细胞生物学实验-细胞的原代培养
原代细胞培养的名词解释
原代细胞培养的名词解释在细胞生物学领域里，原代细胞培养是一种常见的实验技术。
它是通过从一个生物体内分离和培养细胞，使其在体外继续生长和繁殖的过程。
通过原代细胞培养，我们可以研究细胞的生理特性、功能和互作，有助于我们深入了解生物体内组织和器官的基本构成和功能，以及与疾病相关的异常细胞行为。
一、原代细胞的选择和分离方法要进行原代细胞培养，第一步是选择适合的原代细胞。
原代细胞是从组织或器官中分离出来的初代细胞，与体内的细胞相似，具有原始的细胞特性。
常用的原代细胞包括人类和动物的肌肉细胞、皮肤细胞、神经细胞等。
原代细胞的分离通常通过组织分块法或酶处理法进行。
组织分块法是将组织样本切割成小块，然后用细胞培养基将其浸泡，通过适当的培养条件，细胞会从组织中游离出来并生长扩增。
酶处理法则是使用特定的酶来消化组织，使细胞从基质中分离出来。
二、原代细胞培养的技术和条件原代细胞的培养需要提供适合其生长和繁殖的环境。
培养基是最基本的条件，通常包括营养物质、生长因子、补体和抗生素等。
细胞培养基中的成分要根据细胞类型的不同而调整，以满足其特定的营养需求。
细胞培养的环境因素也很重要。
温度、湿度和气体组成是常见的调节参数。
温度需要恒定在37摄氏度左右，以模拟体内的正常生理条件。
湿度的控制可以减少蒸发和细胞表面的沉积。
气体组成通常是5％二氧化碳和95％空气，以稳定酸碱平衡。
在原代细胞培养中，还需要注意细胞的传代。
传代是指将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿中，以保证细胞的生长和更新。
传代时要遵循适当的规程和技术，以确保细胞的稳定和增殖。
三、原代细胞培养的应用原代细胞培养在细胞生物学研究中具有广泛的应用。
通过原代细胞培养，我们可以研究细胞的分化、增殖、凋亡和信号传导等基本生理过程。
这对于揭示细胞发育和组织构建的机制非常重要。
此外，原代细胞培养还可以用于研究疾病的发生机制和治疗方法。
通过比较病变组织和正常组织的原代细胞，我们可以发现细胞中的异常变化，从而揭示疾病的发生和发展规律。
细胞培养方法与步骤
细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。
细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。
细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。
一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。
原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。
步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。
2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。
3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。
4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。
5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。
二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。
步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。
2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。
3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。
4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。
5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。
6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。
三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。
操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。
2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。
3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。
4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。
细胞培养-原代培养-传代培养
鼠胎组织细胞原代培养
换液：
全量换液和半量换液
换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 细胞状态
细胞换液
细胞传代
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
红色表示中性pH 黄色代表酸性pH 紫色表示碱性pH
在一些特殊培养液中不含酚红
酚红
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml
01
细胞原代培养
02
细胞换液与传代
03
细胞冻存与复苏
三、细胞培养基本技术
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
01
碳酸氢钠 2.0 g
02
03
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
04
调节pH值至7.2
细胞的原代培养与传代培养
细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。
原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。
特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。
