单个细胞分离技术PBMC
PBMC提取
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。
其中淋巴细胞占很大一部分。
分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。
吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
注意事项全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。
否则将分层混乱。
步骤：配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。
然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。
离心完毕将得到如图所示分层；PBMC所在细胞层为白色。
此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。
e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。
分子医学实验：PBMCs的分离和计数
PBMCs的分离和计数
实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的和要求
• 掌握PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)分离的方法 • 掌握细胞计数的方法
实验原理
外周血中细胞种类
细胞密度
红细胞和多核白细胞
1.092-1.093
PBMC(淋巴细胞和单核细胞)
1.074
淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypague 1.077
不着色）
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离PBMCs：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
• 稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上 ，使两者形成一个清晰地界面。
• 细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形 成的细胞层。
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
细胞计数
用100ulHank’s液重悬细胞
取10ul细胞悬液+40ul Hanks'液 +50ul台盼兰, 混匀
取10ul于细胞计数板上
进行细胞计数
实验结果计算
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 2个大方格内细胞总数 ×104×稀释倍数
2
细胞活力检测：（台盼兰染色：死细胞被染成蓝色，活细胞
实验步骤
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
肝素抗凝静脉血1-1.5
ml 加等体积的Hank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
(交界液面：一定不要打乱)
离心（2000rpm， 25min）
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
pbmc细胞
pbmc细胞PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell）即外周血单个核细胞，包括外周血中的淋巴细胞、单核细胞和浆细胞。
它们在免疫系统中起着重要的作用，对于维持人体免疫反应的平衡至关重要。
本文将介绍PBMC细胞的特点、分离方法以及其在科研和临床应用中的意义。
一、PBMC细胞的特点PBMC细胞是一类具有明显异核的淋巴细胞，包括单核细胞和浆细胞等。
它们存在于外周血液中，由于其特殊的形态结构以及免疫功能，被广泛应用于免疫学研究和临床诊断。
二、PBMC细胞的分离方法PBMC细胞的分离通常采用密度梯度离心法。
具体步骤如下：1. 收集外周血样本，使用抗凝剂稳定血液。
2. 将血液轻轻慢慢倒入离心管中。
3. 加入相应比例的生理盐水或离心液，轻轻混合，保证离心液平稳沉淀。
4. 将离心管置于离心机中，根据不同实验要求选择合适的离心速度和离心时间。
5. 取出离心管，观察离心液的分层情况。
6. 用移液器小心地取出中间的乳状层，该层为PBMC细胞层。
7. 将PBMC细胞层移至新的离心管中，加入培养基进行后续实验或研究。
三、PBMC细胞的应用意义PBMC细胞在免疫学研究和临床应用中具有重要的意义。
1. 免疫学研究PBMC细胞可用于体外实验，研究细胞介导的免疫反应机制，评估不同物质对免疫系统的影响。
例如，通过研究PBMC细胞的细胞因子产生水平，可以评估特定免疫刺激对机体免疫功能的激活情况。
2. 免疫功能评估PBMC细胞可以用于评估疾病患者的免疫功能状态。
通过检测PBMC细胞中各类免疫指标的表达水平，可以评估免疫系统的活性和功能状态，为临床诊断提供参考依据。
3. 细胞治疗PBMC细胞在细胞治疗中也有广泛应用。
例如，通过采集患者的PBMC细胞，经过体外扩增和处理后，再注入患者体内，可以增强患者的免疫反应和抗肿瘤能力，达到治疗的效果。
