原代细胞的培养与建系
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。
细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。
原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。
一、取材的基本要求.1．取材要注意新鲜和保鲜.2．应严格无菌.3．防止机械损伤.4．去除无用组织和避免干燥.5．应注意组织类型、分化程度、年龄等.6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。
内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。
血液细胞的取材血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。
骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
动物组织取材1、鼠胚组织取材首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。
2、幼鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法是指将从活体组织中分离出的未经连续传代或只进行过有限传代的原代细胞，在无菌条件下进行体外培养的技术。
以下是一般的原代细胞培养方法：
1. 组织分离：从生物体中取得需要培养的组织，如肺、肾等。
将组织切碎或用酶消化等方法进行细胞的分离。
2. 细胞悬浮液制备：将分离得到的细胞以适当的培养基和缓冲液混合，形成细胞悬浮液。
3. 培养基准备：根据细胞类型的不同，选择适当的培养基，并添加必要的营养物质、生长因子和抗生素等。
4. 培养皿涂层：将培养皿表面涂覆一层适当的基质，如胶原、明胶等，以促进细胞附着生长。
5. 细胞接种：将细胞悬浮液均匀地加入培养皿中，使细胞附着在培养皿表面。
6. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，控制适当的温度、湿度和气体组成等条件，提供细胞正常生长所需的环境。
7. 培养液更换：定期更换培养液，补充必要的营养物质和生长因子，以保持细胞的生长和增殖。
8. 细胞观察和记录：定期观察和记录细胞的形态、增殖情况和细胞数量等，评估细胞的健康状态。
需要注意的是，不同类型的细胞可能有特定的培养要求，如培养
基成分、pH值、气体组成、温度和湿度等。
因此，在进行原代细胞培养时，应根据具体的细胞类型和研究目的，选择合适的培养条件和方法。
细胞的原代培养
仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶 培养瓶、 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素 小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、 瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、 手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃ 手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：胎鼠或新生鼠 材料： 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25% 培养基（ 20%小牛血清），0.25% 小牛血清）， 试剂：1640培养基 胰酶，Hank’s液 胰酶，Hank’s液，碘酒
六、无菌操作的几个注意事项
1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2% 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或 酒精或0.2% 新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动， 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动， 增加污染机会。 增加污染机会。 4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品 不能用手触已消毒器皿的工作部分， 要布局合理。 要布局合理。 5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 6、吸溶液的吸管等不能混用。 吸溶液的吸管等不能混用。
9、加入培养液l~2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 加入培养液l~2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 ），血球计数板计数 10、将细胞调整到5 10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培 /ml左右 转移至25ml细胞培 左右， 养瓶中，37℃下培养。 养瓶中，37℃下培养。 上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基 上述消化分离的方法是最基本的方法， 础上，可进一步分离不同细胞。 础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室 不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶， 不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶 等）。
细胞的原代培养
细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
原代培养的方法有：a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。
(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。
4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。
【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。
细胞培养操作指南
细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。
（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。
(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。
不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。
若必须推迟，可保存在4℃，72h。
1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。
分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。
注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。
2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
原代和传代细胞的培养和维持
原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。
悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。
每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。
传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。
应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。
