的话，获得提取液，如果是想获得固体目的物，就对沉淀进行洗涤再获得提取物。

生化分离第二章1、简要说明常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。

答：常用的细胞破碎方法有：组织捣碎、珠磨法、高速匀浆法、挤压法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法、干燥法等。

1 组织捣碎，其原理是利用机械运动产生剪切力的作用破细胞，利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。

（10000～20000r/min）；适用范围：动植物组织。

2 珠磨法，工作原理是：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物；特点：一般可以达到较高的破碎率，但同时为控制温度，冷耗能耗较高，成本亦随之增加；适用范围：微生物（细菌）与植物细胞。

3 高速匀浆法，工作原理：利用高压使细胞悬浮液通过针性阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂；特点：破碎程度较高，而其机械剪切力对生物大分子的破坏较少，处理量大；适用范围：较柔软、易分散的组织细胞。

4 挤压法，工作原理：微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎；适用范围：细菌（革兰氏阴性菌）5 超声破碎法，工作原理：声频高于15-20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，破碎机理不详，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关，空化现象是在强声波作用下，气泡形成、胀大和破碎的现象；特点：多采用短时多次处理样品，且由于过程产热较多，常在冰浴中进行超声；处理少量样品，操作简便，液量损失少；适用范围：微生物细胞。

6 酶溶法，又分为外加酶和自溶两种，外加酶原理：用生物酶将细胞壁核细胞膜消化溶解；特点：具有选择性释放产物、核酸泄露少、细胞外形完整，但价格较高、通用性差。

自溶法。

原理：控制一定条件，诱发微生物细胞产生过剩的溶胞酶或激发溶胞酶活力，使细胞自溶；特点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性。

7 化学渗透法，原理：某些有机溶剂、表面活性剂、抗生素等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择的渗透出来；特点：对产物释放有一定的选择性，细胞外形保持完整，浆液黏度低，但反应时间长，效率低，有毒。

8 干燥法，原理：细胞壁膜的结合水丧失，改变细胞渗透性。

又分为热空气干燥（适用酵母）、真空干燥（适用细菌）、冷冻干燥（制备不稳定的酶）。

9 急热骤冷法，原理：将材料投入沸水，维持85～90℃数分钟，冰浴中急速冷却，使胞壁结构破坏；适用范围：细菌及病毒等中对热不太敏感的物质提取。

10 反复冻融法，原理：将材料深冷（-15℃～-20℃），形成水晶，破坏胞膜疏水键，增加亲水性，反复可破细胞；适用：动物材料。

细胞破碎技术研究发展方向：1 多种破碎方法相结合2与上游技术相结合3 与下游技术相结合。

2、抽提的含义是什么？影响抽提有效成分的主要因素有哪些？答：抽提是从一种固体或一种液体混合物中将所要的物质根据其特性用溶剂提取分离出来的方法。

1. 离子强度:影响物质溶解度的主要因素。

适当的低离子强度溶液（0.05～0.2mol/l）除增加溶解度，还对活性有稳定作用。

2．pH 影响目的物的溶解度及稳定性。

一般控制在pI附近的稳定性范围内。

3．添加剂:抑制剂（主要水解酶抑制剂）如提取核酸时，添加核酸酶抑制剂防目的物被分解。

保护剂（稳定性）如对含巯基的酶添加谷胱甘肽等巯基保护剂3、在生物活性物质的提取中，怎样选这合适的提取剂？造成提取液混浊的主要原因是什么？如何解决？答：在生物活性物质的提取中，选择提取剂的要求：目的物溶其中，保活性，减杂质量。

考虑因素如下：1. 离子强度影响物质溶解度的主要因素。

适当的低离子强度溶液（0.05～0.2mol/l）除增加溶解度，还对活性有稳定作用。

2． pH影响目的物的溶解度及稳定性。

一般控制在pI附近的稳定性范围内。

3．添加剂抑制剂（主要水解酶抑制剂），如提取核酸时，添加核酸酶抑制剂防目的物被分解。

保护剂（稳定性），如对含巯基的酶添加谷胱甘肽等巯基保护剂另外提取剂的用量，对于目标：收率（80%以上）且目的物浓度大时：动物、微生物—加1.5～3体积的提取剂；植物—加入0.5～1体积的提取剂。

造成提取液混浊的主要原因是蛋白质和核酸等杂质未除净；使提取液澄清的方法有：㈠．粒子聚结（增大颗粒粒径）⑴． 25%（NH4）SO4处理（适用于动物细胞）⑵．酸化法㈡．降低提取液粘度NA（DNA、RNA），类树胶等易造成粘度大。

