第4章 亲合层析
亲和层析_精品文档
利于酸性蛋白的偶联。
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5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基；
（二）、空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分
子配基更明显。
“手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。
常用的“手臂”多为烃链。
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（三）、配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基
团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂
（2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不 影响E对S的结合，非竞争性效应。
（3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与 S结合更紧密（负洗脱） 。
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反竞争性效应
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亲和层析中配基的选择和洗脱条件
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（三）、亲和吸附剂的再生
用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由
联。
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3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体 通过醚链形成的衍生物。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
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4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有
择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析法
2、配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。 如抑制剂、底物、抗体、辅酶等。
依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素：
① 正确地预计被设计的配体构像
② 正确预计配体的亲和力
优良配体须具备的条件：
① 与待纯化的物质有较强的亲和力。
一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析 时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物 质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是 不利的。
亲和层析载体的组成 配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体。
原理
亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作 为固定相吸附剂；
当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和 固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合， 其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出；
然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。
拟生物亲和层析
利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工 合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程 亲和层析的应用
1、载体的选择
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰载
体，以制备所需的亲和吸附介质即固定相。 作为载体的物质应具有：
②具有与基质共价结合的基团
与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组 分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸 附作用。
③配体要能够与基质稳定的共价结合 在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对 其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中 与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明 显影响。
