westernblot原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
westernblot原理及步骤
免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot技术：一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
WesternBlot原理和操作方法（详细）
二：需要的溶液：
裂解液 Laemmli样品缓冲液
三：操作步骤：
1)培养细胞蛋白质样品的制备：
1：胰酶酶解后裂解：
细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。
2：皿上直接裂解：
细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。
3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）
westernblot原理及步骤
一、western blot 的定义：即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
二、western blot 的原理先制备蛋白质样品，再利用SDS-PAGE原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。
用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体（一抗）结合。
由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。
抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原-一抗-二抗结合物，再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。
三、Westernblot法操作步骤是：Westernblot第一步将被分析的蛋白样品做SDS—PAGE凝胶电泳，使样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。
Westernblot法第二步把凝胶中的蛋白转移到膜上(所谓印迹)，其中用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜。
蛋白转移的方法多采用电转移，也有用吸印法转移的(原理与Southern blotting类似)电转移又有半干法和湿法之分，本实验采用后者。
bio-rad专家还提到Westernblot法最后一步是用特异性的抗体检测，看印迹膜上是否存在相应抗原。
免疫检测的方法可以是直接或间接的，现在一般都是采用间接免疫配标的方法。
在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体(辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的抗第一抗体的抗体)染色，再加酶的底物显色，通过膜上显现出的颜色或经化学发光在x光底片上出现的曙光条带来显示抗原的存在。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤一、配胶原理：30% acrylamide mix：产生凝胶的基本物质1.5M Tris(ph 8.8) ：使分离胶PH为8.8（与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度，从而使不同分子量的蛋白分开）1.0MTris(ph 6.8)：使浓缩胶PH为6.8（可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细）10% SDS阴离子去污剂：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二三级结构，消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。
与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身的电荷被掩盖，从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。
同时能够助溶，蛋白质变为亲水，容易在水相中迁移。
每克多肽可以与1.4g 去污剂结合，当分子量在15kd-200kd之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，logMW（分子量）=K-bx（迁移率）AP：提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基，是acr 和bis聚合的引发剂TEMED：催化AP释放氧自由基，是反应的催化剂1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板，检漏（有豁口和字的朝上）2、倒掉水，配10ml 10%的分离胶（1.5mm板需要7ml，1mm 板需要4.5ml）10%方案如下：H2O 4.0ml30% acrylamide mix 3.3ml1.5M Tris(ph 8.8)2.5ml10% SDS 0.1ml10% ammonium persulfate 0.1mlTEMED 0.004ml3、混合后上下摇晃，注意不要放在手中配（否则温度太高凝固的快），静置15s后用1ml枪二档吸一档打（在一角加即可，不用来回加，否则容易出气泡。