（适用于微生物细胞）㈢．其他方法⑴80%硫胺或55%丙酮，使蛋白质沉淀类树胶不沉淀；⑵吸附法；⑶改善破碎方法。

4、试比较在分离制备蛋白质、多糖和核酸的过程中所用方法的通用性，并说明为什么？答：这些大分子物质大多存在于胞内，对于蛋白质、多糖、核酸的提取，首先要进行细胞破碎，主要包括机械法和非机械法，但破碎过程中都尽可能保证目的物不失活。

在提取过程中尽量除去杂质，对于这些生物活性物质，为防止酚类物质及氧化剂的影响，一般在提取过程中都需要加入保护剂及抑制剂。

对于除杂处理，在这三种物质的提取中，相同杂质去除亦有着相似的方法。

比如在提取核酸或多糖时，去除蛋白质的方法，均可使用蛋白质变性剂使蛋白沉淀，亦或采用苯酚、氯仿抽提除蛋白。

对于无机盐及低分子量的有机物质可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法除去；对于大分子杂质可用酶消化(如蛋白酶、木质素酶)，乙醇或丙酮等溶剂沉淀法或金属络合物法。

5、简述盐析分级范围的选择依据。

某纯酶和粗酶的盐析分级范围是否相同？为什么？答：在分离混合蛋白质的过程中，不同蛋白质的盐析峰有重叠，盐析范围要权衡纯度和回收率进行选择。

各种酶和蛋白质的沉淀曲线的Ks相差不大，因此盐析的最适分级范围在8%左右，如一种蛋白在此范围内约有90%的蛋白质能沉淀下来，若盐析范围加宽，虽可提高回收率，但可能会带入杂蛋白，使盐析的分辨率降低。

同一种蛋白酶的纯酶和粗酶的盐析分级范围不同。

对于纯酶，因其含有杂质较少，在纯度较高的前提下，盐析分级范围可以适当加大，以期提高酶的回收率；对于粗酶，含有较多的杂蛋白，在分离的起始阶段应先考虑除去杂质，提高纯度，故盐析范围应适当减小。

6、确定盐析分级宽或窄的原则是什么？如何操作？答：不同蛋白质盐析峰有重叠，须权衡纯度与回收率进行选择。

盐析沉淀的最适分级范围在8%左右，一种蛋白质在这个范围内约有90%蛋白质能沉淀下来，若分级范围加宽，尽管能提高回收率，但可能引入较多杂蛋白，是盐析分辨率降低。

可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。

（从回收率和纯度考虑）举例说明取一份小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围如需回收率高，可取40 ～80，94%回收率，纯化倍数1.9需高纯度，可取48 ～65，75%回收率，纯化倍数3.07、简述盐析分离的原理，可采用什么措施提高盐析效率？答：低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大，这一现象称为盐溶；但当中性盐浓度增一定时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀，此现象称为盐析。

纯一单蛋白质盐析公式：lgS = β－Ks×IS为蛋白质溶解度（g/L）；β为I=0时lgS，它取决于溶质的性质；Ks为盐析常数，主要决定于加入盐的性质及Pr性质。

I为盐浓度（mol/L）其中Ks与蛋白质性质和盐的种类有关，与pH、温度无关；β与蛋白质性质、盐的种类、pH、温度均有关系。

所以对于某种蛋白质的盐析提取过程，要提高盐析效率，主要从盐的种类、pH、温度等方面考虑。

其中，对于盐的选择，可使用的中性盐有：(NH4)2SO4 Na2SO4 MgSO4 NaCl NaAc Na3PO4 柠檬酸钠硫氰化钾等以(NH4)2SO4 Na2SO4最广泛，前者最受欢迎。

pH影响β值，进而影响了蛋白质的溶解度，故在其他条件一定时，通过改变pH也可实现蛋白质的分离。

在高离子强度的溶液中，升高温度可使β值下降，，若在保证蛋白质不失活的情况下，可使蛋白质溶解度下降，加快盐析过程。

此外，蛋白液的浓度对沉淀有双重影响，蛋白浓度越高，盐的饱和度极限越低，但杂蛋白的共沉淀现象也随之加重，故一般控制蛋白浓度在2.5-3%。

8、从植物或动物材料中提取酶类，一般预处理过程中影响酶回收率的原因是什么？如何解决？答：植物酶提取过程，影响酶回收率的主要因素是酚类物质的去除程度，此外还有温度、pH、搅拌剪切等因素。

操作要求包括：⑴温度尽可能低；⑵提取液的量要保证“充分浸入”；⑶加入足量酚类吸附剂；⑷加入足量氧化酶抑制剂；⑸搅拌转速要恰当；⑹pH要控制在合适范围，一般5.5～7 。

动物酶提取过程，影响因素包括破碎程度、pH、温度等，具体操作注意如下：匀浆化前的预处理，冷冻有利于破碎提取物缓冲液的选择(中性)蛋白酶抑制剂的添加保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等)提取液的澄清( 高速离心、沉淀、吸附等)9改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？答：主要方法有：细胞的破碎：1珠磨法。