四、结语PBMC细胞作为外周血单个核细胞的代表，具有重要的免疫学意义。
ficoll密度梯度离心法分离pbmc
ficoll密度梯度离心法是一种常用的细胞分离技术，尤其在分离外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）时被广泛应用。
该技术通过梯度离心的原理，能够将不同密度的细胞分离开来，从而得到高纯度的目标细胞。
本文将从原理、操作步骤及应用方面对ficoll密度梯度离心法分离PBMC进行介绍。
一、原理1. ficoll密度梯度离心法的原理ficoll密度梯度离心法是基于不同细胞在不同密度梯度离心条件下会沉降到不同层级的原理。
ficoll是一种聚合物，在水溶液中形成梯度，形成浓度递增的梯度。
当混有不同密度的细胞悬液样本在ficoll梯度上离心时，密度较高的细胞沉淀到ficoll浓度较高的层次上，而密度较低的细胞则会沉淀到ficoll浓度较低的层次上，从而实现了不同细胞的分离。
2. ficoll密度梯度离心法分离PBMC的原理在分离PBMC时，PBMC是由淋巴细胞和单核细胞组成的一种混合细胞悬液。
在ficoll密度梯度离心法中，PBMC会在ficoll的适当浓度层次上形成特定的固定位置，而其他细胞则会分布在不同的ficoll浓度层次上。
通过调整ficoll梯度的浓度，即可使PBMC在特定位置上沉淀，从而实现PBMC的分离。
二、操作步骤1. 制备ficoll梯度液将ficoll粉末加入等体积的PBS缓冲液中，充分溶解并混匀，得到ficoll梯度离心所需的溶液。
2. 取样、稀释取外周血样本，加入适量的PBS缓冲液稀释，使细胞密度均匀并不超出离心设备的容量。
3. 加样将稀释后的外周血样本缓慢地加入到制备好的ficoll梯度液上，避免产生气泡并保持悬液的均匀性。
4. 离心分离将加样后的离心管放入离心机中，进行高速离心。
离心过程中，细胞会根据密度在ficoll梯度上分层沉淀，形成不同层次的细胞带。
5. 取样离心结束后，用吸管或移液器沿着管壁取下PBMC所在的ficoll层次，并转移至新的离心管中。
单个细胞分离技术PBMC概要
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
• 在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数， 计算其存活率：使用血细胞计数器：
细胞存活率 = ×100% 活细胞数+死细胞数 200 例如：活细胞总数为 120个，存活率为：60%； 若活细胞计数为180个，存活率：90%
活细胞数(N)
【临床意义】
分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一， 是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作； 是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。 分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要， 不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，
取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl， 混匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻， 置显微镜高倍镜下观察。计数200个单个核细胞 分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式， 报告活细胞存活率。
【结果判定】
活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入 细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
pbmc分离步骤
pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。
•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。
•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。
3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。
•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。
•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。
4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。
5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。
6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。
•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。
注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。