不过出气泡了也没事，加水压一下就浮上来了）4、加进玻璃板中，随后均匀来回加水到满5、等待20分钟6、倒掉水，将架子倒置过来让水排干，用纸巾擦拭斜角（一定要擦干净所有的水！否则两层胶之间出现水层就废了），同时配浓缩胶4ml H2O 2.7ml30% acrylamide mix 0.67ml1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml10% SDS 0.04ml10% ammonium persulfate 0.04ml TEMED 0.004ml7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子，注意不要有气泡，等待20min二、测定蛋白浓度原理：A液是质量浓度为0.1g/mL氢氧化钠溶液（20ul protein assayS+1ml protein assay A），B液是质量浓度为0.01g/mL硫酸铜溶液。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
westernblot原理及步骤
Western blot的原理1.western blot即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
2.原理简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
具体可看westernblot 原理3.步骤（一）蛋白样品制备培养的细胞（定性）1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。
3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。
若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
7.待样品恢复到室温后上样。
培养的细胞（定量）1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
4.12000g离心，4℃，2min。
5.取少量上清进行定量。
6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
蛋白提取及Western blot 原理及步骤
蛋白质提取原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。
方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。
5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇(5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。
Western bolt原理及步骤原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。
WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
WesternBlot原理和操作方法
WesternBlot原理和操作方法样品制备是Western Blot起始的步骤之一、首先，需要从生物学样本中提取目标蛋白质。
常见的提取方法包括细胞裂解、组织均质和亲和纯化等。
提取后的样品需要经过蛋白质浓度测定，以确保加载相同数量的蛋白质。
接下来，需要将样品进行电泳分离。
这通常是通过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-）电泳实现的。
SDS（十二烷基硫酸钠）能够破坏蛋白质的非共价键，使蛋白质呈现线性构象。
电泳根据蛋白质的分子量将其分离成不同的带状条带。
接下来是转膜的步骤。
将凝胶中分离的蛋白质转移到聚合物膜上。
这通常是通过湿式转膜实现的，其中聚合物膜与凝胶是紧密接触的。
电场将带有电荷的蛋白质从凝胶中转移到膜上。
然后进行免疫反应。
转膜后的膜需要被阻断以避免非特异性结合。
一般会使用非特异性蛋白质溶液，如牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉。
然后，在阻断溶液中加入一种特异性的抗体，抗体可以与感兴趣的蛋白质结合。
抗体结合的蛋白质可以被进一步检测。
最后是图像开发阶段。
Western Blot的图像开发通常是通过酶标记二抗的荧光或酶标记产生的化学发光。
这意味着在膜上的蛋白质上有特异性抗体结合。
然后，在图像上使用相应的技术来检测抗体结合的蛋白质，以获得目标蛋白质的图像。
总结起来，Western Blot是一种广泛应用于生物学研究的技术，用于分析复杂的蛋白质混合物。
它通过电泳和免疫反应的结合，可以检测和分离出特定的蛋白质。
虽然操作过程较为复杂，但其可靠性和准确性使其成为许多实验室中常用的技术。
western blot 原理
western blot 原理Western blot是一种常用的蛋白质检测方法，可用于确定特定蛋白质在细胞或组织样品中的存在与表达水平。
此方法通过将蛋白质分离、定位和检测，能够提供关于目标蛋白质的定性和定量信息。
Western blot的基本原理包括以下几个步骤：1. 蛋白质的提取与分离：首先需要从细胞或组织样品中提取目标蛋白质，常用的方法包括细胞裂解和离心等步骤。
然后，将提取得到的蛋白质样品进行电泳分离，通常使用SDS-PAGE （酶解电泳）进行蛋白质的分子量分离。