在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。
在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。
但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。
即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。
其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。
原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。
假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。
有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。
在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。
借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。
而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。
细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。
传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。
原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。
通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。
但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。
细胞生物学实验细胞原代培养
• 2、离散细胞培养：有单细胞贴壁或分裂成片
培养观察一般项目
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次。 观察的内容包括：
严重者细胞脱壁悬浮。
9．将植块置于12孔培养板的培养孔中央，每孔5块，间隔约2mm，
布局合理，粘膜面向上，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的
表面；
10．沿培养孔的边缘，缓慢加入约0.5ml的完全MEM培养液，
勿使培养液与植块接触；
11．将培养板置于370 C
、
５％CO2培养箱中预孵育1小时；
12．每孔加完全MEM培养液2ml，轻拿轻放，切勿使植块飘
• 学习观察体外培养细胞的形态及生 长状况。
实验原理
• 模仿体内生长环境，使来自机体 的细胞、组织、器官能够在人工 培养条件下生存、生长、繁殖。
•
培养用主要仪器设备
1、纯水设备：纯水仪 2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、
过滤器及0.22 m滤膜； 3、超净工作台 4、培养设备： 普通培养箱、CO2培养箱； 5、贮存设备：冰箱、液氮罐 6、观察设备：倒置显微镜 7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等
关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯 (一切操作均需在酒精灯火焰下进行)
将消毒过的所用物品放入超净工作台中
植块培养法培养鸡心肌细胞步骤
一、配M199完全培养液：
M199基础培养液 90％
小牛血清
10％
青霉素 链霉素
100IU/ml 100g/ml
过滤除菌。
二、获取心脏
① 消毒鸡胚蛋：泡入70％酒精 ② 取出鸡胚，Hank’s液洗涤。 ③ 取出心脏，放入Hank’s液中。
细胞原代培养
细胞
一细胞培养
（一）原代培养
○1胰蛋白酶消化法
1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）
2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下
3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块过细胞筛，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟
4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀
5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养
6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基
7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养
○2组织块法
1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）
2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距
3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养
4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基
仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱
试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
原代细胞培养 实验报告
细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。
原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。
细胞培养至一定程度后，需再做培养。
及培养的细胞分散后，从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。
