测序 基础知识

转录组高通量测序中，reads、contigs、scaffold、unigene、singleton

高通量测序时，在芯片上的每个反应，会读出一条序列，是比较短的，叫read，它们是原始数据；

有很多reads通过片段重叠，能够组装成一个更大的片段，称为contig（克隆群）；

多个contigs通过片段重叠，组成一个更长的scaffold；

一个contig被组成出来之后，鉴定发现它是编码蛋白质的基因，就叫singleton；

多个contigs组装成scaffold之后，鉴定发现它编码蛋白质的基因，叫unigene。

基因组测序方法：

链中止法测序：通过合成与单链DNA互补的多核甘酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。

化学降解法测序：在待定的核苷酸碱基中引入化学集团，再用化合物处理，使DNA分子在被修饰的位置降解。

自动化测序：与链终止测序原理相同，这姿势用不同的荧光色彩标记ddNTP，如ddA TP 标记红色荧光，ddCTP标记蓝色荧光，ddGTP标记黄色荧光，ddTTP标记绿色荧光。由于每种ddNTP带有各自待定的荧光颜色，二简化为由1个泳道同时判读4种碱基。

非常规DNA测序毛细管电泳、光点测序、DNA芯片测序、随机的组装（鸟枪法）鸟枪法：就有可能出现错装。

鸟枪法策略指导测序策略

不需要背景信息构建克隆群

时间短需要几年时间

需要大型计算机

得到的是草图（Draft）得到的是精细图谱

EST （Expressed sequence tag）测序

EST是一种重要的基因组图分子标记，以EST为探针很容易从cDNA文库中筛选全基因，又可从BAC克隆中找到其基因组的基因序列。

优点：mRNA可直接反转录成cDNA，而且cDNA文库也可比较容易构建。

对cDNA文库大量测序，即可获得大量的EST序列

EST为基因的编码区，不包括内含子和基因间区域，一次测序的结果足以鉴定所代表的基因。

人类基因组计划于1990年启动，我国于1999年加入，承担1%任务，即人类3号染色体短臂上约30MB的测序任务。

2000年6月26完成草图。测序错误率低于1%%。