蛋白酶的盐析沉淀实验报告
蛋白质沉淀反应实验报告
一、实验目的1. 理解蛋白质沉淀反应的基本原理。
2. 掌握常用的蛋白质沉淀方法。
3. 分析蛋白质沉淀反应的影响因素。
4. 学习蛋白质沉淀反应在生物科学中的应用。
二、实验原理蛋白质沉淀反应是指在一定条件下，蛋白质从溶液中析出的现象。
蛋白质沉淀反应的原因主要有两种：一是破坏蛋白质的水化膜，二是中和蛋白质所带的电荷。
当蛋白质的水化膜被破坏或电荷被中和时，蛋白质颗粒之间的相互排斥力减弱，导致蛋白质颗粒聚集形成沉淀。
蛋白质沉淀反应在生物科学中具有广泛的应用，如蛋白质的分离、纯化、定量分析等。
三、实验材料1. 蛋白质溶液：鸡蛋清溶液、牛奶蛋白质溶液等。
2. 沉淀剂：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、乙醇、甲醇、氯仿等。
3. 实验仪器：试管、移液管、滴管、pH计、离心机等。
四、实验方法1. 盐析法：向蛋白质溶液中加入适量的硫酸铵，观察蛋白质沉淀现象。
2. 低温沉淀法：将蛋白质溶液置于低温条件下，观察蛋白质沉淀现象。
3. 有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入适量的乙醇或甲醇，观察蛋白质沉淀现象。
4. 重金属盐沉淀法：向蛋白质溶液中加入适量的重金属盐（如氯化汞），观察蛋白质沉淀现象。
五、实验步骤1. 准备蛋白质溶液：取鸡蛋清溶液或牛奶蛋白质溶液，用蒸馏水稀释至一定浓度。
2. 盐析法：向蛋白质溶液中加入适量的硫酸铵，观察蛋白质沉淀现象。
3. 低温沉淀法：将蛋白质溶液置于4℃低温条件下，观察蛋白质沉淀现象。
4. 有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入适量的乙醇或甲醇，观察蛋白质沉淀现象。
5. 重金属盐沉淀法：向蛋白质溶液中加入适量的重金属盐（如氯化汞），观察蛋白质沉淀现象。
6. 记录实验结果，分析沉淀现象。
六、实验结果与分析1. 盐析法：向蛋白质溶液中加入硫酸铵后，观察到蛋白质沉淀现象。
这是因为硫酸铵破坏了蛋白质的水化膜，同时中和了蛋白质所带的电荷，导致蛋白质颗粒聚集形成沉淀。
2. 低温沉淀法：将蛋白质溶液置于4℃低温条件下，观察到蛋白质沉淀现象。
蛋白质的沉淀反应实验报告
蛋白质的沉淀反应实验报告一、实验目的1、掌握几种常用的使蛋白质沉淀的方法。
2、理解蛋白质沉淀的原理和应用。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子化合物。
在一定条件下，蛋白质分子会发生沉淀现象。
蛋白质沉淀的原因主要有以下几种：1、盐析：在蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵、氯化钠等，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度逐渐降低而沉淀析出。
这是因为中性盐会破坏蛋白质分子表面的水化膜，并中和蛋白质分子所带的电荷，从而使其沉淀。
盐析沉淀的蛋白质一般不变性，经透析或超滤等方法除去盐后，蛋白质仍能恢复其原有的溶解性和生物活性。
2、有机溶剂沉淀：向蛋白质溶液中加入一定量的有机溶剂，如乙醇、丙酮等，可使蛋白质沉淀。
这是因为有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子之间的静电引力，同时还能破坏蛋白质分子的水化膜，导致蛋白质沉淀。
有机溶剂沉淀的蛋白质往往会发生变性，失去其原有的生物活性。
3、重金属盐沉淀：蛋白质在碱性溶液中可与重金属离子，如汞离子、铅离子等结合形成不溶性的盐而沉淀。
这种沉淀反应是由于重金属离子与蛋白质分子中的巯基、羧基等基团结合，从而破坏了蛋白质的结构，导致其沉淀。
重金属盐沉淀的蛋白质通常会发生变性。
4、生物碱试剂沉淀：生物碱试剂，如苦味酸、鞣酸等，能与蛋白质分子中的碱性基团结合而沉淀。
这种沉淀反应常用于定性和定量分析蛋白质。
三、实验材料与仪器1、实验材料蛋白质溶液（鸡蛋清稀释液）饱和硫酸铵溶液乙醇氯化汞溶液苦味酸溶液氢氧化钠溶液醋酸溶液2、实验仪器试管试管架滴管离心机四、实验步骤1、盐析沉淀取 2 支试管，分别加入 2mL 蛋白质溶液。
向其中一支试管中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加边振荡，直至出现沉淀为止。
将另一支试管作为对照，观察现象。
2、有机溶剂沉淀取 2 支试管，分别加入 2mL 蛋白质溶液。
向其中一支试管中逐滴加入乙醇，边加边振荡，直至出现沉淀为止。
将另一支试管作为对照，观察现象。
蛋白的沉淀实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质的沉淀原理及其应用；2. 掌握常用蛋白质沉淀方法，如盐析、酸沉、有机溶剂沉淀等；3. 学习蛋白质沉淀实验的操作步骤及注意事项。
二、实验原理蛋白质在溶液中处于溶解状态，当受到某些物理或化学因素的影响时，其溶解度会降低，从而导致蛋白质从溶液中析出。
这种现象称为蛋白质的沉淀。
蛋白质沉淀的方法有很多种，常见的有盐析、酸沉、有机溶剂沉淀等。
盐析：在一定浓度的盐溶液中，蛋白质的溶解度降低，从而使蛋白质从溶液中析出。
盐析过程中，盐的浓度越高，蛋白质的沉淀效果越好。
酸沉：在酸性条件下，蛋白质的溶解度降低，从而使蛋白质从溶液中析出。
酸沉过程中，pH值越低，蛋白质的沉淀效果越好。
有机溶剂沉淀：有机溶剂能破坏蛋白质的氢键、疏水作用等，使蛋白质的溶解度降低，从而使其从溶液中析出。
有机溶剂沉淀过程中，溶剂的浓度越高，蛋白质的沉淀效果越好。
三、实验材料1. 蛋白质溶液：牛血清白蛋白（BSA）溶液；2. 盐析试剂：饱和硫酸铵溶液；3. 酸沉试剂：0.1mol/L HCl溶液；4. 有机溶剂沉淀试剂：无水乙醇；5. 实验器材：试管、移液管、量筒、磁力搅拌器、离心机等。
四、实验步骤1. 取5支试管，分别编号为1-5；2. 在1-5号试管中分别加入2ml牛血清白蛋白溶液；3. 在1号试管中加入1ml饱和硫酸铵溶液，充分振荡后静置观察；4. 在2号试管中加入2滴0.1mol/L HCl溶液，充分振荡后静置观察；5. 在3号试管中加入1ml无水乙醇，充分振荡后静置观察；6. 在4号试管中加入1ml饱和硫酸铵溶液，再加入2滴0.1mol/L HCl溶液，充分振荡后静置观察；7. 在5号试管中加入1ml饱和硫酸铵溶液，再加入1ml无水乙醇，充分振荡后静置观察；8. 将所有试管在室温下静置30分钟；9. 观察各试管中蛋白质的沉淀情况，记录实验结果；10. 将沉淀后的溶液进行离心，取上清液进行分析。