代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。
③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。
④渗透压：一般为260～320mmol/l （人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。
培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。
⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。
贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。
②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。
半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。
4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。
原代细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。
3. 观察细胞在不同培养条件下的生长状态，为后续实验提供基础细胞。
二、实验原理原代细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，经过消化、分离等步骤，在无菌条件下将其培养在适宜的培养基中，使其生长、繁殖的过程。
原代细胞培养是细胞生物学、分子生物学、药理学等领域研究的重要技术手段。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠肝脏组织、胰蛋白酶、EDTA、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、无菌水、细胞培养瓶、培养皿、移液器、显微镜、离心机等。
2. 实验仪器：CO2培养箱、超净工作台、显微镜、离心机、移液器等。
四、实验方法1. 组织处理：将小鼠肝脏组织放入无菌培养皿中，用无菌手术剪将其剪成1mm³大小的组织块。
2. 消化：将组织块放入含有胰蛋白酶和EDTA的消化液中，在37℃水浴中消化5-10分钟。
3. 分离：将消化后的组织块转移到离心管中，加入适量DMEM培养基，用移液器吹打使其分散成单个细胞。
4. 细胞计数：取少量细胞悬液，用血球计数板进行细胞计数。
5. 细胞接种：将细胞悬液接种到培养瓶中，放入CO2培养箱中培养。
6. 细胞传代：待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞，按照1：2的比例进行传代培养。
7. 观察细胞生长状态：定期观察细胞生长状态，记录细胞数量、形态等变化。
五、实验结果1. 细胞计数：接种后24小时，细胞开始贴壁生长，48小时后细胞数量明显增加。
2. 细胞传代：传代培养过程中，细胞生长状态良好，细胞数量、形态等指标均符合要求。
3. 细胞生长状态：细胞呈多边形，排列整齐，细胞间隙较小，细胞核清晰可见。
六、实验讨论1. 原代细胞培养的成功关键在于无菌操作和适宜的培养条件。
在实验过程中，要严格按照无菌操作规程进行，确保细胞培养环境的无菌。
2. 细胞传代培养是维持细胞生长和繁殖的重要手段。
在传代过程中，要选择合适的消化时间，避免过度消化或消化不足。
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞原代培养细胞生物学实验报告细胞原代培养实验报告一、实验目的本实验的主要目的是进行细胞原代培养，通过对细胞的体外生长和繁殖过程进行观察和研究，以了解细胞的生物学特性，探索细胞生长、分化和凋亡的机制，为细胞生物学、肿瘤学、药理学等领域的研究提供实验基础。
二、实验原理细胞原代培养是指将组织样本通过一定的消化和培养技术，获得并培养单细胞悬液的过程。
这些细胞可以在体外生长和繁殖，并保持一定的生物学特性。
通过细胞原代培养，我们可以对细胞的生长、分化和凋亡过程进行深入研究，了解细胞的生物学特性，探索疾病的发病机制和药物的作用机制。
三、实验步骤1.组织样本准备：选取适当的组织样本，用PBS洗涤并用剃毛刀除去表面脂肪和结缔组织，切成1-2mm3的小块。
2.消化：将组织块加入含有胰蛋白酶和EDTA的消化液中，在37℃下消化10-15分钟。
期间需轻轻摇动几次以促进细胞释放。
3.细胞悬液制备：消化完成后，将消化液过滤至100目筛网，用PBS洗涤并离心（1000rpm，5分钟）去除上清液。
加入适量培养基制成细胞悬液。
4.细胞培养：将细胞悬液接种到培养瓶中，加入适量培养基进行培养。
在培养期间需注意观察细胞的生长情况和更换培养基。
5.细胞传代：当细胞生长到一定密度时，可以进行传代。
用胰蛋白酶消化细胞并离心收集，加入适量培养基制成细胞悬液，按比例接种到新的培养瓶中。
6.实验记录：在整个实验过程中，需要对细胞的生长情况、形态学变化等进行详细记录。
同时，需要定期拍照记录细胞的生长情况。
7.结果分析：通过对细胞的生长情况、形态学变化等进行观察和分析，可以得出有关细胞生物学特性的结论。
四、实验结果及数据分析1.实验结果（请在此插入不同时间点的细胞生长照片）通过观察和记录细胞的生长情况，我们发现原代细胞在接种后的前几天内处于适应期，细胞数量增长较慢。
随后，细胞数量开始加速增长，并逐渐形成集落。
传代后，细胞的生长速度又逐渐减缓，但仍然保持稳定增长。
原代细胞培养方法
原代细胞培养方法原代细胞培养方法一、介绍原代细胞培养的概念和重要性：原代细胞是从人或动物体内初次分离出的细胞，具有体内组织原始性和遗传特性的稳定性。
原代细胞培养是一种重要的实验手段，广泛应用于生物学、医学和药物研发等领域。
通过原代细胞培养，可以研究细胞的生长、分化、凋亡以及与疾病相关的分子机制等。
二、准备原代细胞培养的基本设备和试剂：1. 培养箱和细胞培养用的培养皿：培养箱提供恒温和湿度控制，保持培养环境的稳定；培养皿用于细胞的贴壁培养和传代。
2. 细胞培养无菌耗材：如细胞培养板、培养瓶、离心管等。
3. 细胞培养液：如DMEM、RPMI 1640等。
需根据实验需求选择适当的培养液，并添加适当浓度的血清、生长因子等。
4. 酶消化液：如胰蛋白酶、胶原酶等，用于细胞的分离和传代。
5. 生物安全柜和消毒液：用于操作细胞时的无菌保护和实验室的消毒。