•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。
•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。
这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。
密度梯度离心法分离PBMC操作流程
密度梯度离心法分离PBMC操作流程密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是一种常用的方法，用于将外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）从全血中分离出来。
该方法通过利用血细胞的不同密度来实现分离，从而获得单个核细胞。
以下是密度梯度离心法分离PBMC的详细操作流程：1.准备所需材料和设备：包括离心管、离心机、无细胞培养基、PBS缓冲液、密度梯度离心液。
2.使用无菌的方法处理全血样本，以防止可能的污染。
3.将含有全血的离心管放置在室温下静置一段时间，使其形成明显的三明治结构，由于样本中的红细胞比其他细胞密度更大，红细胞将沉积在管底部。
4.使用无菌的方法，将全血缓慢倒入预先准备好的无菌离心管中，注意不要把红细胞底层的部分连同上层血浆一同倒入，只取上清层部分。
5.将上清层的全血样本缓慢地转移至一个新的无菌离心管中。
6.向离心管中加入与全血样本体积相等的PBS缓冲液，充分搅拌混匀。
7.将密度梯度离心液缓慢地倒入离心管中，注意避免形成气泡。
8.将离心管放入离心机中，设定合适的离心参数，如离心速度和离心时间。
一般采用400-500g，离心时间为20-30分钟。
离心完成后，你将看到细胞在离心管中形成了几个不同层次。
9.使用无菌的方法，将上清层液体小心地转移至新的离心管中。
在转移过程中，避免吸入其他层次的细胞。
10.将离心管用无菌PBS缓冲液冲洗一次，以去除残余的密度梯度离心液。
11.将PBMC的悬浮细胞沉淀至离心管底部，去除上清液。
12.向沉淀细胞加入足够量的细胞培养基，轻轻搅拌使细胞均匀分散。
13.对PBMC进行细胞计数，以确定细胞数目和浓度。
14.根据实验需求，进行后续的细胞培养、染色、分析等操作。
需要注意的是，在操作过程中，需要注意无菌操作，以避免细胞的污染和损伤。
此外，离心参数和离心时间也需要根据具体实验要求进行调整。
pbmc细胞提取方法精选全文
可编辑修改精选全文完整版pbmc细胞提取方法PBMC细胞提取方法引言PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血中的单个核细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和NK细胞等，是研究免疫学、血液疾病和感染病原体等领域的重要细胞来源。
本文将介绍一种常用的PBMC细胞提取方法，旨在为研究者提供一种可行的操作步骤。
材料与试剂1. 外周血样本：新鲜采集的外周血样本（推荐使用抗凝剂如EDTA 进行处理）。
2. PBS缓冲液：含有2 mM EDTA的磷酸盐缓冲液。
3. 密度梯度离心液：如Ficoll-Paque Plus。
步骤1. 收集外周血样本使用适当的采血针和抗凝管收集外周血样本，避免血液污染和凝固。
2. 加入PBS缓冲液将外周血样本转移到15 ml离心管中，每1 ml外周血加入2 ml预先加热的PBS缓冲液，缓慢混合。
3. 密度梯度离心将外周血样本缓慢地均匀地加入到15 ml离心管中含有密度梯度离心液的管内，避免悬浮。
注意，加入的体积应不超过离心管的80%。
然后，轻轻离心管以保持梯度的稳定性。
4. 离心分层PBMC将离心管置于离心机中，以400g的速度离心30分钟。
离心后，可以看到形成三个不同的层次：上层为透明的血清，中间为白色的PBMC层，底层为红色的红细胞。
5. 收集PBMC层使用长颈的移液器，小心地收集PBMC层，避免污染或干扰其他层次的细胞。
将PBMC转移至新的离心管中。
6. 洗涤PBMC向PBMC悬浮液中加入PBS缓冲液，并以1000g的速度离心10分钟。
倒掉上清，避免损失PBMC。
重复此步骤两次以彻底洗涤PBMC。
7. 计数和保存PBMC使用细胞计数板或自动细胞计数器计数PBMC的数量，根据实验需求调整细胞浓度。
根据实验需要，将PBMC悬浮液分装到冻存管中，添加适当的冻存液，迅速冷冻保存。
结论PBMC细胞提取是一种常用的实验操作步骤，通过密度梯度离心的方法，可以有效地从外周血中分离出PBMC。
单个细胞分离技术PBMC
多组学分析
结合基因组、转录组、蛋白质 组等多组学分析，深入揭示 PBMC在生理和病理状态下的 分子机制。
临床转化研究
加强PBMC分离技术的临床转 化应用，推动其在疾病诊断、 治疗和预后评估等方面的实际 应用。
伦理和社会问题
关注PBMC分离技术的伦理和 社会问题，确保研究遵循相关 法规和伦理准则，保护受试者 的权益和隐私。
单个细胞分离技术（C
目
CONTENCT
录
• 引言 • PBMC的分离方法 • PBMC的应用领域 • PBMC分离技术的挑战与展望 • 结论
01
引言
目的和背景
研究细胞类型和功能
PBMC分离技术用于研究人体内不同免疫细胞的类型、功能和相 互作用，有助于深入了解免疫系统的运作机制。
疾病诊断和治疗
PBMC分离技术为免疫学、生物学和医学研 究提供了重要的基础，使得科学家能够深入 研究单个细胞的特性和功能。
药物研发
PBMC分离技术为药物研发提供了实验模型 ，有助于筛选和验证药物的疗效和安全性。
