westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤

免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。

一、Western Blot的原理

Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、操作步骤

（一）蛋白质样品获得：

1.所需试剂：

(1)蛋白酶抑制剂mix：

hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度

*PMSF（溶于乙醇）100mM 25ul 50uM

*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml

*EGTA（pH8.0）0.5M 80ul 8mM

*EDTA（pH8.0）0.5M 10ul 1mM

Aprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/ml

Pepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml 50ul 10ug/ml

Leupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/ml

Benzamidine 100mM 250ul 5mM

NaF 5M 250ul 250mM

NaVO4（FW183.8）0.2M 25ul 1mM

注意：*代表必须加的试剂

(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。配制1M DTT溶液，保存在-20℃冰箱中。

配制细胞裂解液（现用现配）：将裂解缓冲液和抑制剂溶液等体积混合，然后加入DTT溶液，使其浓度为1 mM。

（3）RIPA(组织样品)：1×PBS，1％NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS。（蛋白抑制剂在提取蛋白时现加，按10ul/ml RIPA的量加10mg/ml PMSF，Aprotinin按30ul/ml RIPA的量加入）

也可用样品裂解液：（2%SDS；0.01%溴酚兰；10%甘油；60mmol/LTris-HCl(PH6.8)；100mmol/LDTT(取自-20℃存放的1mol/L储存液，临用时加入)

2.细胞裂解步骤

将所有的样品放在冰上

1. 4℃离心5min沉淀细胞

2. 去掉上清

3. 将细胞重悬于1ml冰冷的PBS中，

4. 转到离心管中

5. 4℃离心5min，

6. （除去样中微量血清）

7. 除去上清

8. 置细胞沉淀于冰上

9. 每107cells加裂解工作液100ul，10. 轻轻重悬细胞沉淀

11. 置冰上20min

12. 13000rpm离心15min，13. 4℃

14. 将上清转到小离心管中（将管盖扎上针孔）

15. 取出1ul，16. 用于Bradford测定

17. 液氮速冻样品，18. -20℃保存

3.组织裂解

（1）3ml冰冷的RIPA缓冲液匀浆1g组织,每克组织加30ul 10mg/ml PMSF

（2）所有步骤均在4℃下进行,匀完浆后冰上放置30min.，4℃10000×g离心10min，取上清（如果无法沉淀，请加大离心力，操作40min之后需要再加PMSF，加量同1，如信号转导、转录因子类蛋白易降解，可添加Aprotinin、Benzamidine、NaVO4等蛋白酶抑制剂）；有些蛋白可能存在于沉淀中（Triton不可溶的蛋白多数是SDS加热可溶的），因此要保留沉淀，沉淀用RIPA清洗几次后，保存，电泳前变性处理时要额外加入SDS，因为沉淀蛋白多数是SDS加热可溶蛋白。）加热100°5分钟直到变性，－20°冰箱保存。

4.培养细菌：

细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。

（二）Bradford法测定蛋白（考马斯亮蓝G－250染色法）

1) 配制染液：

²考马斯亮蓝G-250 10mg

²95％乙醇5ml

²85％磷酸10ml

蒸馏水补足体积至100ml

2) 标3) 准蛋白质：在1.5ml离心管中加入BSA蛋白0、10、20、30、40、50、60ug，4) 补水至60ul，5) 加1ml染液，6) 混匀后在5－7) 15min之内，8) 595nm 处比色测定。

9) 测定样品：方法同10) 2）

方法：Bradford法测定蛋白浓度（目前动物所用方法）

（1）取微量离心管（0.5ml），编号；

（2）取样品30ul，分别加入3只离心管中（每只10ul），每只离心管中加水290 ul，总体积300 ul；

（3）加入不同浓度的（10ug/），制备标准品；

BSA(ul) 水BSA(ul) 水

S0 0 总体积至300 ul S5 5 总体积至300 ul

S1 0.1 总体积至300 ul S6 10 总体积至300 ul

S2 0.5 总体积至300 ul S7 20 总体积至300 ul

S3 1 总体积至300 ul

S4 2 总体积至300 ul

加入Bradford液100 u（样品和标准品都加），混匀（旋涡振荡），取200－300 ul，加入酶标板中，用酶标仪与595nm处测定，打印数据。

（三）SDS-PAGE

1、SDS-PAGE试剂

（1）30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。

（2）1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。

（3）1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

（4）10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。（5）电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O 溶解, 定容至1000ml。

（6）10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。

（7）2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。

（8）预染marker.

2、SDS-PAGE步骤

（1）制胶

分离胶：制备聚丙烯酰胺分离胶20ml，凝胶浓度为10%。将分离胶注入准备好的干净玻璃板间隙中，在其顶层覆盖数毫升水，以加速聚合，待分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以去除未聚合的丙烯酰胺，尽可能去除凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残余的液体。（最好用1ml的枪头加）浓缩胶：制备8ml 5%浓度的聚丙烯酰胺积层胶，直接灌入已聚合的分离胶上，插入梳子，垂直放置于室温。在积层胶聚合完全后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽，上下槽加入1×电泳缓冲液（25 mM Tris-Cl, 250 mM甘氨酸，0.1%SDS）,按次序上样（100mg）,在所有不同的孔中加入等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。

加入电流缓冲液：上槽液与下槽液一定不要在同一水平线，以免短路。

电泳：跑到底

注意：（1）上样缓冲液可按我们的方法进行；

（2）目前动物所用的是BioRad的产品，加样量很少，两块胶只需10ml；

（3）蛋白质分子marker用western blot预染marker（也可在转膜后用丽春红，然后洗掉，但由于丽春红致癌，目前都不用之）。

（四）电转移