亲和层析原理和步骤
亲和层析原理和步骤亲和层析（affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化靶标蛋白的方法。
它利用配体与目标蛋白的高亲和力来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析的原理和步骤如下。
一、亲和层析的原理亲和层析的原理基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。
配体是一种具有特异性反应性的化合物，可以和目标蛋白的结构域或位点发生特异性作用。
在亲和层析中，配体被固定在固定相上，也可以被连接到大分子载体上，形成亲和层析介质。
当样品通过亲和层析柱时，目标蛋白会与配体发生选择性结合，而其他非目标蛋白则不结合或弱结合，从而实现了目标蛋白的分离和纯化。
亲和层析的步骤通常包括以下几个方面：2.固定配体：将配体固定在固定相上是亲和层析的关键一步。
固定相可以是固定在柱子内壁的小分子配体，也可以是连接在大分子载体上的配体。
常用的固定剂包括琼脂糖、丙烯酰胺凝胶、硅胶等。
3.样品准备：在进行亲和层析之前，需要对样品进行准备。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、预处理等步骤。
样品中的废物和干扰物需要被去除，以便目标蛋白的有效分离和纯化。
4. 亲和层析操作：样品通过亲和层析柱时，目标蛋白与配体发生特异性结合。
通常需要选择适当的Buffer、pH值和盐浓度等条件来提高结合效率。
非目标蛋白会通过柱子流失，而目标蛋白则留在柱子中。
目标蛋白可以通过洗脱步骤从柱子中进行脱附。
5.洗脱与纯化：在洗脱过程中，目标蛋白从亲和层析柱中脱附。
洗脱条件需要根据结合强度和目标蛋白的特性来选择。
常用的洗脱方法包括pH值的调节、离子浓度的变化、配体浓度的变化等。
洗脱后的目标蛋白可以通过浓缩和纯化步骤得到纯品。
二、亲和层析的优缺点亲和层析作为一种分离和纯化方法，具有以下优点：1.特异性：亲和层析可以选择性地结合目标蛋白，从而实现与其他非目标蛋白的分离。
2.高纯度：亲和层析可以显著提高目标蛋白的纯度，使其达到实验或工业应用的要求。
3.选择性：亲和层析可以基于不同的配体，实现对不同蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
亲和层析的原理及应用
亲和层析的原理及应用1. 什么是亲和层析？亲和层析是一种分离和纯化生物分子的技术方法。
它基于生物分子之间的特异性相互作用，例如抗原与抗体的结合。
亲和层析通过利用这种特异性相互作用，将目标分子从混合物中有效地分离出来。
亲和层析可以用于纯化蛋白质、分离细胞、筛选药物等多种应用。
2. 亲和层析的原理亲和层析的原理基于生物分子之间的相互作用。
在亲和层析中，通常使用的是一对具有特定相互作用的分子，例如抗原与抗体、配体与受体等。
这对分子中的一个部分被固定在固相介质上，而另一个部分则与目标分子发生特异性相互作用。
亲和层析的步骤包括：•预处理：选择适当的固相介质，并将其与特异性相互作用的分子配对。
固相介质可以是固定在柱子或颗粒上的化学物质。
•样品加载：将待分离的混合物样品加到预处理后的固相介质上。
目标分子与固相介质上的特异性配对分子发生结合。
•洗涤：用缓冲液将非特异性结合的物质洗掉，以减少背景噪音。
•洗脱：用特定的洗脱液冲洗固相介质，破坏特异性相互作用，使目标分子从固相介质上解离出来。
•收集纯化物：通过收集洗脱液中的目标分子来获取纯化物。
3. 亲和层析的应用亲和层析在生物科学研究和工业领域中得到了广泛的应用。
以下是亲和层析的一些常见应用：3.1 蛋白质纯化亲和层析可以用于纯化蛋白质。
通过将特异性配对的分子与待分离蛋白质结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标蛋白质从混合物中高效地纯化出来。
亲和层析在蛋白质研究和生物制药等领域具有重要的应用价值。
3.2 细胞分离亲和层析可以用于分离特定种类的细胞。
通过将细胞与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标细胞从混合物中分离出来。
这在细胞学研究和细胞治疗等领域具有重要的应用价值。
3.3 药物筛选亲和层析可以用于筛选药物候选物。
通过将潜在药物分子与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以筛选出具有特定相互作用的药物候选物。
这在药物研发过程中有着重要的应用价值。
3.4 DNA/RNA纯化亲和层析也可以用于DNA/RNA的纯化。
亲和层析原理和步骤
基质类似物，抑制剂，辅酶 抗原，病毒，细胞 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 受体，载体蛋白 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞
（一） 载体的选择
1、载体要求： （1）不溶性 （2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液
体流动性 （3）化学和机械性能稳定 （4）具备大量能被活化的基因 （5）抗微生物和酶的侵蚀
2、常用载体