对未来研究的建议和展望
01
02
03
04
技术创新与优化
进一步探索和开发更高效、准 确的PBMC分离技术，提高细 胞纯度和回收率。
个体化用药
根据患者PBMC的反应差异，可 以为患者选择合适的药物和剂量， 实现个体化用药。
04
PBMC分离技术的挑战与展望
细胞活性与纯度问题
细胞活性
在分离过程中，PBMC的活性可能会受到影响，导致其功能和代谢活动的改变。 为保持细胞活性，需要优化分离条件，如选择适当的抗凝剂、离心速度和时间等 。
流式细胞分离法
总结词
一种高效、快速的分离技术
外周血单个核细胞分离方法
外周血单个核细胞分离方法外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是一类重要的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。
它们在免疫反应、炎症、感染和肿瘤等过程中起着重要作用。
因此，从外周血中分离出单个核细胞对于许多研究项目非常重要。
本文将介绍几种常用的外周血PBMCs分离方法，并详细描述它们的步骤和应用。
方法一：梯度离心梯度离心是最常用的PBMCs分离方法之一、它利用了外周血中不同细胞的密度差异，通过离心使PBMCs在浓度梯度上进行分离。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入离心管中。
2. 向离心管中缓慢加入等体积的稀释液，常用的等体积稀释液有Ficoll-Paque、Lymphoprep等。
3. 将稀释液中的血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
一般来说，1200rpm离心10分钟即可。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的界面上，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
8.向细胞沉淀中加入培养基，使其重悬。
这种方法的优点是简单、快速，可以同时分离出不同类型的免疫细胞。
缺点是离心的条件需要根据具体实验要求进行调整，有些细胞如自然杀伤细胞可能会受到损伤。
方法二：抗凝血液管离心另一种常用的PBMCs分离方法是使用抗凝血液管。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入含有抗凝剂的抗凝血液管中，常用的抗凝剂有EDTA、肝素等。
2.轻轻颠倒血液管使血液与抗凝剂充分混合。
3.将血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的底部，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
大鼠pbmc分离的量
大鼠pbmc分离的量1.引言概述大鼠外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）的分离是生物医学研究中常用的技术之一。
PBMC主要由淋巴细胞、单核细胞和少量的自然杀伤细胞组成。
分离PBMC可以提供大量的细胞来进行免疫学研究、细胞培养和药物筛选等实验。
分离大鼠PBMC的关键步骤是通过密度梯度离心的方法来分离淋巴细胞和单核细胞。
在此过程中，外周血液样品中的全血会先经过稀释处理，然后被缓慢地滴加到密度梯度离心管中。
接着，离心管将被放置于离心机中进行高速离心，离心的时间和离心速度会使血液中的不同细胞沉降到不同的位置。
最终，我们可以通过管中的沉淀层将PBMC分离出来。
PBMC分离技术的成功与否对后续实验的质量和准确性具有重要影响。
因此，在进行大鼠PBMC分离之前，需要严格控制实验条件和操作技巧，确保样品的完整性和纯度。
此外，为了增加分离PBMC的收率，也可以调整密度梯度离心液和离心的速度等参数。
总之，大鼠PBMC的分离是一项关键的技术，对于研究和应用免疫细胞生物学具有重要的意义。
通过合理使用该技术，我们可以获得高质量的PBMC，用于进一步的免疫学或临床研究。
（以上为文章1.1 概述部分的内容，仅供参考）1.2 文章结构文章结构部分的内容可以从以下几个方面进行编写：本文将按照以下结构进行阐述：1. 引言：首先，简要概述大鼠PBMC分离的重要性和应用背景，介绍PBMC的定义和重要性，以及本文的目的和意义。
2. 正文：2.1 第一要点：在本部分，详细介绍大鼠PBMC分离的方法和步骤。
包括样本的收集、处理和分离PBMC 的技术原理和步骤。
同时，可对常用的离心分离法、密度梯度离心法和磁珠分离法进行介绍和比较，分析各种方法的优缺点和适用范围。
可以附上操作流程图以方便读者理解。
2.2 第二要点：该部分可进一步探讨大鼠PBMC分离后的应用领域和相关研究进展。
比如，可以介绍在免疫学研究中，大鼠PBMC的应用，如体外诱导成熟巨噬细胞、淋巴细胞增殖实验以及细胞因子的检测等。
sepmate法分离pbmc
一、什么是sepmate法分离PBMC？sepmate法（全称Seperation Mate法）是一种用于分离周围血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，简称PBMC）的技术。
PBMC是一种在免疫学和临床研究中广泛应用的重要细胞类型，它们可以提供关于免疫系统功能和疾病发病机制的重要信息。
sepmate法可以快速、高效地从血液样本中分离出PBMC，为细胞学研究提供了方便和可靠的实验手段。