2. 蛋白质的转移：将分离蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这个步骤称为电转移。
转移蛋白质的方式通常是通过将凝胶和膜浸泡在缓冲液中，应用电流使蛋白质迁移至膜上。
3. 膜上蛋白质的定位：用一种被检测蛋白质特异性的抗体与膜上的蛋白质进行特异性反应。
抗体可以通过与目标蛋白质结合，从而形成抗原抗体复合物。
一般来说，首先将膜经过一定的预处理，如在一定的温度和时间下与非特异性的蛋白质结合来降低假阳性结果的发生。
然后，再与特异性的一抗结合，洗去非特异性的一抗，接着与特异性的二抗结合。
4. 信号的检测与显色：在本步骤中，标记有荧光物质、放射性或酶（如辣根过氧化物酶）的二抗将与特异性一抗结合的位置标记出来。
酶类辅助物质（如酶底物和显色剂）可以产生颜色或荧光，使膜上的特异性蛋白质位置可视化。
这些标记的二抗将与抗体结合的位点产生可检测的信号。
5. 数据分析：通过将成像结果进行定量或半定量分析，可以测量目标蛋白质的数量或相对表达水平。
Western blot方法的前提是已知蛋白质的抗体信息，因此以此为基础进行蛋白质的检测、表达水平的分析等。
该方法广泛应用于生物医学、分子生物学、免疫学等领域。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
一、实验原理。
WB实验，即Western Blot实验，是一种常用于检测蛋白质的实验方法。
它通过电泳将蛋白质分离开来，然后用特定的抗体结合目标蛋白，最后通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
在WB实验中，主要包括蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测等步骤。
下面将详细介绍WB实验的步骤及操作要点。
二、实验步骤。
1. 蛋白质电泳分离。
首先，将待测样品加入SDS-PAGE凝胶槽中，进行蛋白质电泳分离。
电泳结束后，将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
2. 蛋白质转膜。
将电泳分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通常采用湿法转膜或半干法转膜。
转膜后，将膜进行封闭处理，以防止非特异性结合。
3. 抗体结合。
将待测蛋白质与特异性一抗进行孵育结合，然后进行洗脱，接着与辣根过氧化物酶标记的二抗结合。
最后再次进行洗脱，以去除非特异性结合。
4. 检测。
通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
化学发光法是常用的检测方法之一，它通过特定底物的化学反应产生发光信号，用于检测目标蛋白的存在与表达水平。
三、实验操作要点。
1. 实验前的准备工作要做到充分，包括准备好所需试剂、仪器设备的检查和调试等。
2. 在操作过程中要严格遵守操作规程，保证实验的准确性和可靠性。
3. 注意实验中各步骤的时间控制，避免步骤之间的等待时间过长或过短。
4. 蛋白质转膜时要注意膜的完整性和均匀性，避免出现膜上蛋白质分布不均匀的情况。
5. 在抗体结合和检测过程中，要注意洗脱的次数和时间，严格控制非特异性结合的发生。
6. 实验结束后，要及时清洗和维护仪器设备，妥善保存实验结果和数据。
通过以上步骤和操作要点的介绍，相信大家对WB实验的原理和操作有了更清晰的认识。
在进行实验操作时，一定要认真细致，严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对大家有所帮助，谢谢阅读！。
western blot原理及操作方法ppt课件
常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致 电泳带畸形。 太慢不均匀，特别是甘油
常见问题
3. 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界 面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在 同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制 作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避 免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路 6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污 染膜
主要试剂
13.封闭缓冲液 封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗 的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶） 使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
8.10×转印Buffer（贮存液） 4℃保存 • 10×转印Buffer（贮存液）的配制： • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer（工作液）： • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。
Western blot，又称免疫印迹法，是一种用于检测特定蛋白质的方法。
它能够通过识别蛋白质在膜上的位置来确定其分子量，并且可以检测蛋白质的表达水平。