（1）纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化
（2）葡聚糖凝胶
特点： 化学及物理性质稳定
多孔性比琼脂糖低
（3）琼脂糖凝胶
浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B
四、应用
1、分离和纯化 2、分辨化学或遗传学上修饰的酶 3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质
结构研究 4、纯化人工合成的多肽和蛋白质 5、解释酶作用机理
载体
实验 亲和层析法分离豌豆凝集素
KL：解离常数 E： 酶
L： 底物
E+L
KL
EL
EL：复合物
KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL] E0、L0：起始浓度 当L0》E0时 KL =[E0-EL][L0]/[EL] [EL]=[E0-EL][L0]/ KL Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL
凝胶浓度越低 结构越疏松 机械强度越低
（4）聚丙烯酰胺凝胶 特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多
（5）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀
耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释亲和层析的基本原理是通过层析柱使吸附剂对某种物质的结合能力增强，或者改变其分子形状使它更易于与其他组分进行亲和层析。
简言之就是把组分放在亲和层析柱上，让吸附剂对某个组分的吸附作用增强，因此减弱或避免了它对其他组分的吸附作用。
亲和层析技术具有一些特殊性：①亲和层析反应体系属于多组分反应体系，具有相当大的范围可以选择；②利用亲和层析方法可以将含量低的同类型物质，甚至许多非亲和性组分结合在一起；③由于亲和层析不但具有显著的选择性，而且还能同时对两种或两种以上的不同物质进行层析，因此对这类化合物的分离和鉴定具有独特的优越性；④对混合物中不同类型的化合物都能进行层析，即使物质间的亲和性很差，如异构体之间也能被分离。
亲和层析技术已经广泛地用于天然产物化学成分的分离和鉴定、药物分子的筛选和结构改造、环境污染物的检测、生物活性物质的研究以及疾病的诊断等领域。
目前，该技术已经成功地应用于维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、蛋氨酸、生物碱、三尖杉酯碱、芦荟大黄素、葛根素、万寿菊素、番茄红素、菠菜素、辣椒素、藏红花素、皂苷元、蛋白质、酶、雌性激素、黄酮类化合物、动物激素、血清和细胞培养液中多种微量元素等物质的分离和鉴定。
在植物化学、药学、分子生物学、生命科学等领域，亲和层析方法也得到了广泛应用。
自1960年第一次用亲和层析方法对一些水果蔬菜和草药中的几十种成分进行了分离后，亲和层析方法就受到各国科学家的重视，并获得了飞速发展。
亲和层析是基于极性分子吸附剂上的疏水部分和亲和性化合物中的亲水部分互相吸引而实现的。
不同的亲和层析方法常采用不同的吸附剂，如水合物(或疏水性吸附剂)和氧化物(或亲水性吸附剂)。
根据吸附剂与待分离化合物的亲和程度，常用四级亲和度(级别越高说明与化合物的亲和性越强)：(1)较弱亲和，用氧化物吸附剂；(2)中等亲和，用水合物吸附剂；(3)较强亲和，用亲水性吸附剂；(4)极强亲和，用强水合物吸附剂。
第四节 亲和层析
3
蛋白质混合物
与配体结合 的蛋白质
加入的可 溶性配基
基质
配体
没有结合 的蛋白质
专一性结 合蛋白质
非专一性结合蛋 白质
蛋 白 质 浓 度
加入配基
与配体专一性结合 蛋白质
洗脱体积
4
固体基质、配体、耦合反应、洗脱
5
亲和层析的原理与抗原-抗体、激素-受体和酶底物等特异性反应的机理相类似。每对反应物之 间都有一定的亲和力。正如酶与底物的反应中， 特异的底物(S′)才能和一定的酶（E)结台。产 生复合物（E-S′) —样。在亲和层析中是特异 的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力， 并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同 的是，前者进行反应时，配体(类似底物)呈固相 存在，后者进行反应时，底物呈液相存在。
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在基质和配体偶联后的溶液中，加入预先 用盐酸调节pH为9的乙醇胺溶液，在搅拌 下反应15min，在室温下洗涤吸附剂，以 除去过量的配体。
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3 配体结合量的测定
配体结合量一般是用每毫升或每克贮存胶束缚
配体的量表示的。如用mg/ml表示，虽比较简便，
但相对误差较大。测得的配体结合量可作为决
定亲和吸附剂实际用量的参数。 两种测定法：即直接测定法和间接测定法。
机械强度比Sepharose2B好,
所以是亲和层析中广泛使用的基质。
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(二) 配体的选择
配体的选择需要谨慎。
选择的配体：抑制剂、效应物、酶的辅助因子、
类似底物、抗体和其它物质（如外源凝集素、
