原代细胞培养之--细胞分离技术

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乳鼠肾细胞原代培养边晔

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乳鼠肾细胞的原代培养生05 边晔 2010030026周二班同组同学:解智博实验时间 2012年11月12日一、实验背景1.细胞分离技术根据所取组织可分为:离心分离法(细胞外液环境);机械分离法(如切割,挤压等);化学分散法(如酶);细胞表面抗原等。

2.培养细胞的纯化自然纯化;人工纯化。

人工纯化又包括酶消化法,反复贴壁法,机械刮除法,克隆法,培养基限定法,流式细胞仪等。

3.细胞冻存与复苏基本原则:慢冻快融。

二、实验步骤1.取出肾脏1)将乳鼠(3天左右)用剪刀断头放血致死。

2)进入无菌间,用70%乙醇消毒乳鼠体表,将其固定在蜡盘上。

3)在超净台内,将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口,然后将皮肤拉开,固定在蜡盘上,使其腰背部肌肉暴露出来。

4)用70%乙醇消毒背部肌肉,在脊柱两侧各剪一切口,取出肾脏,置于盛有 PBS溶液的平皿中。

(由于肾太小不易操作,故未除去肾膜与脂肪等)5)纵向将肾脏剪开(除去肾盂)。

将肾脏剪成数块,用PBS溶液再洗涤一次。

6)吸弃PBS溶液,将肾脏剪碎(小而均匀,肉泥状)。

2.消化法原代培养1)加入0.5mL 胰酶—EDTA溶液,于37℃消化15分钟,直至组织块变白、呈疏松状(镜检可见分散细胞)。

2)加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化,将枪头顶住皿底反复“吹打”分散细胞。

3)实际试验中并没有出去任何大块组织(结果证明得到很多细胞,应该是损失较少)。

1000rpm离心10min;弃上清。

4)加入PBS溶液重复洗涤、离心一次。

5)加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞;取20μl细胞悬液进行细胞计数(由于细胞太多,故放弃计数)。

6)将剩余980μl细胞悬液加入到10mL培养瓶中,补加血清DMEM培养基到终体积为1.5ml。

37℃、5% CO2培养。

7)第三天(周四)上午,更换全部培养液。

8)下个周一,进行传代培养。

3.整理:1)取肾后,将鼠尸体置于专门的垃圾袋中。

2)蜡盘、大头针用洗干净后,浸泡于酒精中。

原代细胞的培养方法

原代细胞的培养方法

原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法是指将从活体组织中分离出的未经连续传代或只进行过有限传代的原代细胞,在无菌条件下进行体外培养的技术。

以下是一般的原代细胞培养方法:
1. 组织分离:从生物体中取得需要培养的组织,如肺、肾等。

将组织切碎或用酶消化等方法进行细胞的分离。

2. 细胞悬浮液制备:将分离得到的细胞以适当的培养基和缓冲液混合,形成细胞悬浮液。

3. 培养基准备:根据细胞类型的不同,选择适当的培养基,并添加必要的营养物质、生长因子和抗生素等。

4. 培养皿涂层:将培养皿表面涂覆一层适当的基质,如胶原、明胶等,以促进细胞附着生长。

5. 细胞接种:将细胞悬浮液均匀地加入培养皿中,使细胞附着在培养皿表面。

6. 培养条件:将培养皿放入恒温培养箱中,控制适当的温度、湿度和气体组成等条件,提供细胞正常生长所需的环境。

7. 培养液更换:定期更换培养液,补充必要的营养物质和生长因子,以保持细胞的生长和增殖。

8. 细胞观察和记录:定期观察和记录细胞的形态、增殖情况和细胞数量等,评估细胞的健康状态。

需要注意的是,不同类型的细胞可能有特定的培养要求,如培养
基成分、pH值、气体组成、温度和湿度等。

因此,在进行原代细胞培养时,应根据具体的细胞类型和研究目的,选择合适的培养条件和方法。

动物细胞培养技术

动物细胞培养技术

动物细胞培养技术动物细胞培养技术是生物学领域中的一项重要技术,它可以帮助科学家们研究动物细胞的结构、功能和生理过程。

通过培养动物细胞,科学家可以模拟生物体内的生理环境,从而更好地理解细胞的生物学特性。

本文将介绍动物细胞培养的基本原理和常用的培养技术。

一、动物细胞培养的基本原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出并在体外特定的培养基中进行培养的过程。