原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫
原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。
原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。
原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。
1、组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。
其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。
其培养方法如下：(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。
(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。
(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。
开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
原代细胞培养
二、实体组织材料的分离方法
• 实体组织细胞间结合紧密，为了使组织中的细 胞充分分散，形成细胞悬液，可采用： • （一）机械分散法 • （二）消化分离法
（一）机械分散法
• 适用组织：纤维成分少的软组织。如脑组织，部 分胚胎组织 • 方法： • 采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞 • 将已充分剪碎分散的组织放在注射器内使细胞通 过针头压出 • 在不锈钢网内用钝物压挤使细胞从网孔中压挤出。 • 特点：简便、快速，但对组织机械损伤大，而且 细胞分散效果差。
细胞培养之
---原代细胞的培养
基本概念
• 来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方 法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。 • 能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞 系。
• 经单细胞克隆、纯化，大量扩增后所形成的生物 学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株。
原代细胞的培养
• 原代细胞的培养是从供体取得组织细胞在体外
第二节 原代细胞的分离和制作
• 一、悬浮细胞的分离方法 • 组织来源：血液、羊水、胸水或腹水 • 方法：1000r/min的低速离心10 min→沉淀用 无钙、镁PBS洗两次，培养基洗一次→调整适 当细胞浓度→分瓶培养 • 若选用悬液中某些细胞，加入细胞分层液，经 离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中 形成不同层。 • 如：淋巴细胞分离
注意事项
• （1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、 镁离子和血清对胰酶和EDTA的抑制作用。
• （2）胰酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 • （3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以 避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的 细胞随漂洗而丢失。
第三节 原代细胞的培养方法
原代细胞培养 实验报告
细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。
原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。
细胞培养至一定程度后，需再做培养。
及培养的细胞分散后，从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。
代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。
③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。
④渗透压：一般为260～320mmol/l （人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。
培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。
⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。
贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。
②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。
半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。
4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。
原代培养定义
原代培养定义原代培养，是指在实验室中通过无菌技术，将细胞或组织从生物体中分离出来，以培养基为基础，创造一个适合其生长和繁殖的环境，从而使其在体外进行生长和繁殖的过程。
原代培养是一项重要的实验技术，在生物学和医学研究中具有广泛的应用。
通过原代培养，我们可以观察和研究细胞的特性、功能以及对外界环境的反应。
同时，原代培养还可以为疾病的研究和治疗提供重要的实验基础。
在进行原代培养时，首先需要选择合适的培养基。
培养基中包含了细胞所需的营养物质、生长因子和激素等，以提供细胞生长所需的条件。
然后，将细胞或组织分离出来，通过切割、酶解等方法，将其转移到含有培养基的培养皿中。
接着，将培养皿放入恒温培养箱中，控制好温度、湿度和气体成分等条件，使细胞在体外进行生长和繁殖。
原代培养的成功与否，往往取决于细胞的纯度和活力。
因此，在进行原代培养时，需要严格控制操作的无菌性，避免细菌和其他微生物的污染。
此外，还需要合理选择细胞的来源和处理方法，以确保细胞的活力和功能不受损害。
原代培养的过程中，细胞的生长和繁殖需要提供适当的营养物质和环境条件。
在培养基中添加适当的营养物质和生长因子，可以促进细胞的生长和分裂。
同时，还需要控制好培养环境的温度、湿度和气体成分等因素，以保证细胞在最适宜的条件下进行生长和繁殖。
原代培养的时间长短和成功率会受到多种因素的影响。
例如，细胞的来源、处理方法、培养基的配方和培养条件等都会对原代培养的效果产生影响。
因此，在进行原代培养时，需要根据具体情况进行合理的设计和调整，以提高培养的成功率和细胞的生长质量。
原代培养是一项重要的实验技术，对于生物学和医学研究具有重要意义。
通过原代培养，我们可以观察和研究细胞的特性和功能，为疾病的研究和治疗提供重要的实验基础。
然而，原代培养的成功与否需要严格控制操作的无菌性、合理选择细胞的来源和处理方法，并提供适当的营养物质和环境条件。
只有在合适的条件下，才能实现细胞的生长和繁殖，从而取得准确可靠的实验结果。
原代细胞的培养
原代细胞培养
——Lisa
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主要内容
• • • • • 原代细胞的取材 原代细胞的解离 原代细胞的消化 原代细胞的培养 原代细胞培养的注意事项
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谢
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注意事项