染料和金属离子等）等。
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优良的配体应具备两间的亲和力太大时，对 分离纯化大分子物质是有害的。
玻璃珠具有多孔性好、机械性能强的特点，但对某 些物质也有一定的吸附力。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法引言亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
本文将介绍亲和层析的基本原理和常用方法。
一、亲和层析的基本原理亲和层析是利用化学结合的特异性，将目标分子与固定在层析柱上的亲和配体结合，从而实现目标分子的分离纯化。
其基本原理如下：1. 亲和配体选择性结合目标分子：亲和配体是一种具有特异性结合目标分子的生物大分子或化学物质。
通过选择合适的亲和配体，可以实现对目标分子的选择性结合。
2. 层析柱固定亲和配体：亲和配体通常通过共价键或非共价键的方法固定在层析柱的填料上。
固定亲和配体后，层析柱具有了对目标分子的特异性结合能力。
3. 样品溶液通过层析柱：样品溶液中含有目标分子和其他杂质分子。
当样品溶液通过层析柱时，目标分子会与层析柱上的亲和配体结合，而杂质分子则流经层析柱。
4. 目标分子的洗脱和回收：通过改变洗脱缓冲液的条件，可以使目标分子与亲和配体解离，从而实现目标分子的洗脱和回收。
二、常用的亲和层析方法亲和层析方法根据亲和配体的性质和结合方式的不同，可以分为多种不同的方法。
以下是几种常用的亲和层析方法：1. 金属离子亲和层析：利用金属离子与亲和配体之间的配位作用，实现对目标分子的选择性结合。
常用的金属离子包括Ni2+、Cu2+和Zn2+等。
2. 免疫亲和层析：利用抗体与抗原之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
免疫亲和层析广泛应用于生物医学领域，用于分离纯化抗体和抗原。
3. 亲和色谱层析：利用染料、受体或配体等分子与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和色谱层析方法有离子交换层析、亲和柱层析等。
4. 亲和吸附层析：利用亲和吸附剂与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和吸附层析方法有亲和蛋白A/G层析、亲和葡萄糖层析等。
三、亲和层析的应用领域亲和层析作为一种常用的分离纯化方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
亲和层析的原理
亲和层析的原理亲和层析是一种重要的生物分离技术，其原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
在亲和层析中，利用生物分子之间的特异性结合，将目标蛋白或其他生物分子从混合物中分离出来，从而实现其纯化和富集。
亲和层析技术已经成为生物化学和生物技术领域中不可或缺的一部分，被广泛应用于蛋白质纯化、抗体富集、药物筛选等多个领域。
亲和层析的原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
这种相互作用可以是蛋白质与配体之间的结合，也可以是抗体与抗原之间的结合。
在亲和层析中，通常会使用具有特定亲和性的配体或抗体来固定在固定相（如琼脂糖、琼脂糖珠等）上，然后将混合物通过固定相，利用目标分子与固定相上的配体或抗体之间的特异性结合来实现目标分子的分离。
亲和层析的选择性和特异性是其最大的优势之一。
通过选择合适的配体或抗体，可以实现对特定目标分子的高效分离和富集。
此外，亲和层析还可以在温和的条件下进行，避免了对目标分子的结构和活性产生不可逆的影响。
因此，亲和层析在生物分离领域中具有广泛的应用前景。
亲和层析的原理还可以进一步细分为不同的类型，如亲和色谱、亲和吸附等。
在亲和色谱中，通常会利用配体与目标蛋白质之间的特异性结合来实现分离；而在亲和吸附中，则是利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现分离。
这些不同类型的亲和层析技术可以根据具体的实验需求进行选择和应用。
总之，亲和层析作为一种重要的生物分离技术，其原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
通过选择合适的配体或抗体，可以实现对特定目标分子的高效分离和富集。
亲和层析技术在生物化学和生物技术领域中有着广泛的应用前景，对于促进生物分离和纯化技术的发展具有重要意义。
亲和层析
活化凝胶
以偶联时所用的缓冲液洗涤，立即将凝胶放入含 有偶联化合物(配基)的缓冲液中，在4 ℃慢慢搅拌
12小时
偶联的亲和层析吸附剂
活化过程要注意的问题： (1)溴化氰有毒，操作时应注意通风； (2)活化过程会产生大量的热，除加溴化 氰活化载体的过程需在30 ℃反应外，其 他过程均需在冰浴中进行 ； (3)偶联反应后应尽量除净载体上的活化 基团 。 除去载体上的活化基团可用乙醇胺或1－ 氨基－丙烷－2，3－二醇搅拌10小时左右。 然后用水、2mol/L氯化钾依次洗涤后，用 水将氯化钾洗净。
琼脂糖的酰肼衍生物 溴化氰活化琼脂糖在偶联胺类化合物 时形成N－取代的异脲键，仍保留有 氨基的碱性。当介质的pH低于氨基的 pK时，氨基上带有正电荷，使琼脂糖 凝胶衍生物具有了离子交换层析的性 质，增加了非特异性吸附。这一现象 可用制备成酰肼的衍生物而加以解决。
第二步：