五、实验结果与分析1. 盐析：在1号试管中加入饱和硫酸铵溶液后，蛋白质从溶液中析出，形成白色沉淀；2. 酸沉：在2号试管中加入HCl溶液后，蛋白质从溶液中析出，形成白色沉淀；3. 有机溶剂沉淀：在3号试管中加入无水乙醇后，蛋白质从溶液中析出，形成白色沉淀；4. 盐析+酸沉：在4号试管中加入饱和硫酸铵溶液和HCl溶液后，蛋白质的沉淀效果更好；5. 盐析+有机溶剂沉淀：在5号试管中加入饱和硫酸铵溶液和无水乙醇后，蛋白质的沉淀效果更好。
蛋白质的沉淀实验报告
蛋白质的沉淀实验报告一、实验目的1、了解蛋白质沉淀的基本原理和方法。
2、掌握几种常见的蛋白质沉淀试剂的作用特点。
3、观察不同条件下蛋白质沉淀的现象，分析影响蛋白质沉淀的因素。
二、实验原理蛋白质是一种生物大分子，其分子表面带有许多可解离的基团，如氨基、羧基等，在一定的溶液 pH 值条件下，这些基团会解离，使蛋白质分子带有电荷。
此外，蛋白质分子还具有亲水性，能与水分子形成氢键，从而在水溶液中形成稳定的胶体溶液。
当溶液的条件发生改变，如加入某些试剂、改变溶液的 pH 值、温度或离子强度等，蛋白质分子表面的电荷分布和水化层会受到影响，导致蛋白质分子之间的相互作用力发生变化，从而使其从溶液中沉淀出来。
常见的蛋白质沉淀方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱试剂沉淀法等。
三、实验材料与仪器1、实验材料鸡蛋清：新鲜鸡蛋，打破后取蛋清备用。
牛血清白蛋白溶液。
饱和硫酸铵溶液。
丙酮。
3%硝酸银溶液。
10%三氯乙酸溶液。
5%鞣酸溶液。
01mol/L 氢氧化钠溶液。
01mol/L 盐酸溶液。
2、实验仪器离心机。
恒温水浴锅。
试管、滴管、玻璃棒、量筒等。
四、实验步骤1、盐析沉淀取两支试管，分别加入2ml 鸡蛋清溶液和2ml 牛血清白蛋白溶液。
向两支试管中缓慢逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加边轻轻搅拌，直至出现沉淀。
观察沉淀的生成情况，并记录所加饱和硫酸铵溶液的量。
2、有机溶剂沉淀取两支试管，分别加入2ml 鸡蛋清溶液和2ml 牛血清白蛋白溶液。
向两支试管中分别缓慢加入 4ml 丙酮，边加边轻轻搅拌。
观察沉淀的生成情况。
3、重金属盐沉淀取两支试管，分别加入2ml 鸡蛋清溶液和2ml 牛血清白蛋白溶液。
向两支试管中分别缓慢滴加 3%硝酸银溶液，边加边轻轻搅拌，观察沉淀的生成情况。
4、生物碱试剂沉淀取两支试管，分别加入2ml 鸡蛋清溶液和2ml 牛血清白蛋白溶液。
向两支试管中分别缓慢滴加 5%鞣酸溶液，边加边轻轻搅拌，观察沉淀的生成情况。
盐析沉淀蛋白实验报告
一、实验目的1. 了解盐析沉淀蛋白质的原理和方法。
2. 掌握盐析沉淀蛋白质的实验操作步骤。
3. 分析盐析沉淀蛋白质的影响因素。
二、实验原理盐析沉淀蛋白质是一种利用中性盐溶液降低蛋白质溶解度的方法。
在蛋白质溶液中加入中性盐，随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低，最终从溶液中沉淀析出。
盐析沉淀蛋白质的原理如下：1. 中性盐与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质表面的水化膜，降低蛋白质溶解度。
2. 中性盐中和蛋白质表面的电荷，降低蛋白质之间的静电斥力，使蛋白质分子聚集，从而沉淀。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质溶液（如鸡蛋清、牛奶等）- 中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）- 双缩脲试剂- 滤纸- 离心机- 移液管- 试管- 恒温水浴锅2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 烧杯- 酒精灯- 烧杯夹- 铁架台四、实验步骤1. 准备蛋白质溶液：取一定量的蛋白质溶液，加入适量的中性盐，充分搅拌，使中性盐溶解。
2. 盐析沉淀：将蛋白质溶液置于恒温水浴锅中，加热至一定温度（如60℃），保温一段时间（如30分钟），使蛋白质充分沉淀。
3. 过滤：将保温后的蛋白质溶液用滤纸过滤，收集沉淀。
4. 洗涤：用蒸馏水冲洗沉淀，去除未沉淀的杂质。
5. 干燥：将沉淀置于干燥器中，干燥至恒重。
6. 检测：取一定量的沉淀，加入双缩脲试剂，观察颜色变化，判断蛋白质的存在。
五、实验结果与分析1. 实验结果：在实验过程中，蛋白质溶液逐渐出现沉淀，沉淀物呈白色或乳白色。
通过双缩脲试剂检测，沉淀物中存在蛋白质。
2. 实验分析：- 盐析沉淀效果与中性盐的种类、浓度、温度等因素有关。
实验结果表明，硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等中性盐均能有效沉淀蛋白质。
- 盐析沉淀效果与蛋白质溶液的浓度有关。
蛋白质溶液浓度越高，盐析沉淀效果越好。
- 盐析沉淀效果与保温时间有关。
保温时间越长，蛋白质沉淀效果越好。
六、实验结论本实验成功实现了蛋白质的盐析沉淀，验证了盐析沉淀蛋白质的原理和方法。
盐析法实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质的盐析原理及其在蛋白质分离纯化中的应用。
2. 掌握盐析法沉淀蛋白质的操作步骤和注意事项。
3. 学习通过改变盐浓度来控制蛋白质的沉淀和溶解。
二、实验原理蛋白质在溶液中处于溶解状态时，其表面带有电荷，使得蛋白质分子相互排斥，保持分散状态。
当向蛋白质溶液中加入一定浓度的盐时，盐离子会与蛋白质表面的电荷发生中和作用，减少蛋白质分子间的静电斥力，从而使蛋白质分子聚集形成沉淀。
这种现象称为盐析。
盐析法是一种常用的蛋白质沉淀方法，具有操作简单、成本低廉、条件温和等优点。
通过调节盐浓度，可以控制蛋白质的沉淀和溶解，实现蛋白质的分离纯化。
三、实验材料与仪器材料：- 牛血清白蛋白（BSA）- 氯化钠（NaCl）- 0.1mol/L盐酸- 0.1mol/L氢氧化钠- 蛋白质浓度测定试剂盒- 移液器- 离心机- 756紫外-可见分光光度计四、实验步骤1. 配制蛋白质溶液：将BSA溶解于0.1mol/L盐酸溶液中，配制成浓度为1mg/mL的蛋白质溶液。