(1)无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须 加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染， 一般很难消除。 • (2)培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要 条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养 液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适 当的培养液。 • (3)小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细 胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清 进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后 ，就保持应用至实验完成。 • (4)胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是20℃低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长 ，细胞损伤增加。
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• (5)L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰 胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨 酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存两周以上时， 就应重新加入原来量的谷氨酰胺。 (6)静置培养：原代细胞在消化分离后，置于CO2培养箱的头24～48h (必要时 72h)内，应处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察生长状况，这将 使原代分离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增殖，初学者尤应注意。不必担 心培养液中的营养成分会消耗光，在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原 代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。 (7)消化时间：一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒 已经松散，略经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的消化往往导致细胞损伤 加重，细胞培养成活率降低。 (8)其他生长因子：经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以成功。对于 少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子，如胰岛素能促使细胞 摄取葡萄糖和氨基酸。另外，内毒素、EGF、FGF等均有促有丝分裂作用，但 费用较高。
细胞培养的方法及注意事项
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养原理将动物机体地各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适地培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养.仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（℃）材料：动物组织块试剂：培养基（含小牛血清），胰酶，′液，碘酒初代消化培养法. 准备：取各种已消毒地培养用品置于净化台面，紫外线消毒分钟.开始工作前先洗手、酒精擦拭手至肘部. . 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽.. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用液漂洗次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素地混合液中分钟.. 剪切：用眼科剪把组织切成毫米大小地块，以便于消化.加入比组织块总量多倍地胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞.. 消化：或用恒温水浴，或置于℃温箱消化均可，消化中每隔分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好.消化时间依组织块地大小和组织地硬度而定.. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开地组织块.低速（转分）离心消化液分钟，吸出上清，加入适量含有血清地培养液.. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中.对大多数细胞来说，要求在范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用调整.. 培养：置于℃温箱培养，如用温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞.初代组织块培养法. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静液，用眼科剪反复剪切块为止.. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以为宜，每一培养瓶底可摆布块.. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置℃温箱培养小时左右（勿超过小时），使小块微干涸.. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上地组织小块.置温箱中静止培养.待细胞从组织块游出数量增多后.再补加培养液.传代培养法原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）. 传代培养也是一种将细胞种保存下去地方法.同时也是利用培养细胞进行各种实验地必经过程.悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶.材料和试剂. 细胞：贴壁细胞株. 试剂：％胰酶、培养基（含％小牛血清）. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等操作步骤. 吸除培养瓶内旧培养液.. 向瓶内加入胰蛋白酶和混合液少许，以能覆满瓶底为限.. 置温箱中分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化.. 吸除消化液，向瓶内注入液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉.注意加液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动地细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用液冲洗，直接加入培养液.. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液.. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养.无菌操作注意事项. 操作前要洗手，进入超净台后手要用酒精或新洁尔灭擦试.试剂等瓶口也要擦试.. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液地用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜.. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会.. 不能用手触已消毒器皿地工作部分，工作台面上用品要布局合理.. 瓶子开口后要尽量保持℃斜位.. 吸溶液地吸管等不能混用.。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告细胞原代培养实验报告细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。