二、sepmate法分离PBMC的原理是什么？sepmate法的分离原理基于PBMC在密度梯度离心过程中与其他血液组分分离的特性。
密度梯度离心是利用不同密度的介质将细胞分离的一种常用技术。
在sepmate法中，将血液样本加入到密度梯度离心介质中后，通过离心分离出一层PBMC，从而实现了对PBMC的分离。
三、sepmate法分离PBMC的步骤是怎样的？1. 准备血液样本：首先需要从受试者采集血液样本，一般采用静脉血采集方式。
2. 密度梯度离心：将采集到的血液样本加入到密度梯度离心介质中，然后进行离心分离。
在离心过程中，PBMC会分布在介质中的特定位置形成一层。
3. 收集PBMC层：离心结束后，用移液器从介质上层收集PBMC，然后进行相关的实验操作和存储。
四、sepmate法分离PBMC的优势有哪些？1. 高效性：sepmate法分离PBMC的效率高，可以在短时间内从大量的血液样本中分离出足够数量的PBMC。
2. 纯度高：通过sepmate法分离的PBMC通常具有较高的纯度和活力，适用于多种细胞学实验。
3. 操作简便：sepmate法操作简单，无需复杂的设备和特殊的操作技能，适合于实验室中的常规操作。
4. 可重复性好：经过标准化的操作流程，sepmate法分离PBMC的结果具有较好的可重复性，有利于实验结果的准确性和可靠性。
五、sepmate法分离PBMC的应用领域有哪些？sepmate法分离PBMC广泛应用于免疫学、癌症研究、感染性疾病研究、器官移植免疫监测等领域。
4.PBMC分离
外周血单个核细胞(PBMC)
包括淋巴细胞和单核细胞。
是免疫学实验最常用的细胞，也是T、B细胞分
离纯化的第一步。
常用分离方法：聚蔗糖-泛影葡胺(FicollUrografin)密度梯度离心法
1
2
2
1
1
2000rpm 20min
1
1000rpm 3 3 3 10min
3
方 法
稀释的抗凝静脉血1ml 取一只玻璃试管，加入1ml淋巴细胞分离液；转移血标 本于淋巴细胞分离液上层（注意：保持液面完整) 离心，2000rpm，20min 吸取单个核细胞（中间白膜层），转移至一新试管中
加入5倍量D-Hank’s ，混匀，离心，1000rpm，10min
弃上清，留少许重悬沉淀 滴一滴细胞悬液于载玻片上，盖盖玻片，镜下观察
结 果
(一)
血浆 PBMC 分离液 PMN RBC
(二) 镜下观察结果
实验报告
外周血单个核细胞(PBMC)的分离
方法、原理、步骤、结果
原 理
聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 比重为1.077±0.001
红细胞、粒细胞比重1.09；
淋巴细胞和单核细胞的比重1.075
稀释抗凝血
血浆 单个核细胞
淋巴细胞分离液
凝兔子外周血 淋巴细胞分离液 D-Hank’s液 试管、吸管等
pbmc分离关键
pbmc分离关键PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）是一种重要的免疫细胞类型，对于研究免疫学、细胞治疗和药物筛选等领域具有重要意义。
正确高效地分离PBMC是进行这些研究的基础步骤之一。
本文将介绍PBMC的分离关键技术和步骤，以期为相关研究提供参考。
一、材料准备在进行PBMC分离前，需要准备以下材料：1. 外周血样品：获取血样需要经过伦理审批，并且操作人员需要具备相应的培训和防护措施。
2. 无菌离心管：用于收集血样和分离PBMC。
3. 无菌PBS缓冲液：用于稀释血样和洗涤PBMC。
4. Ficoll-Paque密度梯度离心液：用于分离PBMC和其他血细胞。
5. 离心机：用于离心操作，选择适当的离心机型号和转速。
二、PBMC分离步骤步骤一：稀释和混匀将外周血样品放入无菌离心管中，并用无菌PBS缓冲液稀释样本。
稀释比例通常为1:1或1:2，可根据实验需求进行调整。
然后，轻轻反复混匀，确保血液和缓冲液充分混合。
步骤二：制备密度梯度离心液将适量的Ficoll-Paque密度梯度离心液放入另一个无菌离心管中。
具体用量需要根据血液样本的体积进行计算，通常为血液样本体积的一半或三分之二。
制备好后，将离心管轻轻摇晃来均匀混合。
步骤三：层析离心将混匀后的外周血样品缓慢倾倒至含有Ficoll-Paque离心液的无菌离心管中，确保两者不混合。
注意避免气泡的产生。
倾倒完成后，离心管中会出现明显的三个层次：上层为血浆，中间层为白细胞和单核细胞，下层为红细胞。
步骤四：离心将离心管放入离心机中，调整适当的离心参数。
常规情况下，离心速度为400×g，离心时间为20分钟。
离心过程结束后，离心管中的PBMC将沉淀在管底。
步骤五：收集PBMC将上层血浆和下层红细胞倒出，只留下中间层的PBMC。
尽量避免将红细胞和离心液残留物带到PBMC中。
三、注意事项1. 操作要严格遵循无菌操作规范，保证样品的纯度和可靠性。
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临床免疫学实验指导
海南医学院
实验六 单个核细胞分离及细胞免疫功能检测 【实验目的】 1.熟悉淋巴细胞分离方法 2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义
T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的 单个核细胞（L, M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞
（CTL或TC）发生特异性细胞毒效应.