2. 配制不同浓度的盐溶液：将氯化钠溶于蒸馏水中，配制成0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L和2.0mol/L的盐溶液。
3. 加入盐溶液：分别取1mL蛋白质溶液，加入不同浓度的盐溶液，充分混合。
4. 观察沉淀现象：观察蛋白质溶液在加入不同浓度盐溶液后的沉淀情况，记录沉淀出现的盐浓度。
5. 离心分离：将混合后的溶液以3000r/min离心10分钟，取上清液进行蛋白质浓度测定。
6. 蛋白质浓度测定：使用蛋白质浓度测定试剂盒，按照说明书进行操作，测定沉淀前后的蛋白质浓度。
五、实验结果与分析1. 沉淀现象：随着盐浓度的增加，蛋白质溶液的沉淀现象逐渐明显。
当盐浓度为0.5mol/L时，蛋白质开始出现沉淀；当盐浓度为1.5mol/L时，沉淀现象最为明显。
2. 蛋白质浓度：通过离心分离和蛋白质浓度测定，可以发现，沉淀前后蛋白质浓度基本保持不变，说明盐析过程中蛋白质未发生变性。
盐析沉淀实验报告
1. 了解盐析沉淀的原理及其在蛋白质分离中的应用。
2. 掌握盐析沉淀实验的操作步骤和注意事项。
3. 分析实验结果，验证盐析沉淀的效果。
二、实验原理盐析沉淀是一种利用盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低蛋白质溶解度的方法。
当向蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、氯化钠等）时，盐离子与蛋白质分子表面的电荷发生中和，破坏了蛋白质表面的水化膜，使蛋白质溶解度降低，从而发生沉淀。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 牛血清白蛋白（BSA）溶液- 硫酸铵- 氯化钠- 蒸馏水- pH计- 离心机- 移液器- 试管2. 实验仪器：- 烧杯- 电子天平- 磁力搅拌器- 显微镜1. 准备实验材料：称取一定量的硫酸铵和氯化钠，分别配制成不同浓度的溶液。
2. 准备蛋白质溶液：取一定量的BSA溶液，用pH计测定其pH值，调整至中性。
3. 进行盐析沉淀实验：a. 将BSA溶液分为三份，分别加入不同浓度的硫酸铵溶液。
b. 将BSA溶液分别加入不同浓度的氯化钠溶液。
c. 将三份溶液置于磁力搅拌器上，搅拌30分钟。
d. 将溶液离心，收集沉淀。
4. 观察并记录实验现象：a. 观察溶液的颜色变化、沉淀的形成情况。
b. 使用显微镜观察沉淀的形态。
5. 分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 实验现象：a. 随着硫酸铵浓度的增加，BSA溶液的颜色逐渐变浅，沉淀逐渐增多。
b. 随着氯化钠浓度的增加，BSA溶液的颜色变化不明显，沉淀逐渐增多。
c. 在硫酸铵浓度为2M时，沉淀最为明显，溶液颜色变浅。
2. 结果分析：a. 盐析沉淀的效果与盐的浓度有关，浓度越高，沉淀效果越好。
b. 硫酸铵对BSA的沉淀效果优于氯化钠，可能是由于硫酸铵的离子强度较高，对蛋白质的沉淀作用更强。
c. 在实验过程中，溶液的颜色变化与沉淀的形成密切相关，颜色越浅，沉淀越多。
六、实验结论通过本实验，我们验证了盐析沉淀的原理及其在蛋白质分离中的应用。
实验结果表明，盐析沉淀是一种简单、有效的蛋白质分离方法，可以用于实验室和工业生产中的蛋白质提取和纯化。
实验四 碱性蛋白酶的盐析沉淀
1.制备酶液 称取 40g 碱性蛋白酶粗粉，加入 400mL40-50℃温水，40℃水浴中浸泡并搅拌 30min,
高速冷冻离心机离心：10℃，9000-10000r/min，30min,取出上清液，渣再用上述相同方法 浸取一次，合并上清液，即为制得的蛋白酶液，要求酶活达到 1.5 万-2.0 万 U/ml。 2.蛋白酶液用 6mol/L NaOH 调 pH 至 8.0-8.5，分别量取 10 mL 于 7 只 15 mL 离心管中，记 录 pH 和室温。 3.计算达到 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%饱和度所需加入的固体硫酸铵量， 计算各饱和度下硫酸铵的离子强度 I。
（二）实验结果和讨论 1.将不同饱和度下冷冻离心后的上清液的各酶重量数据列成 lg S -I 的表格，建立碱性蛋白酶
的溶解度与盐离子强度之间的盐析方程式。 2.将不同饱和度下所得固体干酶粉的实验结果列成表格，计算各饱和度下所得酶粉的质量，
并根据蛋白酶原液的体积和干酶粉的质量计算各饱和度下酶的收率。 3.根据固体干酶粉的收率综合评价盐的最适加量范围，讨论盐加量对盐析的影响。
分别称取计算量的硫酸铵并研细，在不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再 搅拌 5min，注意应使用的硫酸铵全部溶解，然后，静置 5h 左右，使其沉淀完全。 4. 将含有沉淀的酶液，在台秤上平衡后，再用高速冷冻离心机离心，10℃，9000-10000r/min， 离心 20min。 5. 将上清液倒入量筒，记录其体积。 6. 小心挖出湿酶粉沉淀物，放入 55℃干燥箱烘干（约 24h），称干酶粉的质量。
五、思考题
（一）预习
1.查阅文献资料，了解该蛋白酶有关的理化性质，包括：相对分子质量、等电点、pH 和热 稳定性、最适作用 pH 和温度范围以及用途等。
蛋白质的沉淀与凝固实验报告
蛋白质的沉淀与凝固实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质沉淀和凝固的基本原理和方法。
2、熟悉不同沉淀剂对蛋白质沉淀的作用。
3、观察蛋白质凝固的现象及其条件。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子化合物，其分子表面带有许多可解离的基团，如氨基、羧基等，在一定的溶液 pH 值条件下，这些基团会解离而使蛋白质带电。
由于蛋白质分子表面所带电荷的种类和数量不同，以及分子大小、形状等差异，使得蛋白质在溶液中形成了稳定的胶体分散体系。
当向蛋白质溶液中加入某些试剂时，可破坏其稳定因素，使蛋白质分子从溶液中沉淀出来。
根据沉淀剂的不同，蛋白质沉淀可分为以下几种类型：1、盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（如硫酸铵、氯化钠等），可使蛋白质的溶解度降低而从溶液中沉淀出来。
这是因为盐离子与蛋白质分子表面的电荷中和，同时破坏了蛋白质分子表面的水化膜，从而使蛋白质沉淀。