培养基是一种模拟生物体内环境的营养液,它提供了细胞所需的必要营养物质和生长因子。

在培养基中,细胞可以获得适当的营养和生长条件,从而保持其生物学特性并进行增殖。

动物细胞培养的基本原理包括以下几点:1. 细胞来源:细胞可以来源于动物组织、器官或体液中,常用的细胞来源包括胎儿组织、胚胎组织、肿瘤组织等。

2. 细胞分离:细胞从组织中分离的方法通常包括机械分离、化学分离和酶解分离。

分离后的细胞可通过离心等方式得到单个的细胞悬液。

3. 培养基选择:根据细胞的特性和要求,选择合适的培养基。

培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基,无血清培养基常用于细胞实验室中。

4. 细胞培养条件:通过调整培养温度、湿度、pH值、氧气含量等条件,提供合适的环境促进细胞的生长和增殖。

5. 细胞传代:当细胞达到一定密度时,需要进行细胞传代以保持其活力。

传代的方法通常是将细胞分散至新的培养容器中,以维持细胞的适宜密度。

二、常用的1. 无血清培养技术:无血清培养基是一种不含胎牛血清的培养基,通过添加人工合成的生长因子和营养物质来满足细胞的生长需求。

无血清培养技术避免了胎牛血清中含有的未知因子对实验结果的干扰,提高了实验的可重复性。

2. 原代细胞培养技术:原代细胞培养是将从动物体内直接获得的组织进行分离和培养。

这种方法可用于细胞的初次培养和研究。

但由于原代细胞在培养中只能进行有限的传代,其使用寿命较短,因此需要定期重新取材。

3. 细胞系的建立:细胞系是细胞通过传代培养,并保持了一定生物学特性和遗传稳定性的细胞群。

细胞培养方法与步骤

细胞培养方法与步骤

细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。

细胞培养可用于各种实验研究,如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。

细胞培养的方法多种多样,下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。

一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。

原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤,一般需要一定的技术和设备。

步骤:1.组织分离:从动物或人体中取得组织,如肝脏、心脏等,并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。

2.细胞分离:将组织切割成小块,并用胰蛋白酶或胰酶进行消化,使细胞分散。

3.细胞收集:用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片,将细胞收集到离心管中。

4.离心:将离心管放入离心机中进行离心,分离出细胞沉淀。

5.细胞培养:将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中,然后转移到培养皿中进行培养。

二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。

步骤:1.细胞传代:细胞达到一定密度后,用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化,将细胞分离。

2.细胞计数:用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数,得到细胞浓度。

3.细胞培养:将分散的细胞与新鲜的培养基混合,然后转移到培养皿中进行培养。

4.细胞增殖:培养皿中的细胞经过一段时间的培养,可以看到细胞开始增殖,形成细胞集落。

5.细胞传代:当细胞集落接近充满培养皿时,需进行细胞传代,即将细胞分散到新的培养皿中。

6.细胞冻存:当细胞达到所需数量后,可以进行细胞冻存,以备之后的使用。

三、细胞培养技术要点1.无菌操作:细胞培养需要在无菌条件下进行,避免细菌或真菌的污染。

操作前需做好洗手消毒,使用无菌操作台,并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。

2.培养液选择:根据不同细胞的需要,选择适合的培养基和生长因子,以提供细胞的生长所需的营养物质。

3.培养条件控制:温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响,需根据具体要求进行调节。

4.细胞检测:在细胞培养过程中,需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标,以确保细胞的正常生长和状态。

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,广泛应用于组织工程、再生医学等领域。

原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。

本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。

一、实验材料1.骨髓样本:取自健康志愿者或实验动物(如大鼠、小鼠等)。

2.PBS缓冲液:磷酸盐缓冲液,用于细胞洗涤和分离。

3.胎牛血清:用于细胞培养。

4.抗生素:如青霉素和链霉素,用于细胞培养液中,防止细菌感染。

5.细胞分离液:如Ficoll分离液、Percoll分离液等。

6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。

二、分离方法1.骨髓样本采集:在无菌条件下,从志愿者或实验动物体内抽取骨髓,置于含有抗凝剂的离心管中。

2.骨髓细胞分离:将骨髓样本用PBS缓冲液稀释,然后缓慢加入细胞分离液,进行密度梯度离心。

离心后,收集界面层的细胞,即含有骨髓间充质干细胞的一层。

3.细胞洗涤:用PBS缓冲液洗涤细胞,去除残留的分离液和红细胞。

4.细胞计数:用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数,调整细胞浓度为合适的值。

5.细胞接种:将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中,置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

三、提取方法1.原代培养:将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养,待细胞生长至80%-90%汇合时,进行传代。