处理后的凝胶
2L水室温洗涤。加入0.1mol/L氢氧化钠24 ℃保温
30～40分钟
凝胶
2L水及1L无水二氧六环洗涤脱水后，悬浮在200ml 二氧六环中，加入0.1mol/L的固体N－羟基琥珀酸亚 胺及0.1mol碳二亚胺，室温振摇90分钟，用二氧六 环洗，
亲和吸附剂
偶氮键的偶联：琼脂糖凝胶或其 他载体的偶氮衍生物可以与含有 酚或咪唑基的配基偶联。
每毫升凝胶加80～100μmol叠氮(对位硝基苯甲酰叠氮溶解在二甲 基甲酰胺中，配成0.1mol/L)， 5℃搅拌1小时，室温继续反应3～4 小时。 50％二甲基甲酰胺洗涤后用水洗。悬于0.2mol/L的连二亚硫酸钠 溶液中(用0.5mol/L碳酸氢钠pH8.5配制),混合物在40℃保持1～2小 时，过滤后水洗
2013年8月4日星期日 11
亲和层析的原理与应用
亲和层析的原理与应用1. 什么是亲和层析？亲和层析是一种分离和纯化生物化学物质的技术，它利用生物分子之间特定的相互作用（如抗原和抗体之间的结合）来实现对目标分子的选择性识别和富集。
2. 亲和层析的原理亲和层析的原理基于生物分子的相互作用，其中最重要的是抗原与抗体之间的特异性结合。
该技术依赖于抗体与目标分子之间的亲和作用，并通过将抗体固定在固定相上，使得只有与目标分子结合的物质能够与抗体发生相互作用。
亲和层析分为两个步骤：吸附和洗脱。
在吸附步骤中，样品中的目标分子与固定在固定相上的抗体结合。
而在洗脱步骤中，通过改变洗脱缓冲液的条件，使得与抗体结合的目标分子从固定相上解离，从而得到纯化的目标分子。
3. 亲和层析的应用亲和层析技术在许多生命科学领域中得到广泛应用，以下列举了其中几个常见的应用。
3.1 蛋白质纯化亲和层析可以用于大规模纯化特定蛋白质。
通过使用与目标蛋白质结合的特异性抗体，可以选择性地捕获和纯化目标蛋白质。
这种方法通常比其他纯化方法更简单且更高效。
3.2 药物开发在药物开发过程中，亲和层析可用于筛选和纯化潜在的靶点蛋白和药物候选物。
通过选择与给定药物结合的特异性亲和剂，可以实现对目标蛋白的快速分离和纯化。
3.3 癌症诊断亲和层析技术在癌症诊断中也具有重要应用。
通过使用特定的抗体，可以选择性地捕获和检测癌细胞标记物。
这种技术可用于早期癌症的诊断和监测。
3.4 生物传感器亲和层析可应用于构建生物传感器，用于快速、敏感地检测特定分子的存在和浓度。
通过将与目标分子特异性结合的抗体固定在传感器表面，可以实现对目标分子的选择性识别和定量分析。
3.5 基因工程亲和层析可以用于分离和纯化特定的核酸序列。
通过使用与目标DNA或RNA 序列特异性结合的亲和剂，可以选择性地捕获和纯化目标核酸分子。
4. 结论亲和层析是一种重要的生物分离和纯化技术，基于生物分子之间的特异性相互作用。
该技术广泛应用于蛋白质纯化、药物开发、癌症诊断、生物传感器和基因工程等领域。
亲和层析
亲和层析亲和层析原理生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。
亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。
将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。
通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。
亲和层析的应用点击次数：692 发表于：2008-08-28 21:05转载请注明来自丁香园来源：互联网亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。
下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。
1.抗原和抗体利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。
例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。
在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。
将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。
抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。
可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。
另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。
2.生物素和亲和素生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。
亲和层析分析
酶的名称
醇脱氢酶 3-磷酸甘油醛脱氢酶
己糖激酶 甘油激酶
来源
结合强度* 吸附剂1 吸附剂2
酵母
400
0
兔肌肉
0 >1 mol/L#
酵母
0
0
122
0
*以KCl浓度（mol/L）表示。 #需加5×10-3 mol/L还原辅酶I才能洗脱。
一种专一性的亲和吸附剂只能分离一种酶，虽然效 率高，但使用范围窄，如果能以一类酶的通用配基 制成亲和吸附剂，再仔细选择洗脱条件，将其逐个 分别洗脱下来，可以在短时间内分离纯化几个酶。
主要技术指标： ⑴．配基偶联量：0.5-1.0 (mmol/ml胶)； ⑵．蛋白吸附量：4-6(mg/ml胶)； ⑶．活性回收率：80%左右。