盐析沉淀的蛋白质一般不变性，经透析或超滤除去盐后，蛋白质仍能溶解并恢复其原有的生物学活性。
2、有机溶剂沉淀：向蛋白质溶液中加入一定量的有机溶剂（如乙醇、丙酮等），可使蛋白质沉淀。
这是因为有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子表面电荷之间的静电引力，同时破坏了蛋白质分子表面的水化膜。
有机溶剂沉淀的蛋白质一般会部分变性，其溶解度降低。
3、重金属盐沉淀：向蛋白质溶液中加入重金属盐（如汞盐、铅盐等），可使蛋白质沉淀。
这是因为重金属离子与蛋白质分子中的某些基团（如巯基等）结合，从而使蛋白质变性沉淀。
4、生物碱试剂沉淀：向蛋白质溶液中加入某些生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸等），可使蛋白质沉淀。
这是因为生物碱试剂与蛋白质分子中的某些基团结合，形成不溶性盐类而沉淀。
蛋白质的凝固是指蛋白质在一定条件下（如加热、强酸、强碱等），其空间结构发生剧烈变化，从溶液中析出并形成不溶性固体的现象。
凝固后的蛋白质一般完全变性，失去其原有的生物学活性。
三、实验材料和仪器1、实验材料鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清与蛋黄分离，用蒸馏水稀释至一定体积，搅拌均匀备用。
酶的盐析实验报告
一、实验目的1. 了解盐析的基本原理和过程。
2. 探究不同浓度的盐溶液对酶活性的影响。
3. 观察并分析盐析现象，验证酶的稳定性。
二、实验原理盐析是一种通过改变溶液中盐的浓度，使蛋白质（包括酶）从溶液中沉淀出来的方法。
盐析的原理是：当溶液中盐的浓度增加时，溶液的离子强度增大，导致蛋白质分子之间的静电斥力减弱，使蛋白质分子逐渐聚集并沉淀出来。
当盐浓度降低时，蛋白质沉淀重新溶解。
酶作为一种特殊的蛋白质，其活性受盐浓度的影响较大。
在一定范围内，随着盐浓度的增加，酶的活性会逐渐降低，当达到一定浓度时，酶活性会突然下降并发生沉淀，这种现象称为盐析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 酶溶液（如淀粉酶、蛋白酶等）- 不同浓度的NaCl溶液（0.1M、0.5M、1M、2M）- pH缓冲溶液（如pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液）- 水浴加热器- 移液器- 试管- 离心机- 移液管- 酶活性测定试剂盒（如淀粉酶活性测定试剂盒）2. 实验仪器：- 移液器- 试管- 水浴加热器- 离心机- 移液管- 酶活性测定试剂盒（如淀粉酶活性测定试剂盒）四、实验步骤1. 准备实验材料：将酶溶液、不同浓度的NaCl溶液和pH缓冲溶液分别置于试管中。
2. 设置对照组：在对照组中，加入与实验组相同体积的酶溶液和pH缓冲溶液，不加入NaCl溶液。
3. 设置实验组：在实验组中，分别加入不同浓度的NaCl溶液，使溶液的总体积保持一致。
4. 加热处理：将所有试管放入水浴加热器中，在恒定温度下加热一段时间（如30分钟）。
5. 离心分离：将加热后的溶液进行离心分离，分离出沉淀和上清液。
6. 酶活性测定：使用酶活性测定试剂盒，对沉淀和上清液中的酶活性进行测定。
7. 数据记录与处理：记录不同盐浓度下酶活性的变化，并进行统计分析。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 随着NaCl浓度的增加，酶活性逐渐降低。
- 当NaCl浓度达到一定值时，酶活性突然下降并发生沉淀。
实验二蛋白酶的提取及分离
实验二、蛋白酶的提取及分离
1.实验目的
通过本实验，了解硫酸铵分级沉淀蛋白质的原理，掌握分级沉淀蛋白酶的基本操作和方法。
2.实验原理
在蛋白酶溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵，硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析，不同盐浓度下蛋白质的溶解度是不同的，因此先后调节溶液不同的盐浓度，可使各种不同蛋白质先后沉淀出来，或使需要的酶蛋白与其他杂蛋白分开，从而达到提纯的目的。
这就是分级沉淀。
盐析法中溶液的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称为100%饱和度。
3.试剂和仪器设备
材料：章鱼内脏
试剂：0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5），浓盐酸，固体（NH4）2SO4
仪器设备：磁力搅拌机，pH计，冷冻离心机，研钵，分光光度计，分析天平，移液枪，剪刀。
4.实验步骤
取粗酶液100mL，根据体积和硫酸铵饱和度用量表，算出达到80%硫酸铵饱和度实际应加入到酶液中的硫酸铵的量，即51.6g，并称取该量硫酸铵。
将酶液倒入烧杯中，缓慢搅拌下缓缓加入称好的固体硫酸铵，边加入边搅拌，待硫酸铵全部加入后，再缓慢搅拌5min，4℃下放置20min。
将上述溶液倒入离心管，在2000r/min,，4℃下离心10min。
离心后取沉淀。
沉淀重量按湿重的50%计算。
将冻干粉配置成一定浓度的酶液，测定其酶活力。
胰蛋白酶的纯化实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握胰蛋白酶的纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的理化性质和生物学功能。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于胰腺中的丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白质的能力。
本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，该方法具有操作简便、成本低廉、纯度较高等优点。
三、实验材料1. 胰蛋白酶粗品：由动物胰腺提取。
2. 硫酸铵：分析纯。
3. 氯化钠：分析纯。
4. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）：0.1 mol/L。
5. 其他试剂：三氯乙酸、硫酸、氢氧化钠等。