2.传代培养:将原代细胞用胰蛋白酶消化,然后按照1:2或1:3的比例进行传代。

传代后的细胞继续培养至所需细胞量。

3.细胞冻存:将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存,以备后续实验使用。

4.细胞复苏:将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化,然后用细胞培养液重悬,继续培养。

四、注意事项1.在实验过程中,严格遵循无菌操作原则,防止细胞污染。

2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行,以保持细胞活性。

3.选择合适的细胞分离液和离心条件,以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。

细胞培养的基本方法-细胞分离技术

细胞培养的基本方法-细胞分离技术

细胞培养的基本方法-细胞分离技术细胞分离技术一、从原代组织中分离细胞将组织块分离(散)成细胞悬液的方法有多种,最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。

从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。

细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。

下列步骤可以解聚整个组织,获得较高产量的有活性细胞。

1. 胰蛋白酶(Trypsin)•在去除不需要的组织后,使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片,通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。

让组织碎片沉淀,去除上清液。

重复清洗2到3次。

•将盛有组织碎片的容器置于冰上,去除残留的上清液。

加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶(100mg组织加入1ml胰蛋白酶)。

•在4C孵育6到18小时,使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。

•移弃组织碎片中的胰蛋白酶,在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。

•在组织碎片加入热的完全培养基,用移液管轻轻地分散组织。

如果使用无血清培养基,要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。

•通过无菌不锈钢丝网(100〜200mm过滤,分散所有剩余组织。

计数和接种细胞,进行培养。

2. 胶原酶(Collagenase)•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片,用Hanks'平衡液(HBSS清洗组织碎片几次。

•加入胶原酶(50〜200单位/ml,溶解在HBSS中)。

•在37C孵育4到18小时。

加入3mM CaCI2增加解离效率。

•通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。

如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的胶原酶。

•通过离心在HBSS中清洗悬液几次。

•再一次在培养基中悬浮细胞,计数和接种细胞,进行培养。

3. Dis pase•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片,用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。

•加入Dispase (0.6〜2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液)•在37C孵育20分钟到几个小时。

原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫

原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫

原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养,是建立细胞系的第一步,是一项基本技术。

原代细胞因刚从组织中分离开,生物学特性未发生很大变化,仍保留原来的遗传特性,也最接近和反映体内生长特性,适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。

原代细胞往往有多种细胞组成,比较混杂,即使从形态上为同一类型(上皮样或成纤维样),但细胞间仍有很大差异。

如果供体不同,即使组织类型、部位相同,个体差异也照样存在,原代细胞生物特性尚不稳定,如需做较为严格的对比性实验研究,还需进行短期传代培养。

1、组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法,也是早期采用培养细胞的方法,故原先被称为组织培养。

其方法:为将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中,瓶壁可预先涂以胶原薄层,以利于组织块粘着于瓶壁,使周边细胞能沿瓶壁向外生长,方法简便,利于培养,部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出,然后逐渐延伸,长成肉眼可以观察到的生长晕,5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮,此漂浮小块可随换液而弃去,由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片,可在显微镜下观察形态和用于实验研究。

其培养方法如下:(1)按照前述方法取材,将组织剪成或切成1mm3大小的小块,并加入少许培养基使组织湿润。

(2)将小块均匀涂布于瓶壁,每小块间距0.2 cm~0.5cm,一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20~30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

(3)培养2~4小时,待小块贴附后,将培养瓶缓慢翻转平放,静置培养,动作要轻,严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败,若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。

开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可,培养24小时后再补液,培养初期移动和观察时要轻拿轻放,开始几天尽量不去搬动,以利贴壁和生长,培养3~5天时可换液,一方面补充营养,一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

