生化分离技术思考题答案解析(1-6章)

生化分离技术思考题答案解析

生化分离第一章

1. 简述生化分离技术在生物技术中的地位和主要作用。

2.生化分离技术的主要种类及特点。

种类：细胞破碎(cell disruption) 、沉淀分离(precipitation) 膜过滤(membrane filtration) 层析分离(chromatography)、电泳分离(electrophoresis)、离心分离（centrifugation）

特点：成分复杂、含量甚微、易变性，破坏、具经验性、均一性的相对性

3．何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。1) 利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成) 2) 或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。如膜过滤与亲和配基、离子交换基团相结合，形成了亲和膜过滤技术、亲和膜色谱、离交膜色谱；亲和配基和聚合物沉淀作用相结合，形成亲和沉淀技术等等。（P5）

4.说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处。

1选材，来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少

2.提取：将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态有关。

3.分离纯化：核心操作，须据目的物的理化性质，生物学性质及具体条件定。

4.浓缩、结晶、干燥。5、保存。整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度）。胞内产物需要破壁的过程：需要将目的物从胞内转移到外界溶液中，需要细胞提取物破碎、匀浆、离心，如果是液体的话，获得提取液，如果是想获得固体目的物，就对沉淀进行洗涤再获得提取物。

生化分离第二章

1、简要说明常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。答：常用的细胞破碎方法有：组织捣碎、珠磨法、高速匀浆法、挤压法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法、干燥法等。

1 组织捣碎，其原理是利用机械运动产生剪切力的作用破细胞，利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。（10000～20000r/min）；适用范围：动植物组织。

2 珠磨法，工作原理是：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物；特点：一般可以达到较高的破碎率，但同时为控制温度，冷耗能耗较高，成本亦随之增加；适用范围：微生物（细菌）与植物细胞。

3 高速匀浆法，工作原理：利用高压使细胞悬浮液通过针性阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂；特点：破碎程度较高，而其机械剪切力对生物大分子的破坏较少，处理量大；适用范围：较柔软、易分散的组织细胞。

4 挤压法，工作原理：微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎；适用范围：细菌（革兰氏阴性菌）

5 超声破碎法，工作原理：声频高于15-20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，破碎机理不详，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关，空化现象是在强声波作用下，气泡形成、胀大和破碎的现象；特点：多采用短时多次处理样品，且由于过程产热较多，常在冰浴中进行超声；处理少量样品，操作简便，液量损失少；适用范围：微生物细胞。

6 酶溶法，又分为外加酶和自溶两种，外加酶原理：用生物酶将细胞壁核细胞膜消化溶解；

特点：具有选择性释放产物、核酸泄露少、细胞外形完整，但价格较高、通用性差。自溶法。原理：控制一定条件，诱发微生物细胞产生过剩的溶胞酶或激发溶胞酶活力，使细胞自溶；特点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性。

7 化学渗透法，原理：某些有机溶剂、表面活性剂、抗生素等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择的渗透出来；特点：对产物释放有一定的选择性，细胞外形保持完整，浆液黏度低，但反应时间长，效率低，有毒。

8 干燥法，原理：细胞壁膜的结合水丧失，改变细胞渗透性。又分为热空气干燥（适用酵母）、真空干燥（适用细菌）、冷冻干燥（制备不稳定的酶）。

9 急热骤冷法，原理：将材料投入沸水，维持85～90℃数分钟，冰浴中急速冷却，使胞壁结构破坏；适用范围：细菌及病毒等中对热不太敏感的物质提取。

10 反复冻融法，原理：将材料深冷（-15℃～-20℃），形成水晶，破坏胞膜疏水键，增加亲水性，反复可破细胞；适用：动物材料。

细胞破碎技术研究发展方向：1 多种破碎方法相结合2与上游技术相结合3 与下游技术相结合。

2、抽提的含义是什么？影响抽提有效成分的主要因素有哪些？

答：抽提是从一种固体或一种液体混合物中将所要的物质根据其特性用溶剂提取分离出来的方法。

1. 离子强度:影响物质溶解度的主要因素。适当的低离子强度溶液（0.05～0.2mol/l）除增加溶解度，还对活性有稳定作用。

2．pH 影响目的物的溶解度及稳定性。一般控制在pI附近的稳定性范围内。

3．添加剂:抑制剂（主要水解酶抑制剂）如提取核酸时，添加核酸酶抑制剂防目的物被分解。

保护剂（稳定性）如对含巯基的酶添加谷胱甘肽等巯基保护剂

3、在生物活性物质的提取中，怎样选这合适的提取剂？造成提取液混浊的主要原因是什么？如何解决？

答：在生物活性物质的提取中，选择提取剂的要求：目的物溶其中，保活性，减杂质量。考虑因素如下：

1. 离子强度

影响物质溶解度的主要因素。适当的低离子强度溶液（0.05～0.2mol/l）除增加溶解度，还对活性有稳定作用。

2． pH

影响目的物的溶解度及稳定性。一般控制在pI附近的稳定性范围内。

3．添加剂

抑制剂（主要水解酶抑制剂），如提取核酸时，添加核酸酶抑制剂防目的物被分解。

保护剂（稳定性），如对含巯基的酶添加谷胱甘肽等巯基保护剂

另外提取剂的用量，对于目标：收率（80%以上）且目的物浓度大时：

动物、微生物—加1.5～3体积的提取剂；

植物—加入0.5～1体积的提取剂。

造成提取液混浊的主要原因是蛋白质和核酸等杂质未除净；使提取液澄清的方法有：㈠．粒子聚结（增大颗粒粒径）

⑴． 25%（NH4）SO4处理（适用于动物细胞）

⑵．酸化法

㈡．降低提取液粘度