计数池区域 一个计数全池 大方格 白细胞中方格 红细胞中方格 红细胞小方格 边长（mm） 3 1 0.25 0.20 0.05 面积（mm2） 池深（mm） 9 1 0.0625 0.0400 0.0025 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 体积（mm3 ul） 0.90 0.10 0.00625 0.00400 0.00025
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值： 60%-80%
由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显
结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。
T细胞总数测定——Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）
人类T细 胞的主要 标志 的CD2、 CD3和 TCR均 能吸附 绵羊红 细胞于淋 巴周
围，形
4个大方格内 细胞总数 4 × 稀释倍数 ×104
单个核细胞总数/ml=
单个核细胞总数/ml = X/4×10×(稀释倍数) ×103 =X×104 关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤 离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。
此缓冲液中的单个核细胞密度。
细胞存活率检测
静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。
具体计数方法如下：
▲
血细胞计数池的构造
1. 大方格
9个
2. 中方格分2种 WBC计数区分16个
RBC计数区分25个
3.小方格1种， 是指RBC计数区 的1个中方格又分 16个小方格，即：
计数池内有：1种
大方格；2种中方 格；1种小方格 池深 0.1mm
血细胞计数池的构造参数 4种方格的体积（容积）
也用于进一步纯化淋巴细胞，进行淋巴细胞分类，分群，
表面抗原，各种标志物以及其他淋巴细胞功能测定等。
实验报告：
1. 报告单个核细胞计数总数结果 2. 报告单个核细胞存活率 3. 简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理 4. 分离单个淋巴细胞的临床意义 T细胞总数测定：Et花环实验。学生课余自学内容。
取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl， 混匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻， 置显微镜高倍镜下观察。计数200个单个核细胞 分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式， 报告活细胞存活率。
【结果判定】
活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入 细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测
• 在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数， 计算其存活率：使用血细胞计数器：
细胞存活率 = ×100% 活细胞数+死细胞数 200 例如：活细胞总数为 120个，存活率为：60%； 若活细胞计数为180个，存活率：90%
活细胞数(N)
【临床意义】
分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一， 是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作； 是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。 分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要， 不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，
留取约50μl,加缓冲液至1.0ml，稀释20倍
末次离心后，弃去上清液。加含10%灭活小牛血清/HanK‘s液 加至1.0ml，混匀，灌入血细胞计数池，单个核细胞计数， 于低倍镜下计数4个角大格内细胞总数。
计数细胞方法
加样： 将淋巴细胞悬液混匀，吸取10μl加入到 40μl含10%灭活小牛 血清的Hank’s液中，混匀后再吸取10μl充入计数板上。 细胞悬液稀释5倍。此稀释也可省略，可根据细胞密度而定
成花瓣 样排列 称为E花 环实验。
实验报告：
1. 报告单个核细胞计数总数结果 2. 报告单个核细胞存活率 3. 简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理 4. 分离单个淋巴细胞的临床意义
实验课结束啦！ 可以轻松的 玩一玩啦！
临床上反复感染者和肿瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有 细胞免疫缺陷，必须进行细胞免疫缺陷的检测，而这种检查的 第一步就是单个核细胞的分离，计数。然后进行功能检查。
一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）
（一）葡聚糖—泛影葡胺法分离单个核细胞
• 密度梯度离心法：水平离心机，逐渐加速，自然停转
1.分离液：葡聚糖-泛影葡胺混合液（比重1.075～1.092之间） 将分离液，加入抗凝血中离心，离心后不同比重的血细胞在分 离液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。 ◆红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），分布于最底层， ◆单核细胞比重较小（1.075～1.090），分布于血浆与分离液的 交界处。界限清楚，层次分明。将该层细胞吸出，即为单个核 细胞（主要为淋巴细胞） ◆血浆和血小板位于最上层。血小板在血浆中下部 2. Hanks缓冲液：（ pH 7.2-7.4,无Ca、Mg离子） 3. 0.4%台盼蓝染液
肝素抗凝血2ml +Hank’s液2ml液稀释
方法
沿管壁缓慢加入到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中 (不能破坏二者的液面）,2000r/min 离心20min 吸出淋巴细胞层加入另一试管中，加3～4ml Hank’s液， 混匀离心洗涤， 1500r/min 离心10min 弃去上清，再加3ml Hank’s液，混匀， 1500r/min 10min，重复洗涤2次 重复1次
梯度离心法——分离提取单个核细胞
稀释血浆 内含血小板 2000rpm/ 20-30min
单个核细胞
分离液
粒白膜层，沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试管内 加入PBS洗液3-4ml，离心洗涤2次，1500/r,10min. 弃去上清，留约50μl. 加含有10%灭活小牛血清-PBS液1.0ml，混匀充池，镜下计数。