四、实验方法1. 胰蛋白酶粗品预处理：将胰蛋白酶粗品溶解于磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌使其充分溶解。
2. 盐析：向胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵，使其饱和，充分搅拌，室温静置过夜。
3. 沉淀收集：用布氏漏斗抽滤，收集沉淀，并用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。
4. 脱盐：将沉淀溶于适量的水，加入适量的三氯乙酸，使蛋白质变性，去除杂质。
5. 纯化：将变性后的蛋白质溶液透析，去除三氯乙酸和硫酸铵。
6. 蛋白质复性：将透析后的蛋白质溶液加入适量的磷酸盐缓冲液（pH7.0），使蛋白质复性。
7. 检测：采用SDS-PAGE方法检测纯化后的胰蛋白酶。
五、实验结果与分析1. 盐析：在胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵后，溶液出现白色沉淀，说明胰蛋白酶已经盐析。
2. 沉淀收集：通过抽滤，收集到白色沉淀，表明胰蛋白酶已经沉淀。
3. 脱盐：加入三氯乙酸后，沉淀溶解，表明蛋白质已经变性。
4. 纯化：透析后的蛋白质溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，只有一个明显的条带，说明胰蛋白酶已经纯化。
5. 蛋白质复性：复性后的胰蛋白酶溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白条带清晰，说明蛋白质已经复性。
六、实验结论本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，成功地将胰蛋白酶从粗品中分离出来，并通过SDS-PAGE电泳检测，证明纯化后的胰蛋白酶具有较高的纯度。
食品酶学实验-菠萝蛋白酶
食品酶学综合性实验实验1 菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定【目的和要求】1. 了解酶分离纯化的一般程序；2. 掌握硫酸铵沉淀法、透析法分离提取菠萝蛋白酶的基本原理和方法；3. 熟悉蛋白质含量测定、菠萝蛋白酶活力测定等实验原理和方法。
【实验原理】1.建立有效的酶纯化程序应考虑的原则（1）利用酶在分离纯化上最有利的特性；（2）尽早使用一种选择性好的方法；（3）选择交换能力高的层析技术作为第一步层析；（4）不要连续使用相同的纯化方法；（5）将各层析步骤连接起来，使前一步得到的样品适用于下一步层析；（6）在造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法；（7）要使每步过程的分辨能力呈递增趋势；（8）每步纯化过程后，通过量体积，酶活力和蛋白质浓度测定，监测纯化的进程。
2.菠萝蛋白酶简介菠萝蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症。
1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000DW，等电点9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。
菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。
金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。
3.菠萝蛋白酶的粗分离（1）盐析分离盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶。
蛋白质的盐析
蛋白质的盐析（验证型）一、实验目的了解在工业化生产过程中使用（NH 4）2SO4 的情况，及（NH 4）2 SO4 使用时的注意事项。
二、实验原理用高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法称盐析。
常用的中性盐有（NH4）2SO4、NaCl 等。
高`浓度中性盐能使蛋白质沉淀是因为它具有脱水性，能脱去蛋白质胶粒水膜，又有中和蛋白质胶粒外双电层电荷的作用。
不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度，可适当地将蛋白质分开。
如球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀，用盐析法沉淀的蛋白质并未变性，用稀释的方法或透析的方法可使之复溶。
三、器材与试剂1、发酵溶液2、10%的三氯醋酸溶液3、饱和（NH 4）2SO4溶液4、（NH4）2SO4粉末四、实验步骤（1）取发酵溶液5ml ，加饱和（NH 4）2SO4溶液1ml2ml3ml4ml5ml ，混匀，静止数分钟，即有白色沉淀析出，应为何物？过滤至清，除去沉淀，滤液备用。
取少量沉淀，加H2O 看是否复溶？（2）取滤液0.5ml ，加10%的三氯醋酸数滴，有白色沉淀产生，应为何物？然后在721 分光光度计OD600 下进行透光率的检测，检测时必须在倒入比色皿以后10 秒内读取（为什么？）。
（在进行检测时应注意将721 分光光度计调整到OD600；在测量前应把机器预热半小时左右。
在检测时应注意有效的检测范围是T 值15%以上到70%以下）。
（3）另外，取滤液 2.5ml 于小烧杯中，加（NH4）2SO4粉末，随加随搅拌，直至（NH4）2SO4 不能溶解为止，有白色沉淀产生，应为何物？然后过滤至清，除去沉淀，过滤备用。
（4）将（1）-（3）做的滤液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。
找到没有沉淀的加饱和（NH 4）2SO4溶液的点。
然后在721 分光光度计OD600下进行透光率的检测。
并且作出曲线。
（5）对大量的发酵液进行处理，在滤液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。
蛋白质的沉淀实训报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质沉淀实验的基本原理和操作步骤。
2. 了解蛋白质沉淀实验在蛋白质分离纯化中的应用。
3. 通过实验验证蛋白质在不同条件下的沉淀特性。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有复杂的结构和多样的生物学功能。