细胞生物学中的细胞分离和培养技术

细胞生物学中的细胞分离和培养技术

细胞生物学中的细胞分离和培养技术细胞分离和培养技术在细胞生物学领域中起着至关重要的作用。

通过这些技术,科学家们能够分离出人体或其他生物体中的不同类型的细胞,并将其培养在适当的培养基中,使其继续生长和繁殖。

这些技术为我们研究细胞的功能和特性提供了重要的工具。

本文将详细介绍细胞分离和培养技术的原理、方法和应用。

一、细胞分离技术细胞分离是指将复杂的组织和器官中的细胞分离出来,以获得纯净的细胞群。

常用的细胞分离技术包括机械法、酶消化法和负选择法等。

1. 机械法机械法是最简单也是最常用的细胞分离方法之一。

它利用机械力对组织进行研磨或切割,使组织细胞变成悬浮状态。

通过滤网或离心等方法,能够分离出不同大小、形态和密度的细胞。

2. 酶消化法酶消化法是利用特定的酶对组织进行消化,以破坏组织细胞之间的黏着力,并分离出单个的细胞。

常用的消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶和牛血清蛋白酶等。

3. 负选择法负选择法是通过标记已知种类的细胞,并将其排斥在分离细胞群之外,从而获得目标细胞。

这种方法可以用于从复杂的细胞混合物中分离出特定的细胞类型。

二、细胞培养技术细胞培养技术是将分离出的细胞放入适当的培养基中,并提供适宜的温度、湿度和营养条件,使细胞能够在体外继续生长、增殖和分化。

细胞培养技术广泛应用于医学研究、药物筛选和生物工程等领域。

1. 组织培养组织培养是将整个组织或组织片段放置在培养皿中,并提供适当的培养基,使组织细胞能够在体外长时间存活。

通过组织培养,可以研究组织的生长、分化和再生能力。

2. 原代细胞培养原代细胞培养是将从动物体内直接分离得到的细胞进行培养。

这些细胞最接近原始状态,具有更大的培养和繁殖能力。

原代细胞培养广泛应用于研究和生产中。

3. 细胞系细胞系是指从原代细胞培养中得到的无限增殖能力的细胞。

细胞系广泛应用于药物筛选、疫苗生产、毒性测试等领域。

常见的细胞系有HeLa细胞、293细胞和NIH/3T3细胞等。

三、细胞培养技术的应用细胞培养技术在许多领域都有重要的应用。

原代肝细胞培养方法

原代肝细胞培养方法

原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段,它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能,同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。

本文将探讨原代肝细胞培养的方法。

原代肝细胞是从动物(如小鼠、大鼠、猪等)或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。

它们具有种独立性和细胞特异性功能,是进行体外研究的理想模型细胞。

原代肝细胞培养的主要步骤包括:肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。

首先,肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。

一般来说,选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织,快速解剖分离,并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。

然后,用小剪刀对肝组织进行切细,使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。

常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。

这些酶能够降解结缔组织,使肝细胞从肝组织中游离出来。

接下来,肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。

一般而言,将细胞分离液转移至新离心管,并用对应的培养基对其停滞,使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。

在培养基的作用下,非肝细胞(如纤维细胞和非肝上皮细胞)会悬浮离开,而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。

此时,我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度,使纯化程度达到最佳。

然后,肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。

首先,选择合适的培养基是非常重要的。

常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。

这些培养基中会添加适量的营养物质(如葡萄糖、氨基酸和维生素)和生长因子(如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白)。

其次,细胞密度的控制也非常重要。

通常,当细胞趋于稳定时,可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。

此外,保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。

温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读,参考了众多对于小胶质细胞培养方案,对比了不同方案的利弊优缺,整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法,如有其他变更方案,以修改后为准。

1.实验材料剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等2.实验步骤2.1小胶质细胞的混合培养取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO恒温细胞培养箱( 372度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

2.2小胶质细胞的分离和纯化细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。

原代细胞分离方法

原代细胞分离方法

原代细胞分离方法
原代细胞分离主要有两种方法:机械分散法和消化分离法。

机械分散法适用于纤维成分很少的脑组织、部分胚胎组织等。

具体步骤如下:
1. 将组织剪碎至1mm3的组织块。

2. 用PBS清洗两次,然后用吸管吹打分散组织细胞,或把已充分剪碎分散
的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头压出。