本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能够帮助读者更好地理解和应用这一技术。
1. 原理。
Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。
首先，待检测的蛋白样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将分离后的蛋白转移到膜上。
接着，膜上的蛋白与特异性抗体结合，再经过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在和表达水平。
2. 步骤。
（1）蛋白样品制备，将待检测的蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶电泳缓冲液，使其蛋白质变性并带有负电荷，然后进行蛋白定量。
（2）SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳分离，使蛋白质按照大小分子量在凝胶中迁移。
（3）蛋白转膜，将分离后的蛋白转移到膜上，通常使用的是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
转膜的方法有湿式转膜和半干式转膜两种。
（4）膜上抗体结合，将蛋白转膜后的膜进行封闭，然后与特异性的一抗抗体结合，再与辅助抗体结合。
（5）信号检测，通过化学发光或染色等方法来检测膜上蛋白的存在和表达水平，如辣根过氧化物酶（HRP）发光、碱性磷酸酶（AP）发光、共价结合荧光素等。
3. 注意事项。
（1）蛋白样品制备要避免蛋白降解和失活，通常在样品中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂。
（2）SDS-PAGE凝胶电泳要注意电泳条件的选择，如电压、时间和电流密度等。
（3）蛋白转膜后的膜要保持湿润，避免膜的干燥和破裂。
（4）抗体结合和信号检测要根据实验需要选择合适的抗体和检测方法，以确保结果的准确性和可靠性。
4. 应用。
Western blot广泛应用于生物医学研究中，如检测蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质、研究蛋白质相互作用等。
生物实验教案：利用WesternBlot技术检测蛋白质
生物实验教案：利用WesternBlot技术检测蛋白质【导言】生命科学是一门探究生命基本结构、功能、特点及其规律的学科。
而生物技术作为生命科学的重要组成部分，不断涌现新的技术和方法，使得生物研究更加丰富多彩。
Western Blot技术被广泛应用于蛋白质研究领域，是一种高灵敏度、高特异性的蛋白质检测技术，其在学术界和医学相关领域得到了广泛应用。
本文将详细讲解Western Blot技术的原理、步骤及其在生物研究中的应用。
【正文】一、Western Blot技术原理Western Blot技术也被称为蛋白印迹技术，是一种通过电泳分离样品中的蛋白质，然后通过膜转移、靶向蛋白质的抗体检测等步骤来检测特定蛋白质的方法。
其主要原理如下：（1）电泳分离样品中的蛋白质：Western Blot技术使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等方法对样品进行分离，使用电泳输送将被分离出的蛋白质定位到凝胶上的特定位置。
（2）将分离的蛋白质转移到膜上：通过将电泳分离后的蛋白质沿着凝胶内向膜传递，以便用于后续的检测。
（3）使用特定抗体检测蛋白质：在Western Blot技术中，抗体通常会用于标识目标蛋白质的位置。
一旦目标蛋白质与其特异的抗体结合，就可以使用一种物质，如酶的亚基底物或放射性同位素，来标记蛋白质并检测其浓度。
（4）显影：加入染色剂等物质对目标蛋白质进行着色，便于蛋白质的可视化。
二、Western Blot技术步骤Western Blot技术主要包括以下步骤：（1）样品准备：样品收集、破碎、裂解等操作是Western Blot 技术操作的第一步，为后续操作提供样本。
（2）SDS-PAGE凝胶电泳分离：先将样品进行电泳分离，分离后的蛋白质会在聚丙烯酰胺凝胶上生成一个不同的蛋白质条带，以便于辨别目标蛋白质。
（3）转膜：将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到膜上。
膜通常可以是呈现带电的（如聚偏亚胺酯，PVDF）和不呈现带电的（如硝酸纤维素）。
western-blot的原理及应用
Western Blot的原理及应用1. Western Blot的简介Western Blot，又称蛋白印迹法，是一种常用的蛋白质检测技术。
通过将待检的蛋白质样品分离、转移至膜上、以特定抗体探针探测目标蛋白质，然后用染色剂标记抗体来可视化目标蛋白。
2. Western Blot的原理Western Blot技术主要分为以下几个步骤：2.1 电泳分离将待检样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据蛋白质大小和电荷来确定聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型（SDS-PAGE、Native-PAGE等）。
2.2 转移将电泳分离出的蛋白质从凝胶转移到膜上，常用的转移方式包括湿式转移、半湿式转移和干式转移。
2.3 阻断使用适当的缓冲液对膜进行阻断，如牛奶、BSA等，用于防止非特异性结合。
2.4 探测抗体加入特异性一抗，与目标蛋白质结合。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以选择根据实验需求选择。