蛋白质的沉淀是指将溶液中的蛋白质从溶液中分离出来，形成固体沉淀的过程。
蛋白质沉淀实验是蛋白质分离纯化的重要步骤之一，通过控制实验条件，使蛋白质在特定条件下发生沉淀，从而实现蛋白质的分离。
蛋白质沉淀的原理主要包括以下几种：1. 盐析：通过增加溶液中的盐浓度，使蛋白质分子表面的电荷中和，破坏蛋白质的稳定性，导致蛋白质沉淀。
2. 脱水：通过降低溶液的离子强度或pH值，使蛋白质分子失去水合层，导致蛋白质沉淀。
3. 溶剂沉淀：通过加入与蛋白质溶液不互溶的有机溶剂，使蛋白质在有机溶剂中沉淀。
4. 高温沉淀：通过提高溶液温度，使蛋白质变性，导致蛋白质沉淀。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 牛血清白蛋白（BSA）溶液- 饱和硫酸铵溶液- 1%醋酸铅溶液- 5%鞣酸溶液- 0.1%茚三酮溶液- 0.5%苯酚溶液- 米伦试剂- 蛋白质标准品- 离心机- 恒温水浴锅- 移液器- 试管- 吸管2. 实验试剂：- 盐酸- 氢氧化钠- 乙醇- 氯化钠- 硫酸铜- 尿素四、实验步骤1. 盐析实验：- 取2ml BSA溶液于试管中，加入不同浓度的饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质沉淀情况。
- 将沉淀离心，收集沉淀物，测定沉淀物的蛋白质含量。
2. 脱水实验：- 取2ml BSA溶液于试管中，加入1%醋酸铅溶液，观察蛋白质沉淀情况。
- 将沉淀离心，收集沉淀物，测定沉淀物的蛋白质含量。
3. 溶剂沉淀实验：- 取2ml BSA溶液于试管中，加入5%鞣酸溶液，观察蛋白质沉淀情况。
- 将沉淀离心，收集沉淀物，测定沉淀物的蛋白质含量。
4. 高温沉淀实验：- 取2ml BSA溶液于试管中，加入0.1%茚三酮溶液，加热至60℃，观察蛋白质沉淀情况。
蛋白质沉淀条件实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质沉淀的基本原理和实验方法。
2. 了解不同沉淀剂对蛋白质沉淀效果的影响。
3. 探究蛋白质沉淀的最佳条件。
二、实验原理蛋白质在特定条件下，如pH、温度、离子强度等，会发生沉淀现象。
蛋白质沉淀的原理主要有以下几种：1. 盐析：中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
2. 等电点沉淀：蛋白质在等电点时溶解度最低，此时加入少量电解质即可使蛋白质沉淀。
3. 重金属盐沉淀：重金属离子与蛋白质中的巯基、羧基等官能团结合，使蛋白质变性沉淀。
4. 酶促反应：某些酶可以催化蛋白质变性，使其沉淀。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋清、硫酸铵、氯化钠、硝酸银、氢氧化钠、盐酸、氢氧化铵、蒸馏水等。
2. 实验仪器：离心机、烧杯、玻璃棒、移液器、pH计、电子天平等。
四、实验方法1. 盐析实验：将鸡蛋清溶液与不同浓度的硫酸铵溶液混合，观察蛋白质沉淀现象。
2. 等电点沉淀实验：将鸡蛋清溶液调至不同pH值，观察蛋白质沉淀现象。
3. 重金属盐沉淀实验：将鸡蛋清溶液与不同浓度的硝酸银溶液混合，观察蛋白质沉淀现象。
4. 酶促反应实验：将鸡蛋清溶液与不同浓度的氢氧化钠溶液混合，观察蛋白质沉淀现象。
五、实验结果与分析1. 盐析实验：随着硫酸铵浓度的升高，蛋白质沉淀现象逐渐明显。
当硫酸铵浓度达到0.8 mol/L时，蛋白质基本完全沉淀。
2. 等电点沉淀实验：当鸡蛋清溶液的pH值为4.7时，蛋白质沉淀现象最为明显。
3. 重金属盐沉淀实验：随着硝酸银浓度的升高，蛋白质沉淀现象逐渐明显。
当硝酸银浓度达到0.1 mol/L时，蛋白质基本完全沉淀。
4. 酶促反应实验：随着氢氧化钠浓度的升高，蛋白质沉淀现象逐渐明显。
当氢氧化钠浓度达到0.5 mol/L时，蛋白质基本完全沉淀。
六、实验结论1. 盐析是蛋白质沉淀的有效方法，随着盐浓度的升高，蛋白质沉淀效果逐渐增强。
蛋白质的沉淀反应实验报告
蛋白质的沉淀反应实验报告一、实验目的1、掌握几种常用的使蛋白质沉淀的方法。
2、理解蛋白质沉淀的原理和应用。
二、实验原理蛋白质是一种大分子化合物，在溶液中以胶体状态存在。
当溶液条件发生改变时，蛋白质的胶体稳定性被破坏，从而发生沉淀。
常见的使蛋白质沉淀的方法有以下几种：1、盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性盐（如硫酸铵、氯化钠等），破坏蛋白质的水化膜和电荷，使其溶解度降低而沉淀。
2、有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的有机溶剂（如乙醇、丙酮等），降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力，导致蛋白质沉淀。
3、重金属盐沉淀法：重金属离子（如汞离子、铅离子等）与蛋白质分子中的巯基等基团结合，使蛋白质变性沉淀。
4、生物碱试剂沉淀法：生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸等）能与蛋白质分子中的碱性基团结合，生成不溶性盐而沉淀。
三、实验材料和仪器1、材料鸡蛋白溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清用蒸馏水稀释 10 倍。
10%硫酸铵溶液、饱和硫酸铵溶液、3%硝酸银溶液、01mol/L 硫酸铜溶液、5%三氯乙酸溶液、95%乙醇、1%醋酸铅溶液、10%氢氧化钠溶液、1%醋酸溶液、苦味酸饱和溶液、鞣酸饱和溶液。
2、仪器试管、试管架、滴管、玻璃棒、离心机。
四、实验步骤1、盐析法取两支试管，分别加入 2mL 鸡蛋白溶液。
向其中一支试管中逐滴加入 10%硫酸铵溶液，边加边振荡，直至出现沉淀。
观察沉淀的生成情况。
向另一支试管中加入 2mL 饱和硫酸铵溶液，振荡均匀。
静置一段时间后，观察沉淀现象。
2、有机溶剂沉淀法取两支试管，分别加入 2mL 鸡蛋白溶液。
向其中一支试管中逐滴加入 95%乙醇，边加边振荡，直至出现沉淀。
观察沉淀的生成情况。
向另一支试管中加入 2mL 丙酮，振荡均匀。
静置一段时间后，观察沉淀现象。
3、重金属盐沉淀法取三支试管，分别加入 2mL 鸡蛋白溶液。
向第一支试管中滴加 3%硝酸银溶液 2~3 滴，振荡均匀，观察沉淀的生成情况。
蛋白质的沉淀反应实验