3. 收集细胞转入离心管中,以1000rpm/分钟离心5分钟。

4. 去上清,加入含血清的培养基,重悬后移至培养瓶中培养。

消化分离法适用于细胞间质较少的软组织,如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。

具体步骤如下:
1. 用Hanks液清洗组织三次,剪成碎块大小为4毫米左右。

再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。

2. 加入%的胰蛋白酶,摇匀后放4℃过夜。

次日再用Hanks液洗涤,弃去
上清,共洗2-3次。

3. 加入少量含血清的培养基吹打分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。

以上是原代细胞分离的两种主要方法,可以根据实际需求和实验条件选择合适的方法进行操作。

原代滋养层细胞的分离培养及鉴定

原代滋养层细胞的分离培养及鉴定

一、概述原代细胞是从组织或器官中分离得到的未经过传代培养的细胞,通常被用于研究细胞的特性和生物学行为。

在细胞生物学研究中,原代细胞的分离、培养及鉴定是非常重要的步骤,它们可以为科学家提供更加真实的细胞生理功能和反应。

本文将讨论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定方法。

二、原代滋养层细胞的分离1. 准备工作在进行原代滋养层细胞的分离前,先准备必要的材料和试剂,包括消毒器械、胰酶、培养基和培养皿等。

2. 组织样本的处理将所需的组织样本取出并进行消毒处理,然后用无菌工具将其切割成小块。

3. 酶解和分离将组织样本块放入含有适量胰酶的培养基中,进行酶解和振荡分离,以获得细胞悬浮液。

4. 细胞分离通过离心等方法,将细胞悬浮液离心沉淀,然后将上清液中的细胞转移到新的培养皿中。

三、原代滋养层细胞的培养1. 培养基的准备根据原代滋养层细胞的类型和特性,选择适当的培养基,并添加相应的生长因子和营养成分。

2. 细胞的培养条件将分离得到的原代滋养层细胞接种于含有培养基的培养皿中,放置在恒温培养箱内,保持适当的温度和湿度条件,定期更换培养基。

3. 细胞的观察和维护利用显微镜观察细胞的生长情况和形态特征,定期对细胞进行传代培养,确保细胞的健康和稳定生长。

四、原代滋养层细胞的鉴定1. 形态学鉴定采用显微镜观察细胞的形态特征,包括大小、形状、胞浆及核的结构等,与已知的细胞形态进行比对鉴定。

2. 免疫细胞化学鉴定利用免疫细胞化学染色技术,检测细胞内特定蛋白的表达情况,例如细胞信号分子或细胞骨架蛋白等,来确定细胞的类型和特性。

3. 分子生物学鉴定通过PCR、Western blot等分子生物学技术,检测细胞内特定基因的表达情况,以确定细胞的遗传特性和分子水平特征。

五、结论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定是细胞生物学研究中的重要环节,操作规范和技术熟练对于获得高质量的原代细胞至关重要。

只有通过严格的分离和培养条件,并结合形态学、免疫细胞化学及分子生物学鉴定等手段,才能得到真实、可靠的实验结果,并为细胞生物学研究提供可靠的资料。

原代角质形成细胞的分离培养方法

原代角质形成细胞的分离培养方法

原代角质形成细胞的分离培养方法原代细胞在相关细胞实验使用过程中越来越多,人们不再单单趋于使用细胞系进行实验研究,因为细胞系常常由于体外长期培养,而容易丢失原有的生物学特性,对药物处理的反应差距越来越大。

原代细胞刚从组织中分离开,生物学特性未发生很大变化,仍保留原来的遗传特性,也最接近和反应体内生长特性,原代细胞的活力和生长状态都比较好,细胞的纯度和基因保留可达到90%以上,适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等试验研究,使用原代细胞进行实验,可以获得更准确的研究和数据。

为了更好的服务于广大科研工作者,赛百慷技术人员特提供了角质形成细胞分离的常用方法,技术因人而异仅供参考:角质形成细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞,其分化的最终阶是形成角蛋白。

根据角质形成细胞的发展阶段和特点,从内向外可将其分为五层。

基底细胞层又称生发层,棘细胞层,颗粒层,透明层,角质层。

角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。

在单一移行过程中,角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化,从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。

新生的基底细胞进入棘细胞层,然后上移到颗粒层的最上层。

细胞组织来源于实验动物的正常皮肤组织,细胞生长状态为贴壁培养。

需要的实验试剂:1.培养基1:iCell原代角质细胞培养体系4.基础培养基:DMEM/F125.缓冲液:无菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S,pH=7.46.消化液1:1.2U/ml的dispase Ⅱ7.消化液2:0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA8.消化液3:0.1%Ⅰ型胶原酶9.75%医用酒精10.胎牛血清(FBS)实验器械:1.培养皿2.T-25细胞培养瓶3.100目不锈钢网筛4.200目不锈钢网筛5.眼科剪6.眼科镊7.离心管(15ml、50ml)实验步骤:1.新鲜的包皮组织,装盛于含有无菌生理盐水或1×PBS的无菌容器中,于保温盒中,冰上放置离体6h内运输到实验室进行后续分离。