多孔玻璃载体亲和吸附剂的制备
载体先在5％硝酸溶液中煮沸45 min，用水洗涤，在 115℃下烘干，1g干的清洁载体加入75 mL 10%的γ丙氨基三乙氧硅烷，后者溶解在甲苯中，回流12-24 小时，用甲苯、丙酮清洗，空气干燥。
活化载体“接臂”
“接臂”的前提：小分子作为配基，被分离物质是大 分子，空间位阻影响亲和吸附。
具有专一亲和力的生物分子对主要有： 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA 酶与它的底物或竞争性抑制剂 激素（或药物）与它们的受体 维生素和它的特异结合蛋白 糖蛋白与它相应的植物凝集素等
亲和层析的优点
♦ 待分离物质与配基专一性结合，分辨率 高，操作简单，一次操作即可得到较高 纯度的分离物质。
♦ 具有浓缩作用，纯化倍数高达几千倍。 ♦ 分离条件温和，有利于保持物质原有的
例如：SAH（S-腺苷酰-高半胱氨酸）可以作为 RNA、DNA和蛋白质转甲基化酶的通用配基。
转甲基化酶
《亲和层析》课件
流动相可以是缓冲液、有机溶剂等
亲和层析可以分离纯化生物大分子，如蛋 白质、核酸、多糖等
亲和层析的应用广泛，如蛋白质纯化、药 物筛选、生物检测等
03
亲和层析的实验流 程
亲和层析的实验准备
材料准备：亲和 层析柱、缓冲液、 样品、洗脱液等
设备准备：层析 仪、离心机、紫 外分光光度计等
亲和层析的应用领域
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 天然色素等
环境监测：分离 纯化重金属离子、 有机污染物等
化学分析：分离 纯化有机化合物、 无机化合物等
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种分离纯化生物大分子的方 法
原理：利用生物大分子与固定相之间的亲 和力进行分离
06
亲和层析的发展趋 势和展望
亲和层析技术的未来发展方向
提高分离效率：通过改进亲和层 析技术，提高分离效率，降低成 本
智能化发展：结合人工智能技术， 实现亲和层析的自动化、智能化
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扩大应用领域：将亲和层析技术 应用于更多领域，如生物制药、 食品加工等
环保化发展：采用环保材料和工 艺，降低对环境的影响，实现可 持续发展
亲和层析在生物医药领域的应用
蛋白质纯化： 分离、纯化蛋 白质，提高纯
度
药物筛选：筛 选药物，提高 药物研发效率
疫苗生产：分 离、纯化疫苗， 提高疫苗质量
诊断试剂：制 备诊断试剂， 提高诊断准确
性
亲和层析在环境监测领域的应用
土壤监测：检测土壤中的污 染物，如农药残留、重金属 等
大气监测：检测大气中的污 染物，如二氧化硫、氮氧化
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关于亲合层析….
分类：凝集素亲合层析、免疫层析、金
属鏊合层析等
应 用：分离核苷酸、核酸、免疫球蛋白、
膜受体、细胞器等；对于酶蛋白，配体可 以是底物、可逆抑制剂、别构效应物等
透析原理、目的？如何操作？
SDS-PAGE 原理与用途？如何操作？ 蛋白操作应注意哪些事项？ 如何检测酶活？ 蛋白浓缩有哪些方法？
第二部分
电泳技术
电泳技术
琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis ） 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE ) 等电聚焦电泳(IFE: isoelectric focusing ) 双向电泳( 2-DE: two –dimensional electrophoresis ) 毛细管电泳(CE: capillary electrophoresis )
不同浓度分离胶分离蛋白质范围：
15% 12.5% 10% 7.5% 5% 15-45Kd 15-60Kd 18-75Kd 30-120Kd 60-210Kd
思考题
为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的
蔗糖溶液？蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么？
配体 固定相
亲和层析过程
偶联
溶液
杂质
金属螯合层析法
固定相
亲和层析的基本特点
纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物 大分子 纯化倍数大，产物纯度高
必须针对某一分离对象，制备专一的配基及寻求稳 定的层析条件,因此应用范围受到一定的限制
具有特异性亲和作用的生物分子
(4) 活化的羧基琼脂糖凝胶 4B (Activated CH-sepharose 4B)：含有六 碳连接臂和一个活化的酯化基团，可自发地与含有氨基的配基 偶联。 (5) 环氧活化的琼脂糖凝胶 6B (Epoxy-activated sepharose 6B)：含有 一条长的亲水连接臂，可与含有羟基、氨基或巯基的配基偶联。
生化制备技术理论课程
亲合层析（Affinity chromatography )
概 述：
是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力（即 生物学亲和力），建立起来的一种有效的纯化方法。
它经常需要经过一步处理即可将某种所需蛋白质从 复杂的混合物中分离出来，而且纯度相当高。
关于亲合层析….