三、原代细胞培养的步骤：1. 组织样本的收集：选择合适的组织样本，如肺、肝脏、肾脏等，进行无菌采集。
2. 组织的消化：将组织样本切成小块，加入适量的酶消化液，在恒温摇床上消化一段时间，使细胞分散。
3. 细胞的离心和洗涤：将消化后的细胞离心，去除酶消化液，并用适量的培养液洗涤细胞，去除残留的异物和垃圾。
4. 细胞的贴壁培养：将洗涤好的细胞转移到培养皿中，加入适量的培养液，将培养皿放入培养箱中，培养维持适当的温度和湿度。
5. 细胞的传代：当细胞达到一定密度时，用酶消化液进行细胞的分离和传代，将细胞转移到新的培养皿中，以保证细胞的生长和扩增。
四、原代细胞培养的注意事项：1. 保持无菌操作：在生物安全柜中进行细胞培养，并使用无菌试剂和耗材，避免细菌和真菌的污染。
2. 控制培养条件：根据不同细胞类型的要求，调整培养液中的成分和浓度，以及培养箱中的温度和湿度。
3. 注意细胞的健康状态：细胞的形态、增殖情况和凋亡等指标应定期观察和记录，及时发现和解决细胞培养中的问题。
4. 合理的细胞传代次数：每个细胞类型的传代次数有一定限制，过多的传代会导致细胞功能和稳定性的下降。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告引言原代培养是一种将从组织或器官中分离得到的细胞进行体外培养的方法。
它具有重要的科研和临床应用价值。
本实验报告将详细介绍细胞原代培养的步骤、影响因素以及常见问题的解决办法，以及对细胞培养实验的观察结果和分析。
材料与方法1. 实验所用细胞系我们选择了小鼠胚胎纤维细胞（MEF）作为实验所用细胞系。
MEF细胞具有较强的增殖能力和较长的寿命，非常适合原代培养实验。
2. 原代细胞培养基的配制与消毒配制原代细胞培养基的主要成分有： - DMEM培养基 - 胎牛血清（FBS） - 青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）配制原始培养基时要进行严格的消毒操作，以防止细菌和真菌的污染。
3. 细胞分离与传代分离过程1.取出小鼠胚胎。
2.将小鼠胚胎置于无菌PBS中，去除头部和内脏。
3.将净化后的胚胎置于细胞培养基中。
4.用无菌耐热胶管切成碎片，使其均匀分散。
5.加入细胞培养基中的胞外消化液。
6.重复离心和去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
7.加入预暖的细胞培养基，充分悬浮细胞。
8.继续离心、去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
传代过程1.收集上述分离得到的细胞悬液。
2.用血细胞计数板计数细胞数目。
3.计算倍增比例，将细胞悬液按比例加入新鲜的细胞培养基中。
4.转移至新的细胞培养瓶中，继续培养。
4. 影响细胞培养的因素4.1 培养基的质量培养基中的成分质量直接影响到细胞的生长和增殖能力。
优质的培养基会提供细胞所需的营养物质和生长因子。
4.2 培养条件的控制细胞的生长需要适宜的培养条件，如适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
同时，细胞培养过程中需要定期更换培养基，以保持培养环境的稳定性。
4.3 质量检测与细胞鉴定在细胞培养的过程中，定期进行培养基的质量检测和细胞的鉴定非常重要。
常用的质量检测方法包括菌落计数法和PCR方法。
结果与讨论1. 细胞形态观察在细胞原代培养的过程中，我们进行了细胞形态的观察。
原代培养_实验报告
一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉细胞培养所需的设备和试剂。
3. 了解细胞培养过程中可能遇到的问题及解决方法。
二、实验原理原代培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理条件，使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
原代培养细胞与体内细胞在形态结构和功能活动上具有相似性，适用于研究细胞生长、代谢、分化等生物学特性。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠、大鼠等。
2. 组织：肝脏、脾脏、皮肤等。
3. 试剂：胰蛋白酶、EDTA、胎牛血清、DMEM培养基等。
4. 设备：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、移液器、离心机等。
四、实验步骤1. 组织块制备（1）取动物组织，用生理盐水清洗，去除血污。
（2）将组织剪成1mm×1mm×1mm的小块。
（3）将组织块置于含有胰蛋白酶的消毒培养皿中，37℃水浴消化15-20分钟。
（4）加入适量胎牛血清终止消化，用吸管吹打组织块，使其分散成单个细胞。
2. 细胞接种（1）将分散后的细胞悬液移至含有DMEM培养基的培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。
（2）观察细胞生长情况，适时更换新鲜培养基。
3. 细胞传代（1）待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞。
（2）收集消化后的细胞，加入胎牛血清终止消化。
（3）将细胞悬液接种至新的培养瓶中，继续培养。
4. 细胞观察（1）使用倒置显微镜观察细胞形态、生长状态等。
（2）对细胞进行染色，如台盼蓝染色、Giemsa染色等，观察细胞核、细胞器等结构。
五、实验结果1. 原代细胞在培养过程中呈现典型的贴壁生长，细胞形态为多边形、梭形等。
2. 细胞生长速度较快，2-3天即可达到80%的融合度。
3. 细胞传代过程中，细胞生长状态良好，无明显形态变化。
六、实验讨论1. 原代细胞培养过程中，无菌操作至关重要。
应确保所有操作均在超净工作台内进行，避免污染。
2. 培养基的配制和质量直接影响细胞生长。
应严格按照试剂说明书配制培养基，并确保其质量。
实验二_原代细胞培养
三、细胞培养的条件要求 1）细胞密度 原代细胞：4-6×105个/ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱl 传代细胞：2-3×105个/ml 2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.67.8 3）培养温度
四、操作步骤