细胞原代培养实验总结

细胞原代培养实验总结

细胞原代培养实验总结引言细胞培养是生物科学研究中重要的技术手段之一,通过培养细胞,可以进一步研究细胞的生物学特性,了解其生长规律、代谢特征以及相应的分子机制。

本文将对细胞原代培养实验进行总结,包括实验的过程、关键步骤以及一些经验和技巧。

实验过程材料准备进行细胞原代培养实验,需要准备一系列实验材料,包括培养基、细胞培养酶、培养皿、离心管等。

在准备材料时,需要保证其纯度和质量,以确保实验的可靠性和重复性。

细胞分离首先,从组织或者细胞源中获得待培养的原代细胞。

通过消化组织或细胞样本,使用适当的酶或消化液,将细胞从组织中分离出来。

分离的细胞可以经过离心等方法获得。

细胞传代将分离得到的原代细胞进行传代是细胞培养实验中的重要步骤。

传代可以使细胞得以继续生长和繁殖,以获得足够数量的细胞用于后续实验。

传代的时机需要根据细胞的生长速度和需求进行判断,并在合适的时机进行。

细胞培养将原代细胞和传代细胞置于培养皿中,加入适量的培养基和其他必需的添加剂,建立细胞培养体系。

细胞培养过程需要一定的条件,包括适宜的温度、湿度、气体氛围等。

培养皿需要在无菌条件下操作,以避免细菌或其他微生物的污染。

鉴定和检测进行细胞原代培养实验后,需要对培养的细胞进行鉴定和检测,以验证其纯度和活性。

常用的方法包括细胞形态观察、细胞计数、细胞存活率检测、细胞周期分析等。

这些检测方法可以帮助研究者了解细胞的状态和特征,为后续的实验设计提供参考数据。

关键步骤细胞分离的优化细胞分离是细胞原代培养实验中的关键步骤之一。

为了获得较高的细胞分离效率,可以优化分离条件,如调整消化液的浓度和作用时间,选择合适的分离方法等。

此外,在分离过程中需要注意对细胞的机械刺激要尽量避免,以减少细胞的损伤和死亡。

培养基的选择和优化培养基是细胞培养实验中至关重要的因素之一,直接影响到细胞的生长和活性。

根据不同细胞类型的要求,选择适合的基础培养基,并根据实验需要添加相应的添加剂,如生长因子、血清、抗生素等。

细胞分离与培养技术

细胞分离与培养技术
流式分选最致命的缺点就是污染,且设备昂贵,技术复杂,需专业技 术人员操作,操作费时,适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。
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细胞分离技术
二、从原代组织中分离细胞 组织和器官采集:
人标本:可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官(活检和手术)。 大量的动物组织:先麻醉或处死,浸入70%酒精中,使毛皮全部浸湿,从腹
过滤细胞悬液,以免堵塞喷嘴。
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细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞
优缺点:
流式细胞仪分选纯度较高、回收率高,分选一些具有比较复杂细胞标 记的细胞时相当有用的,例如要分选出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞,只需要在流式上简单地逻辑设门就 可以了,而且流式可以双通道分选,也就是同一时间分选出两种细胞, 流式分选成本比磁珠低。
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细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞
黏附法分离血中单核细胞、T,B淋巴细胞
因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于 尼龙纤维柱上(聚酰胺纤维柱), 所以可将其与T淋巴细胞分离。
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具体步骤:
单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成(2.5-3) ×107/ml的细胞悬液。
先用Hanks液,再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼 龙纤维柱,冲洗液尽量流净。
3.中性蛋白酶(Dispase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块,用不含钙镁的平衡 盐溶液清洗组织碎片几次
加入Dispase(0.6~2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液)
在37℃孵育20分钟到几个小时。
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细胞分离技术
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,分离分散细胞、组织碎 片和较大的碎片。如需进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的Dispase