2.5 二抗探针加入与一抗来源不同动物的二抗探针，例如兔子抗鼠二抗或羊抗兔子二抗等，二抗探针会与一抗结合。
2.6 可视化通过染色剂等方法来可视化目标蛋白质，常用的方法有辣根过氧化物酶（HRP）标记的次级抗体与发光底物反应产生发光，或使用染色剂如染蓝等。
3. Western Blot的应用Western Blot技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括：3.1 蛋白质鉴定与定量Western Blot技术可以快速鉴定蛋白质的存在与纯度，通过与已知标准蛋白质比较可以进行定量分析。
3.2 抗体检测和验证通过Western Blot可以检测抗体的特异性和亲和力，验证抗体的质量和功能。
3.3 蛋白质翻译后修饰的研究Western Blot可以用于检测蛋白质的磷酸化、甲基化、酰化等翻译后修饰，帮助我们了解蛋白质功能的调控机制。
3.4 疾病诊断和治疗研究Western Blot在临床疾病的诊断和治疗研究中起着重要作用，如肿瘤标志物的检测、药物疗效的评估等。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
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westernblot原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
一、Western Blot的原理Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、操作步骤（一）蛋白质样品获得：1.所需试剂：(1)蛋白酶抑制剂mix：hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度*PMSF（溶于乙醇）100mM 25ul 50uM*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml*EGTA（pH8.0）0.5M 80ul 8mM*EDTA（pH8.0）0.5M 10ul 1mMAprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/mlPepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml 50ul 10ug/mlLeupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/mlBenzamidine 100mM 250ul 5mMNaF 5M 250ul 250mMNaVO4（FW183.8）0.2M 25ul 1mM注意：*代表必须加的试剂(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。
配制1M DTT溶液，保存在-20℃冰箱中。
配制细胞裂解液（现用现配）：将裂解缓冲液和抑制剂溶液等体积混合，然后加入DTT溶液，使其浓度为1 mM。
（3）RIPA(组织样品)：1×PBS，1％NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS。
（蛋白抑制剂在提取蛋白时现加，按10ul/ml RIPA的量加10mg/ml PMSF，Aprotinin按30ul/ml RIPA的量加入）也可用样品裂解液：（2%SDS；0.01%溴酚兰；10%甘油；60mmol/LTris-HCl(PH6.8)；100mmol/LDTT(取自-20℃存放的1mol/L储存液，临用时加入)2.细胞裂解步骤将所有的样品放在冰上1. 4℃离心5min沉淀细胞2. 去掉上清3. 将细胞重悬于1ml冰冷的PBS中，4. 转到离心管中5. 4℃离心5min，6. （除去样中微量血清）7. 除去上清8. 置细胞沉淀于冰上9. 每107cells加裂解工作液100ul，10. 轻轻重悬细胞沉淀11. 置冰上20min12. 13000rpm离心15min，13. 4℃14. 将上清转到小离心管中（将管盖扎上针孔）15. 取出1ul，16. 用于Bradford测定17. 液氮速冻样品，18. -20℃保存3.组织裂解（1）3ml冰冷的RIPA缓冲液匀浆1g组织,每克组织加30ul 10mg/ml PMSF（2）所有步骤均在4℃下进行,匀完浆后冰上放置30min.，4℃10000×g离心10min，取上清（如果无法沉淀，请加大离心力，操作40min之后需要再加PMSF，加量同1，如信号转导、转录因子类蛋白易降解，可添加Aprotinin、Benzamidine、NaVO4等蛋白酶抑制剂）；有些蛋白可能存在于沉淀中（Triton不可溶的蛋白多数是SDS加热可溶的），因此要保留沉淀，沉淀用RIPA清洗几次后，保存，电泳前变性处理时要额外加入SDS，因为沉淀蛋白多数是SDS加热可溶蛋白。
）加热100°5分钟直到变性，－20°冰箱保存。
4.培养细菌：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,000g离心15min。
取上清液作为样品。
（二）Bradford法测定蛋白（考马斯亮蓝G－250染色法）1) 配制染液：²考马斯亮蓝G-250 10mg²95％乙醇5ml²85％磷酸10ml蒸馏水补足体积至100ml2) 标3) 准蛋白质：在1.5ml离心管中加入BSA蛋白0、10、20、30、40、50、60ug，4) 补水至60ul，5) 加1ml染液，6) 混匀后在5－7) 15min之内，8) 595nm 处比色测定。