1. 取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和 酒精消毒气室部。
10.轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每 瓶约0.2-0.5ml，补加DMEM生长液至 10ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上 盖子，置于37℃恒温箱中培养。
11.细胞计数方法 取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸
（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min， 充分振荡后进行计数。
2. 无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜， 穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚 放于灭菌平皿中。
3. 用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用 无血清的DMEM冲冼2次。
4. 将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳 糜状。
5. 将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5ml无血 清 DMEM，振摇几次，静置几分钟，吸弃洗 液。如此重复1次。
实验二 原代细胞培养
（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形
态，掌握鸡胚成纤维细胞
的制备与培养方法。
A
B
A 上皮细胞 B 成纤维细胞
二、材料 1. 9-12日龄鸡胚 2. 照蛋灯与蛋座 3. 碘酊棉球与酒精棉球 4. 大剪子、眼科剪、小镊子 5. 平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶 6. 0.25%胰酶 7. 基础培养液：DMEM
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数 （N）。
细胞原代培养实验总结
细胞原代培养实验总结引言细胞培养是生物科学研究中重要的技术手段之一，通过培养细胞，可以进一步研究细胞的生物学特性，了解其生长规律、代谢特征以及相应的分子机制。
本文将对细胞原代培养实验进行总结，包括实验的过程、关键步骤以及一些经验和技巧。
实验过程材料准备进行细胞原代培养实验，需要准备一系列实验材料，包括培养基、细胞培养酶、培养皿、离心管等。
在准备材料时，需要保证其纯度和质量，以确保实验的可靠性和重复性。
细胞分离首先，从组织或者细胞源中获得待培养的原代细胞。
通过消化组织或细胞样本，使用适当的酶或消化液，将细胞从组织中分离出来。
分离的细胞可以经过离心等方法获得。
细胞传代将分离得到的原代细胞进行传代是细胞培养实验中的重要步骤。
传代可以使细胞得以继续生长和繁殖，以获得足够数量的细胞用于后续实验。
传代的时机需要根据细胞的生长速度和需求进行判断，并在合适的时机进行。
细胞培养将原代细胞和传代细胞置于培养皿中，加入适量的培养基和其他必需的添加剂，建立细胞培养体系。
细胞培养过程需要一定的条件，包括适宜的温度、湿度、气体氛围等。
培养皿需要在无菌条件下操作，以避免细菌或其他微生物的污染。
鉴定和检测进行细胞原代培养实验后，需要对培养的细胞进行鉴定和检测，以验证其纯度和活性。
常用的方法包括细胞形态观察、细胞计数、细胞存活率检测、细胞周期分析等。
这些检测方法可以帮助研究者了解细胞的状态和特征，为后续的实验设计提供参考数据。
关键步骤细胞分离的优化细胞分离是细胞原代培养实验中的关键步骤之一。
为了获得较高的细胞分离效率，可以优化分离条件，如调整消化液的浓度和作用时间，选择合适的分离方法等。
此外，在分离过程中需要注意对细胞的机械刺激要尽量避免，以减少细胞的损伤和死亡。
培养基的选择和优化培养基是细胞培养实验中至关重要的因素之一，直接影响到细胞的生长和活性。
根据不同细胞类型的要求，选择适合的基础培养基，并根据实验需要添加相应的添加剂，如生长因子、血清、抗生素等。
细胞的原代培养和传代培养
实验五细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。
进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。
所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。
原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。
一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。
传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。
细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。
培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。
将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。
要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。
此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。
贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。
加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。
但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。
常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。
二者可分别使用，也可共同使用。
钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。