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项1.组织获得:收集组织样本,并用无菌技术分离细胞。

组织样本可以通过活体组织采样、细胞培养物或冻存细胞获得。

2.细胞分离:使用酶或机械方法,将组织分解为单个细胞。

酶消化可以使用胰蛋白酶、胶原酶等,机械方法可以使用刮刀或组织切割器。

3.细胞培养:将细胞转移到含有适当营养物质和细胞因子的培养基中。

常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等。

4.培养条件:细胞应保持在适当的培养条件下,包括温度、湿度、CO2和O2浓度以及pH值等。

传代培养的方法:1.剥离细胞:轻轻地将细胞从培养底物上剥离。

可以使用胰蛋白酶或EDTA来辅助细胞剥离。

2.细胞计数:使用显微镜和细胞计数板,计算细胞的数量。

3.细胞传代:将细胞转移到新的培养底物中。

选择适当的培养底物和培养条件,以确保细胞的正常生长和增殖。

4.细胞恢复:细胞传代后,需要一段时间来恢复和适应新的培养条件。

在这段时间内,细胞可能会出现一定程度的生长停滞或损伤。

注意事项:1.无菌操作:在进行细胞培养时,必须保持严格的无菌操作,以防止细胞污染和细菌、真菌、病毒等微生物的污染。

2.培养基配方:不同类型的细胞对培养基中的成分和细胞因子的需求有所不同,因此必须使用适当的培养基。

3.培养条件控制:细胞对培养条件非常敏感,包括温度、CO2浓度、湿度等。

必须确保这些条件处于合适的范围内。

4.细胞密度控制:细胞密度对细胞生长和增殖有重要影响。

过高的细胞密度可能导致细胞死亡,而过低的细胞密度可能导致细胞转分化。

5.传代次数限制:细胞在传代培养中会出现累积的突变和基因改变,因此应限制传代的次数,以确保细胞的稳定性和一致性。

6.细胞检测和验证:在进行细胞传代培养之前和之后,应对细胞进行检测和验证,以确保细胞的纯度和正常生长。

细胞培养是一项复杂的技术,需要细致的操作和严格的条件控制,以确保细胞的正常生长和稳定性。

遵循适当的方法和注意事项,将有助于提高细胞培养的成功率和可靠性。

原代肝细胞分离方法

原代肝细胞分离方法

原代肝细胞分离方法体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法.1.1 采用非灌流的方法早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.1.1.1 机械分离法:机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞.1.1.2 胰酶消化法:胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液.1.1.3 胶原酶消化法:胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液.1.2 采用灌流的方法虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高.1.2.1 离体胶原酶灌流法:离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液.1.2.2 Seglen两步灌流法(原位胶原酶灌注法):自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法:半原位胶原酶灌流法是我国学者彭齐容 et al[13]以Seglen法为基础建立的肝细胞分离技术. 俞红et al[14]在采用该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的D-Hank's液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后得到制备好的细胞悬液.1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法:下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到制备好的肝细胞悬液.1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法:在使用两步灌流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的问题. 而Gerlach et al[15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流技术, 建立了一种高效的细胞分离方法。

细胞生物学研究中的细胞处理技术综述

细胞生物学研究中的细胞处理技术综述

细胞生物学研究中的细胞处理技术综述细胞处理技术是细胞生物学研究中不可或缺的工具,在细胞分离、培养、检测、转染等方面发挥着重要作用。

本文将介绍一些常见的细胞处理技术及其应用。

一、细胞分离技术1.胶原酶消化法胶原酶消化法是从组织中分离出单个细胞的常见方法。

胶原酶是一种分解胶原蛋白的酶,能够溶解组织细胞之间的胶原质。

通过将组织碎片放入含有适量胶原酶的消化液中搅拌,可以将组织分解成单个细胞。

胶原酶消化法适用于体积较大的组织,如动物胰腺、肝脏和心脏等。

2.胰蛋白酶消化法胰蛋白酶消化法是一种常见的细胞分离方法,它通常应用于体积较小的组织,如细胞悬液和培养细胞。

胰蛋白酶能够消化大多数细胞的外层细胞膜,使细胞变得松散,并将它们从组织中分离出来。

在胰蛋白酶消化过程中,还会产生一种称为血清抑制物(SIS)的物质,该物质能够抑制胰蛋白酶的消化作用,避免对细胞造成伤害。

二、细胞培养技术1.原代细胞培养原代细胞培养是指从组织中采集到未经处理的细胞,在培养皿中的初次培养。

这种细胞培养方法具有许多优点,如它能够保持细胞群体的原始状态,使研究人员能够更好地了解细胞的生理和生化特性。

不过原代细胞培养通常需要一定的时间来建立培养体系,同时也需要浪费大量动物组织。

2.细胞系培养细胞系培养是指从原代培养物中筛选并遗传传承的细胞株,在连续培养中进行传代。

与原代培养物相比,细胞系培养具有许多优点,如它可以在短时间内获得大量细胞,使实验结果更快更可靠,并且相同批次的细胞具有较高的同质性,能够减少实验中的变异性。

同时使用细胞系还能保证不浪费动物组织资源。

三、细胞检测技术1.流式细胞术流式细胞术是一种先进的高通量细胞分析技术,可以同时分析和评估数以千计的单个细胞。

流式细胞术可以对细胞进行一系列操作,如计数、筛选、鉴定、排序和分离等,可以分析细胞形态、表面蛋白、内部蛋白和DNA含量等。

流式细胞术在生物医学研究、免疫学、肿瘤学等领域具有广泛的应用前景。

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原代细胞培养之--细胞分离技术
原代细胞的分离和制作
人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密,不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖,即使采用1mm3的组织块,也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长,若需获取大量细胞,必须将现有的组织块充分散开,使细胞解离出来,常采用的方法如下:
一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料,最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟,若悬液量大,可适当延长离心时间,但速度不能太高,延时也不能太长,以避免挤压或机械损伤细胞,离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次,用培养基洗一次后,调整适当细胞浓度后再分瓶培养,若选用悬液中某些细胞,常采用离心后的细胞分层液,因为,经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层,这样可根据需要收获目的细胞。

不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。

二、实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料,由于细胞间结合紧密,为了使组织中的细胞充分分散,形成细胞悬液,可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。

(一)机械分散法
所取材料若纤维成分很少,如脑组织,部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头压出,或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。