9) 测定样品：方法同10) 2）方法：Bradford法测定蛋白浓度（目前动物所用方法）（1）取微量离心管（0.5ml），编号；（2）取样品30ul，分别加入3只离心管中（每只10ul），每只离心管中加水290 ul，总体积300 ul；（3）加入不同浓度的（10ug/），制备标准品；BSA(ul) 水BSA(ul) 水S0 0 总体积至300 ul S5 5 总体积至300 ulS1 0.1 总体积至300 ul S6 10 总体积至300 ulS2 0.5 总体积至300 ul S7 20 总体积至300 ulS3 1 总体积至300 ulS4 2 总体积至300 ul加入Bradford液100 u（样品和标准品都加），混匀（旋涡振荡），取200－300 ul，加入酶标板中，用酶标仪与595nm处测定，打印数据。
（三）SDS-PAGE1、SDS-PAGE试剂（1）30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
（2）1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
（3）1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
（4）10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
（5）电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O 溶解, 定容至1000ml。
（6）10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
（7）2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。
（8）预染marker.2、SDS-PAGE步骤（1）制胶分离胶：制备聚丙烯酰胺分离胶20ml，凝胶浓度为10%。
将分离胶注入准备好的干净玻璃板间隙中，在其顶层覆盖数毫升水，以加速聚合，待分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以去除未聚合的丙烯酰胺，尽可能去除凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残余的液体。
（最好用1ml的枪头加）浓缩胶：制备8ml 5%浓度的聚丙烯酰胺积层胶，直接灌入已聚合的分离胶上，插入梳子，垂直放置于室温。
在积层胶聚合完全后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽，上下槽加入1×电泳缓冲液（25 mM Tris-Cl, 250 mM甘氨酸，0.1%SDS）,按次序上样（100mg）,在所有不同的孔中加入等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。
加入电流缓冲液：上槽液与下槽液一定不要在同一水平线，以免短路。
电泳：跑到底注意：（1）上样缓冲液可按我们的方法进行；（2）目前动物所用的是BioRad的产品，加样量很少，两块胶只需10ml；（3）蛋白质分子marker用western blot预染marker（也可在转膜后用丽春红，然后洗掉，但由于丽春红致癌，目前都不用之）。
（四）电转移1.设备和试剂（1）小型电转移槽：BioRad产品。
（2）NC或PVDF膜（3）3mm滤纸（其它的滤纸也可以，但硬度差一些）（4）钢片尺一把（带刻度的）（5）转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml2. 电转移步骤安装转膜电泳装置（1）取下凝胶，切取有效部分（按Marker除去无关凝胶和未使用的泳道，将凝胶做好标记以确定第一条泳道去向），用钢片尺确定胶的大小，剪同凝胶一样大小的2张3mm滤纸和1张硝酸纤维素膜（可以不管海绵大小），并将胶在缓冲液中浸泡适当时间；1) 将硝酸纤维素膜浸在甲醇中2秒，2) 然后转到印迹缓冲液中3) 将滤纸也浸一下印迹缓冲液4) 安装如下红色电极（＋）电场蛋白转移层6 白色栅＋海绵层5 3mm滤纸（三张）层4 硝纤膜层3 凝胶层2 3mm滤纸（三张）层1 黑色栅＋海绵黑色电极（—）0（注意：将所有的气泡赶走）黑色电极（—）（黑色栅＋海绵）－3mm滤纸－凝胶（带有marker标记的一面）－硝纤膜－3mm滤纸－白色栅＋海绵5) 将槽中注入印迹缓冲液，6) 安上冰盒（另外，7) 必须将整个转膜装置于冰上，8) 可以用盆子装上冰，9) 使其在电泳时始终处于低温状态）10) 75V 1-1.5h，11) 或15V过夜（4℃）。
12) 取下硝纤膜注意：（1）最好装两块以减少电阻；（2）根据我们实验室的现状，可以在预染marker的相应位置将胶切下，然后再转；但是在切胶前一定要用转膜液润湿，防止胶破裂；（3）转膜时，只要胶、膜、滤纸的大小相近就可以了；（4）以上操作必须带手套操作，为了防止污染，最好在一次性手套的外面带无粉乳胶手套，以防污染。
（五）免疫反应所需试剂和设备：1、PBST：1000ml 0.01M PBS(pH7.4)加0.5-1ml Tween20（最好用进口的）。
2、封闭液：20 ml PBST加1.0g脱脂奶粉。
3、ECL试剂盒4、暗盒：名称X射线摄像暗匣型号Ax-1规格203mm×254 mm(8×10英吋)厂家中国广东粤华医疗器械厂5、胶片：医用X射线胶片（koda）6、压片法：①暗盒一个；②柯达医用胶卷；③显影液（储存于4℃，用时加）④定影液（可在室温保存）⑤去离子水冲洗（用洗瓶）。