细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。
细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。
原代细胞的培养
原代细胞的培养原代细胞的培养不知道遭到多少研究生及博士生吐槽，其真实情况是，一边在超净工作台上哭，一边手上还在不停地提取原代细胞。
相比较细胞系细胞而言，原代细胞的培养周期长、成本高、摸索困难。
从大鼠的筛选分笼到母鼠受精怀孕，从孕育周期的看护到胎鼠的出生降临，从胎鼠脑组织的提取到神经细胞的培养，到最后的药物对原代细胞的作用机制研究。
这种复杂和辛苦的原代培养过程，其实也是最能反应药物在实验小白鼠上作用机制和效果最真实的反应。
1、大鼠的筛选和分笼首先是一个大笼子里放6只大鼠（5雌性，1雄性），每隔两天喂水和繁殖饲料，一星期给大鼠换一次垫料（给大鼠换垫料是体力活）。
舒适的空间和环境能让大鼠更好地繁殖，产下更多的胎鼠用于科学研究。
2、原代细胞的提取及培养原代细胞的提取一般是将胎鼠先用纯净水冲洗干净，在放进超净工作台处理。
先将胎鼠放入75%酒精消毒1min,再用手术剪刀将胎鼠的脑组织提取出来，放入遇冷的D-Hank's液中。
用手术剪刀将皮层的脑组织剪碎，加入等体积的0.25%胰酶进行消化，置于二氧化碳培养箱37℃培养。
（1）新生大鼠原代海马组织中神经干细胞的培养取新生24h内新生大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min，用剪刀将头颅取下，剥离颅骨，暴露皮质下海马组织，于冰上快速取出组织放在遇冷的DMEM/F12或者PBS缓冲液中清洗，吸出置于15mLEP中，加入ACCUTASE1.5-2.0mL置于培养箱中，37℃、5%CO2混匀消化10min，取出混匀吹打组织块，1000r.5min-1离心，加入培养基重悬细胞过200目细胞筛（70μm），置于37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养。
通过Nestin染色鉴定星形胶质细胞以确保纯度。
（2）大脑皮层原代星形胶质细胞培养细胞制备和培养从1 日龄新生Sprague-Dawley 大鼠的大脑皮层制备原代星形胶质细胞。
简而言之，分离大脑皮质并用0.25% 胰蛋白酶在37°C下消化15 分钟，然后通过70 μm 细胞过滤器过滤。
细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养
小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。
原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。
因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。
一般采用2-5代的细胞进行实验。
当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。
组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。
但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。
组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。
2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告细胞原代培养实验报告细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。
本实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。
我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果分析。
实验步骤：1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。
然后将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。
最后通过过滤器筛选，获取单个细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和抗生素。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。
使用显微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。
4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培养皿上剥离下来。
将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按照相同的条件进行培养。
实验结果：在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。
初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。
随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。
在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。
细胞体积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。
细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。
随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。
细胞密度逐渐增加，细胞聚落的大小也逐渐增大。
同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起的数量和长度有所增加。
实验讨论：细胞原代培养是一种常用的实验方法，可以用于研究细胞的生长、增殖和分化等生物学特性。
在本实验中，我们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞进行原代培养，并观察到了细胞的生长和变化。