本实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。
我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果分析。
实验步骤：1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。
然后将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。
最后通过过滤器筛选，获取单个细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和抗生素。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。
使用显微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。
4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培养皿上剥离下来。
将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按照相同的条件进行培养。
实验结果：在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。
初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。
随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。
在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。
细胞体积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。
细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。
随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。
细胞密度逐渐增加，细胞聚落的大小也逐渐增大。
同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起的数量和长度有所增加。
实验讨论：细胞原代培养是一种常用的实验方法，可以用于研究细胞的生长、增殖和分化等生物学特性。
在本实验中，我们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞进行原代培养，并观察到了细胞的生长和变化。
细胞的形态特征对于细胞的功能和特性具有重要的指示意义。
在本实验中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征，这与之前的研究结果一致。
原代培养注意事项
原代培养注意事项
（1）原代培养材料的选择，尽量选取繁殖能力较强的组织，如胚胎、幼小的生物体或者肿瘤组织等。
（2）要注意无菌操作。
其操作要求应高于外科手术
（3）整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇时间1min左右，不能过长，以确保胚胎细胞活性。
（4）运用消化法时胰酶温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。
因为此过程不像消化培养细胞时的1~10min，而是至少20min，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中继续消化了10min以上。
所以胰酶不能作用过强，否则这些细胞易被损伤而不易生存。
（5）如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，匆使组织块漂浮起来。
如果组织块没有黏壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上，从而因不能观察到而无法收集到生长的细胞。
（6）原代培养操作时，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS 洗涤子宫、胚胎或组织块等。
（7）本实验也可以使用新生乳鼠做培养材料。
此时要将乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮肤充分消毒，由于乳鼠原代培养污染概率更高，故应小心操作，避免污染细菌。
乳鼠原代培养细胞的存活率不及胚胎细胞培养的成功率。
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细胞生物学实验细胞原代培养
• 2、离散细胞培养：有单细胞贴壁或分裂成片
培养观察一般项目
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次。 观察的内容包括：
严重者细胞脱壁悬浮。
9．将植块置于12孔培养板的培养孔中央，每孔5块，间隔约2mm，
布局合理，粘膜面向上，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的
表面；
10．沿培养孔的边缘，缓慢加入约0.5ml的完全MEM培养液，
勿使培养液与植块接触；
11．将培养板置于370 C
、
５％CO2培养箱中预孵育1小时；
12．每孔加完全MEM培养液2ml，轻拿轻放，切勿使植块飘
• 学习观察体外培养细胞的形态及生 长状况。
实验原理
• 模仿体内生长环境，使来自机体 的细胞、组织、器官能够在人工 培养条件下生存、生长、繁殖。
•
培养用主要仪器设备
1、纯水设备：纯水仪 2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、
过滤器及0.22 m滤膜； 3、超净工作台 4、培养设备： 普通培养箱、CO2培养箱； 5、贮存设备：冰箱、液氮罐 6、观察设备：倒置显微镜 7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等
关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯 (一切操作均需在酒精灯火焰下进行)
将消毒过的所用物品放入超净工作台中
植块培养法培养鸡心肌细胞步骤
一、配M199完全培养液：
M199基础培养液 90％
小牛血清
10％
青霉素 链霉素
100IU/ml 100g/ml
过滤除菌。
二、获取心脏
① 消毒鸡胚蛋：泡入70％酒精 ② 取出鸡胚，Hank’s液洗涤。 ③ 取出心脏，放入Hank’s液中。
b细胞培养方法
b细胞培养方法b细胞是一类重要的免疫细胞，它在体内起到抗体产生和免疫记忆的作用。
为了研究和应用b细胞，科学家们开展了大量的b细胞培养方法的研究。
本文将介绍几种常用的b细胞培养方法，包括原代细胞培养、细胞系培养和混合细胞培养。
一、原代细胞培养原代细胞培养是从动物体内直接获得的b细胞进行培养。
通常的方法是将小鼠或人体内的淋巴组织（如脾脏或淋巴结）取出，经过细胞分离和纯化，得到b细胞。
然后，将这些b细胞放入含有适当培养基和生长因子的培养皿中进行培养。
常用的培养基有RPMI-1640和DMEM等，生长因子包括IL-2、IL-4和IL-6等。
在培养过程中，需要定期换培养基和补充生长因子，以促进b细胞的生长和分裂。
二、细胞系培养细胞系培养是指从原代细胞中分离出的b细胞经过一系列处理后建立的可持续增殖的细胞系。
首先，从原代细胞中分离出b细胞，并进行纯化和筛选，以获得纯度较高的b细胞群落。
然后，将这些b 细胞转染入已建立的细胞系中，如Raji细胞系或DG75细胞系等。
转染可以使用病毒载体或电穿孔等方法进行。
转染后，将细胞培养在含有相应培养基和生长因子的培养皿中，进行培养和扩增。
细胞系培养的优势在于可以长期保存和大规模扩增细胞，方便后续的实验操作和应用。
三、混合细胞培养混合细胞培养是指将b细胞与其他免疫细胞一起培养的方法。
这种培养方法可以模拟体内免疫反应的情况，更好地研究b细胞的功能和相互作用。
常用的混合细胞培养方法包括淋巴细胞培养、脾细胞培养和淋巴结细胞培养等。
在培养过程中，需要注意细胞的比例和培养条件的优化，以保证不同细胞类型的正常生长和相互作用。
除了上述常用的b细胞培养方法，还有一些特殊的培养方法可以用于特定的研究需求。
例如，单细胞培养可以用于b细胞单克隆抗体的筛选和生产；三维培养可以用于模拟体内组织结构和功能；共培养可以用于研究b细胞和其他细胞类型的相互作用等。