此法分离细胞虽然简便、快速,但对组织机械损伤大,而且细胞分散效果差。

此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。

(二)消化分离法
组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状),应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动,使团块膨松,由块状变成絮状,此时再采用机械法,用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡,使细胞团块得以较充分的分散,制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液,接种培养后,细胞容易贴壁生长。

1、酶消化分离法
酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶,其分离方法如下:
(1)胰蛋白酶分散技术
胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。

胰蛋白酶是一种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开,在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同,对细胞的消化能力也不同,胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。

①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。

而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效,但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。

②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效,但配制时必须新鲜,需保存在低温冰箱中,消化时的pH和温度都要适宜,否则会影响活力,细胞的分散直接与酶的活力有关,最终使用活力为1:200或1:250,56℃pH8.0时活力最强。

该酶为粉剂,保藏时要防潮,室内温度不宜过高,保存时间不能太长,若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。

③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时,浓度可适当提高,消化时间适当延长。

浓度高对细胞有毒性,而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖,若培养液中加入血清,其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强,但由于对细胞有损害而不能被采用,常使用的温度为37℃,通常在37℃进行消化比室温作用快。

⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围,但随碱性的增加其活力也随之减少,活性强分散快,细胞也容易被消化下来,消化分离细胞时PH只能选用7.6~8.0之间,否则对细胞有损伤。

⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时,可以发生抑制胰蛋白的消化作用。

因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。

⑦消化时间如果细胞消化时间过长,可以损害细胞的呼吸酶,从而影响细胞的代谢,一般消化时间为20分钟为宜,冷消化时使用低浓度消化液,于4℃过夜也可。

分离方法如下:
①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次,剪成碎块大小为4毫米左右,用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织,再加入0.25%的胰蛋白酶,摇匀后放4℃过夜,次日再用Hanks液洗涤,弃去上清,共洗2~3次,然后,加入少量营养液吹打分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。

②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种:
热消化多次提取将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟,然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液,按合适的浓度分瓶培养,然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作,再消化提取细胞。

冷消化多次提取方法同上,只是消化温度为4℃。

先热消化后冷消化将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散,制成悬液,剩余
未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜,次日再提取细胞,分散成悬液,分瓶培养。

(2)胶原酶(Collagenase)消化法
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用。

适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用,对细胞本身影响不大,可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。

该酶分离效果好,即使有钙、镁离子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,最终浓度200u/mL或0.1~0.3mg/mL。

此酶消化作用缓和,无需机械振荡,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本。

经过胶原酶消化后的上皮组织,由于上皮细胞对酶有耐受性,可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。

成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长,因此不必要再进一步消化处理。

鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性(见表4-1)和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异(见表4-2),以及两者价格不等,有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用,同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用),采用两者的联合消化作用,对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。

表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别
项目胰蛋白酶胶原酶
消化特性适用于消化软组织适用于消化纤维多的组织
用量 0.01%~0.5% 0.1~0.3mg/mL(200u/mL)
消化时间 0.5~2小时(小块) 1~12小时
pH 8~9 6.5~7.0
作用强度强烈缓和
细胞影响时间过长有影响无大影响
血清、钙、镁离子有影响无影响
表4-2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间(小时)(0.5~1cm3)
酶种类较硬组织软组织
4℃室温 37℃ 4℃室温 37℃
胰蛋白酶(0.25%) 24~48 1~6 1~2 12~24 1~2 0.5~1
胶原酶(200u/mL) 24 6 6.5 12 3 0.25
两者联合(对冲) 12~46 12~24 4~12 12~24 6~12 1~2
除上述两种最常用的消化酶外,还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶,近年来,还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。

2、非酶消化法(EDTA消化法)
EDTA是一种非酶消化物,又称螯合剂或Versene,全名为乙烯二胺四乙酸。

常用不含钙、镁离子的PBS 配成0.02%的工作液,对一些组织,尤其是上皮组织分散效果好,该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物,利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离,缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状,有团块,常不单独使用,但可与胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1),不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散,可降低胰酶的用量和毒性作用。

消化分离法的操作步骤:
(1)剪切把组织块剪碎,呈1~5mm3大小的组织块。

(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜,自然沉降法)。

(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。

胰蛋白酶消化时间不宜过长。

(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。

(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入,中止消化反应,采用漂洗法洗2-3次后,加入完全培养基。

(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法,使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养,若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟,吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

注意事项如下:
(1)组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

(2)胰蛋白浓度不宜过高,作用时间不能太长,以避免毒性作用。

(3)消化后组织不仅要尽量弃去消化液,以避免毒性产生,而且动作要轻,以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。

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