细胞的形态特征对于细胞的功能和特性具有重要的指示意义。
在本实验中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征，这与之前的研究结果一致。
细胞原代培养-细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的方法：1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。
取材应严格无菌。
取材和原代细胞整理时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
二、实验目的1、理解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养的应用4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。
动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤1、购买9-12日龄鸡胚蛋。
放入孵化箱中孵养待用。
2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。
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2017.10.12
一、实验原理
原代培养是直接从机体获取组织后,通过组织块长 出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单 个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培 养。
原代培养的方法主要包括组织块培养和分散细胞 培养。
组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶 壁上，加入培养基后进行培养。
养皿（或一次性无菌培养皿）中，并用D-Hanks液冲 洗鸡胚。
6. 用无菌眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，
然后用D-Hanks液充分洗涤躯干。
7.将躯干部置于小平皿盖中。用D–Hanks液至少洗涤3 次，充分弃除红细胞。
8.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。
9.在胚胎组织碎块中加入1毫升（1滴管）胎牛血清， 用滴管吸取组织块，将组织碎块接种到培养瓶内。 在培养瓶中放置10-15个组织块，静置3-5 min，然 后反转培养瓶，使接种组织块的培养瓶面在上。
四、注意事项
1.原代培养材料的选择,尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或 者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。 2.要注意无菌操作。其要求应高于外科手术。 3.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时 再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮 起来。如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也 因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。
分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细 胞分散成为单细胞。
鸡胚（chick embryo or embryonated egg）
பைடு நூலகம்对鸡胚的研究可以追溯到古希腊亚里士多德， 鸡胚在疫苗的开发和研究中有着不可替代的作用。
二、实验目的
1.了解原代细胞培养的一般方法与步骤 2.了解鸡胚的基本结构 3.巩固无菌操作技术
12.待细胞铺满瓶壁后，弃去培养液，用胰酶消化细胞。弃去消化液, 待细胞皱缩变圆。
13.补加培养液，轻轻将细胞吹打下来，吹打均匀。将培养物吸置离心管 内，静置5 min。
14.上层为单细胞悬液，下层为组织块沉淀。将上层单细胞悬液轻轻吸置 另一离心管内,弃组织块。
15.以800—1000 rpm 离心5min，弃上清液。加入培养液，重新悬浮细胞， 转移至心得培养瓶中以传代培养。
思考题
• 如何提高原代细胞培养的成功率？ • 为克服微生物污染应采取那些措施？
• 下次课主要内容：细胞爬片
10.向培养瓶中无组织块的一面（下面）加入完全培 养基，注意不要冲到组织块。 将培养瓶放在37℃、 5％CO2培养箱中培养。
11. 4小时后翻转培养瓶。培养开始的前两天不要晃动培养瓶。两天后 在倒置显微镜下观察（第三天见植块附着在培养瓶壁，周围生长出 细胞，补充或更换培养液继续培养，并拍照留存结果）。
1. 将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。
2. 在D–Hanks液中按1：100的比例加入双抗。
3. 取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边 界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球 擦拭蛋壳。
4. 用镊子或砂轮在鸡蛋气室位置敲/划一道裂痕，
然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。
5.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培
三、实验材料及设备
1.实验动物 9至12日龄的鸡胚
2.试 剂 D–Hanks缓冲液、DMEM培养基、血清、抗生素
3.仪 器 超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜
4.其它用品：
手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃 平皿、培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液 缸，75％酒精棉球，酒精灯
四、实验步骤：