这些方法的选择和优化需要根据具体的研究目的和实验条件进行。
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原代细胞的培养与建系(一)细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。
原代细胞经分散接种之手段称为传代。
凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。
若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。
若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。
此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。
这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术，才可能更快捷地学习和掌握其他方法，本章重点叙述常用的基本技术。
第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下：一、取材的基本要求（1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。
若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。
（2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。
要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。
（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。
（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。
对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。
二、各类组织的取材技术（一）皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要组织来源，主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4cm2即可，这样局部不留疤痕，若对烧伤皮肤进行上皮细胞膜片移植，可从大腿或臀部取较大皮片，可取2~4cm2皮片，但取材时不要用碘酒消毒；若培养上皮细胞，取材时不要切取太厚，尽可能去除所携带的皮下或粘膜下组织；若欲培养成纤维细胞，则反之。
皮肤粘膜与外界相通部位，因表面细菌、霉菌很多，取材时应严格消毒，必要时要用高浓度抗菌素和适量两性霉素B漂洗、浸泡。
（二）内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织，否则培养后，由于成纤维细胞的生长给以后的培养工作增加困难。
对于一些特殊细胞培养的取材，详见后面有关章节。
（三）血液细胞的取材血液及淋巴组织中的血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素浓度为8~10u/mL血，抽血的针筒也要用肝素湿润，若从血站取来的献血员的血液，因血站不用肝素抗凝剂，常用含枸椽酸盐抗凝，对此类血标本千万不能用含钙、镁离子的洗液来处理细胞，因此时的钙、镁离子可加速血液中凝血酶促进血液凝固而影响收获血细胞及淋巴细胞。
此外要严格无菌，尽量新鲜使用。
（四）骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材取上述标本时，除严格无菌，注意抗凝外，还要尽快分离培养，一般无需其他处理，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
具体操作详见后面有关章节。
（五）动物组织取材1、鼠胚组织取材首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。
2、幼鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。
（六）人胚体组织取材在局部先用碘酒后用75%酒精棉球消毒，无菌法取人胚肺（肾），方法与鼠类相同。
（七）鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。
将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干，经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳，再用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚，再用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。
第二节原代细胞的分离和制作人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：（三）血液细胞的取材血液及淋巴组织中的血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素浓度为8~10u/mL血，抽血的针筒也要用肝素湿润，若从血站取来的献血员的血液，因血站不用肝素抗凝剂，常用含枸椽酸盐抗凝，对此类血标本千万不能用含钙、镁离子的洗液来处理细胞，因此时的钙、镁离子可加速血液中凝血酶促进血液凝固而影响收获血细胞及淋巴细胞。
此外要严格无菌，尽量新鲜使用。
（四）骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材取上述标本时，除严格无菌，注意抗凝外，还要尽快分离培养，一般无需其他处理，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
具体操作详见后面有关章节。
（五）动物组织取材1、鼠胚组织取材首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。
2、幼鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。
（六）人胚体组织取材在局部先用碘酒后用75%酒精棉球消毒，无菌法取人胚肺（肾），方法与鼠类相同。
（七）鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。
将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干，经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳，再用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚，再用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。
第二节原代细胞的分离和制作人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。
二、实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。
（一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。
此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。
此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。
（二）消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：（1）胰蛋白酶分散技术胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。
胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。
①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。