沉淀反应的分类
盐析：通过加 入盐使蛋白质
发生沉淀
共价键：通过 形成共价键使 蛋白质发生沉
淀
包埋：通过包 埋作用使蛋白
质发生沉淀
吸附：通过吸 附作用使蛋白
质发生沉淀
沉淀反应的应用
生物大分子分离纯化 化学反应的中间产物分离 药物研发中的晶型筛选 环境科学中重金属离子的检测
实验材料
蛋白质溶液 硫酸铵 乙醇 丙酮
添加标题
实验结论：蛋白质的沉淀反应实验具有实际应用价值，可用于分离、纯化蛋白质，以及优化蛋白质的结 晶和制备过程。
实验建议与展望
建议：在实验过程中，应严格控制实验条件，确保 实验结果的准确性和可靠性。
展望：随着科学技术的发展，蛋白质的沉淀反应实 验将会有更多的应用前景和发展空间。
感谢您的耐心观看
颗粒物。
观察沉淀：离 心分离后，观 察试管中的沉 淀情况，记录 沉淀的数量和
形态。
清洗沉淀：将 沉淀物清洗干 净，以备后续
分析使用。
分析数据：对 实验数据进行 整理和分析， 得出实验结论。
实验注意事项
实验前需仔细检查实验器材是否齐全、完好，确保实验顺利进行。 实验过程中要严格控制反应条件，如温度、pH值等，以保证实验结果的准确性。 在进行沉淀反应时，要确保溶液混合均匀，避免局部浓度过高导致沉淀不完全或结块。 实验后要及时清洗实验器具，保持实验室的整洁卫生。
添加副标题
蛋白质的沉淀反应实验
汇报人：XX
目录
CONTENTS
01 实验原理
03 实验步骤
05 实验结论
02 实验材料 04 实验结果分析
实验原理
蛋白质的沉淀反应定义
蛋白质的沉淀反应是指蛋白质在某些理化因素作用下，其溶解度降低而从溶液中析出的现象。 沉淀反应是蛋白质的一种重要性质，可用于分离、提纯和纯化蛋白质。 蛋白质的沉淀反应可以改变蛋白质的生物活性，如酶的失活等。 蛋白质的沉淀反应是生物化学实验中常用的技术手段之一，可用于研究蛋白质的结构和功能。
蛋白质盐析实验报告
蛋白质盐析实验报告一、引言蛋白质是生物体内重要的功能分子之一，具有多种生理活性，如酶活性、结构功能等。
研究蛋白质的结构与功能对于理解生命活动具有重要意义。
而蛋白质盐析是一种常用的分离和纯化蛋白质的方法，通过改变蛋白质与溶剂中离子浓度之间的平衡关系，使其发生沉淀，从而实现蛋白质的分离。
二、实验目的本实验旨在通过盐析方法分离纯化蛋白质，了解蛋白质溶液在不同离子浓度条件下的溶解性变化，探究蛋白质与溶液离子之间的相互作用机制，并验证盐析方法的分离效果。
三、实验步骤1. 实验前准备：准备好所需的蛋白质溶液、盐溶液和缓冲溶液，并将其调整至所需浓度。
同时准备好离心管、试管、移液管等实验用具。
2. 盐析实验操作：a. 取一系列试管，分别加入不同浓度的盐溶液，如氯化铵、硫酸铵等。
b. 向每个试管中加入相同体积的蛋白质溶液，并充分混匀。
c. 静置一段时间，观察是否出现蛋白质沉淀。
d. 将试管放入离心机中，以一定速度离心，使蛋白质沉淀到离心管底部。
e. 倒掉上清液，留下蛋白质沉淀。
f. 加入适量的缓冲溶液溶解蛋白质沉淀，得到纯化的蛋白质溶液。
四、实验结果与分析通过实验操作，观察到在不同离子浓度条件下，蛋白质溶液的溶解性发生变化。
当盐溶液浓度较低时，蛋白质溶液呈现较好的溶解状态，无明显沉淀现象；而当盐溶液浓度逐渐增加时，蛋白质溶液逐渐出现沉淀。
这是因为在高离子浓度条件下，离子与蛋白质分子之间的相互作用增强，导致蛋白质分子间的相互吸引力增大，进而发生沉淀现象。
通过离心操作，我们可以将蛋白质沉淀分离出来，从而实现蛋白质的纯化。
在离心过程中，蛋白质沉淀到离心管底部，上清液中则含有较少的蛋白质。
通过倒掉上清液，留下蛋白质沉淀，我们可以得到纯化的蛋白质溶液。
为了保持蛋白质的活性和稳定性，我们在溶解蛋白质沉淀时添加了适量的缓冲溶液。
五、实验总结蛋白质盐析实验是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。
通过改变蛋白质与溶剂中离子浓度之间的平衡关系，实现了蛋白质的分离。
蛋白酶盐析沉淀实验报告
蛋白酶的盐析沉淀实验报告班级：生工1005 学号：020******* 姓名：朱同辉实验目的：1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素；2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义；3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法；4.学习酶活力的计算方法。
实验原理：盐析法在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。
原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜；②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。
盐析效果： 二价离子 > 一价离子离子半径小 > 离子半径大阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn 经验式来表示：式中：S —蛋白质的溶解度 I —离子强度β—常数，与温度和pH 有关Ks —盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关 其中I 根据下式计算：式中：ci —i 离子的浓度（mol/L ） zi —i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定福林（Folin ）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。
蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算IK S log s -β=2i i z c 21I ∑=K —在酪氨酸标准曲线上O.D 值为l 时酪氨酸的微克数（μg ），K 值为108.53 N —酶液稀释倍数4—酶反应液为4 ml ，取出1 ml 测定，故乘以4 10—反应时间为10 min参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150，100，100，100，50倍实验步骤：1）蛋白质盐析分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编号，分别加入50 ml 蛋白酶液，分别称量5.70，8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min ，使硫酸铵完全溶解。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白酶的盐析沉淀实验报告