基本原理：把待纯化的某一蛋白质的特
抗原与抗体
DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)
酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体 维生素与其特异性结合蛋白 糖蛋白与其相应的植物凝集素
亲和层析载体的性质与选择
具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由 通过，具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速 具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共 价合偶联 在偶联、吸附析
在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固 定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析， 达到分离纯化目的。 例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作 为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为
固定相，使样品中的辅酶分离纯化。
一、配基与偶联凝胶的选择与处理
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。 配基必须偶联于不溶性母体(matrix) (又称载体)上，常用
并且进一步与含有：C＝，—C=C—，—N=N—键的化合物反应。
进行亲和层析之前，首先要根据目的物质 的特性，选择与之配对的分子作为配基，然 后根据配基的大小和所含基团等特性选择适 宜的偶联凝胶，再在一定条件下使配基与偶 联凝胶接合。
例如：欲分离某一辅酶，必须选择与之 配对的酶作为配基，由于酶含有氨基，可 选用活化的羧基琼脂糖凝胶4B (Activated CH Sepharose 4B)作为偶联凝胶。再进行 偶联
鸡蛋清
↓
Spharose 4B
↓
猪胰脏
↓
提取
↓
活化
↓
提取
↓
分离纯化
↓
纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B
↓
胰蛋白酶原粗提液
↓
偶 联
↓
激 活
↓
CHOM-Spharose 4B → ←
↓
胰蛋白酶提取液
亲和层析
↓
酶促动力学 ← 纯胰蛋白酶 → 酶活性测定
↓
酶蛋白含量测定
思考题
凝胶层析、离子交换层析、亲合层析原理、用途？ 三者能否重复使用？如何处理？
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率决 定于它所带的净电荷、分子形状和大小，如果在 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷
基磺酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质的
迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来
的电荷和分子形状无关。
附：十二烷基磺酸钠（SDS）
的载体主要有：
琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 纤维素
当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载 体偶联，或不易与配对分子载体结合。为此通常 在载体和配基之间接入不同长度的连接臂(space arm)。 偶联时，必须首先使载体活化。即通过某种方法 (如溴化氰法、叠氮法等)为载体引入某一活泼的 基团。
二、亲和层析的操作条件
亲和柱层析装柱方法与凝胶层析相同，层析操作与离子交
换层析相似。但由于亲和层析的对象都是生物分子，为防止 生物大分子变性，常在低温(4℃)下进行。亲和层析柱所用的
平衡缓冲液应与样品缓冲液一致，pH一般在近乎中性的范围
内。上柱时流速应尽可能缓慢。上柱后，用大量平衡缓冲液 洗去杂质，然后用洗脱液洗脱亲和物。洗脱结束后，继续用 洗脱液洗涤，直至无亲和物为止。 最后用平衡缓冲液使亲和层析柱平衡，即可重复使用。暂 时不用时，亲和层析柱应置于4℃低温保存。
亲合层析原理
配体分子
琼脂糖 凝胶珠 被吸附的 蛋白质分子
连接臂 亲合洗脱
洗涤除去
亲 合 层 析 原 理
亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可 逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互 配的。主要的有： 酶和底物 酶与竞争性抑制剂 酶和辅酶 抗原与抗体 DNA和RNA 激素和其受体 DNA与结合蛋白。
(6) 活化的巯基琼脂糖凝胶 4B (Activated Thiolsepharose 4B)：含有一 分子谷胱甘肽作为连接臂，可与含有游离巯基的蛋白质配基可 逆偶联。 (7) 巯丙基琼糖凝胶 6B (Thiopropyl sepharose 6B)：含有一个较短的 亲水连接臂 (2-巯 丙基)，可与含有巯基的蛋白质或其他小分 子配基可逆偶联，也可以与重金属离子、烷基和芳香基反应，
亲和层析配基的性质与选择
亲和层析配基的选择
纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力，但亲和 力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需 的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配 基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连， 同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力
活化载体
活化载体(包括带连接臂的)已有商品出售。Pharmacia公司出 产的偶联凝胶(coupling gel)可以很简单地与所需的配基偶联，不 需要特殊的设备和复杂的化学反应。常用的有： (1) 溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B (CNBr-activated sepharose 4B)： 通过自发反应可安全 、简便、快速地与含有伯胺基的配基偶联。 (2) 氨基琼脂糖凝胶4B (AH-sepharose 4B)：含有六碳 (C6) 长 度的连接臂，可与含有羧基的配基偶联。 (3) 羧基琼脂糖凝胶4B (CH-sepharose 4B)：含有六碳 (C6) 长 度的连接臂，可与含有氨基的配基偶联。
SDS是一种阴离子变性剂
能够打破蛋白质分子中
的氢键、疏水相互作用，巯基乙醇能够打开二硫键，因 此两者使蛋白质处于伸展状态，同时掩盖了蛋白质的原 有电荷，使不同的样品带有接近相同的负电荷和接近相 同的分子形状，因此迁移率只与分子量大小有关
浓缩胶:浓缩样品 分离胶:分离样品
垂 直 板 电 泳