细胞生物学实验-细胞的原代培养

原代培养
2017.10.12
一、实验原理
原代培养是直接从机体获取组织后,通过组织块长 出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单 个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培 养。
原代培养的方法主要包括组织块培养和分散细胞 培养。
组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶 壁上，加入培养基后进行培养。
三、实验材料及设备
1.实验动物 9至12日龄的鸡胚
2.试 剂 D–Hanks缓冲液、DMEM培养基、血清、抗生素
3.仪 器 超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜
4.其它用品：
手术小源自文库剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃 平皿、培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液 缸，75％酒精棉球，酒精灯
四、实验步骤：
1. 将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。
2. 在D–Hanks液中按1：100的比例加入双抗。
3. 取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边 界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球 擦拭蛋壳。
4. 用镊子或砂轮在鸡蛋气室位置敲/划一道裂痕，
然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。
5.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培
四、注意事项
1.原代培养材料的选择,尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或 者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。 2.要注意无菌操作。其要求应高于外科手术。 3.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时 再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮 起来。如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也 因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。
10.向培养瓶中无组织块的一面（下面）加入完全培 养基，注意不要冲到组织块。 将培养瓶放在37℃、 5％CO2培养箱中培养。
11. 4小时后翻转培养瓶。培养开始的前两天不要晃动培养瓶。两天后 在倒置显微镜下观察（第三天见植块附着在培养瓶壁，周围生长出 细胞，补充或更换培养液继续培养，并拍照留存结果）。
养皿（或一次性无菌培养皿）中，并用D-Hanks液冲 洗鸡胚。
6. 用无菌眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，
然后用D-Hanks液充分洗涤躯干。
7.将躯干部置于小平皿盖中。用D–Hanks液至少洗涤3 次，充分弃除红细胞。
8.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。
9.在胚胎组织碎块中加入1毫升（1滴管）胎牛血清， 用滴管吸取组织块，将组织碎块接种到培养瓶内。 在培养瓶中放置10-15个组织块，静置3-5 min，然 后反转培养瓶，使接种组织块的培养瓶面在上。
思考题
• 如何提高原代细胞培养的成功率？ • 为克服微生物污染应采取那些措施？
• 下次课主要内容：细胞爬片
分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细 胞分散成为单细胞。
鸡胚（chick embryo or embryonated egg）
对鸡胚的研究可以追溯到古希腊亚里士多德， 鸡胚在疫苗的开发和研究中有着不可替代的作用。
二、实验目的
1.了解原代细胞培养的一般方法与步骤 2.了解鸡胚的基本结构 3.巩固无菌操作技术
12.待细胞铺满瓶壁后，弃去培养液，用胰酶消化细胞。弃去消化液, 待细胞皱缩变圆。
13.补加培养液，轻轻将细胞吹打下来，吹打均匀。将培养物吸置离心管 内，静置5 min。
14.上层为单细胞悬液，下层为组织块沉淀。将上层单细胞悬液轻轻吸置 另一离心管内,弃组织块。
15.以800—1000 rpm 离心5min，弃上清液。加入培养液，重新悬浮细胞， 转移至心得培养瓶中以传代培养。