班级：生工1005 学号：020******* 姓名：朱同辉
实验目的：
1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素；
2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义；
3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法；
4.学习酶活力的计算方法。
实验原理：
盐析法
在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。
原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜；
②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。
盐析效果： 二价离子 > 一价离子
离子半径小 > 离子半径大
阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-
蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn 经验式来表示：
式中：S —蛋白质的溶解度 I —离子强度
β—常数，与温度和pH 有关
Ks —盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关 其中I 根据下式计算：
式中：ci —i 离子的浓度（mol/L ） zi —i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定
福林（Folin ）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。
蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算
K —在酪氨酸标准曲线上O.D 值为l 时酪氨酸的微克数（μg ），K 值为
108.53
680
D .O N K 10
4
⨯⨯⨯=酶活力I
K S log s -β=2
i i z c 2
1I ∑=
N—酶液稀释倍数
4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以4
10—反应时间为10 min
参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150，100，100，100，50倍
实验步骤：
1）蛋白质盐析
分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70，8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min，使硫酸铵完全溶解。
然后静置使蛋白酶沉淀完全。
将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中，在天平上称重平衡，用高速冷冻离心机离心于10℃，10,000 r/min 离心20 min。
将上层清液倒入量筒记录其体积，并分别测定酶活（u/ml），即为该酶的溶解度S。
2）蛋白酶活力的测定：
1.将2%酪蛋白溶液40℃预热3-5min
2. 取3支试管编号0、1、2，分别吸取待测酶液1ml放入试管中，40℃水浴中预热1-2min
3.往0号试管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支试管中加入2%酪蛋白1ml，计时摇匀，40℃反应10min
4.往1、2号试管中加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，摇匀，取出3支试管静置10min
5. 另取3支试管，分别吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，于40℃水浴中保温20min显色。
6.以0号管为对照，在波长680nm处测定1、2号管的吸光度，求出平均值。
3）蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算
计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓度，离子强度，蛋白酶溶解度和上清液酶活残留，并填表。
以log S为纵坐标，I为横坐标作图，将直线部分线性回归，求出Ks和β的数值，建立起蛋白酶的盐析曲线。
数据记录及实验结果：
编号O.D680平均值上清液体积/mL
原酶液1 0.388
0.406 \ 2 0.424
饱和度20% 1 1.069
1.121 55.8
2 1.173
饱和度30% 1 0.819
0.821 55.4 2 0.823
饱和度40% 1 0.952
0.985 53.0 2 1.018
饱和度50% 1 0.021
0.220 56.2 2 0.418
饱和度60% 1 0.062
0.051 58.5 2 0.040
饱和度70% 1 0.091
0.151 62.1 2 0.211
编号(NH4)2SO4浓度mol/L 离子强度I 上清液酶活蛋白酶溶解度S logS
原酶液0 0 \ \ \ 饱和度20% 0.82 2.46 4866 271522.8 5.43
饱和度30% 1.23 3.69 7128 394891.2 5.59
饱和度40% 1.64 4.92 6414 339942.0 5.53
饱和度50% 2.05 6.15 955 53671.0 4.72
饱和度60% 2.46 7.38 221 12928.5 4.11
饱和度70% 2.87 8.61 328 20368.8 4.31
讨论：
通过本次试验，初步掌握了蛋白酶盐析沉淀及其酶活测定的方法。
在开始实验时，对实验的整体思路没有理解，仅仅盲目的按照步骤进行，导致浪费了很多时间，并且实验结果不理想。
希望老师能在实验的前一周把讲义发给大家，进行充分的预习，对提高实验效率和准确度会有帮助。