蛋白提取及WB步骤.doc

WB实验步骤

WB实验步骤WB实验是一种分离和检测蛋白质的常用实验技术。

以下是WB实验的详细步骤，共分为六个主要步骤。

步骤一：蛋白质提取1.1收集实验所需样本，例如细胞或组织。

如果是细胞样本，可以通过细胞培养离心将细胞沉淀下来。

如果是组织样本，可以通过切割及别的方法收集组织样本。

1.2加入合适的蛋白质提取缓冲液，如RIPA缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性。

1.3震荡或旋转混合样本，使细胞或组织彻底裂解。

1.4将样本在低温下离心，以去除细胞残渣和细胞核等。

1.5收集上清液，其中含有溶解的蛋白质。

步骤二：蛋白质浓度测定2.1 使用BCA蛋白质定量试剂盒或Bradford蛋白质定量试剂盒等试剂，根据试剂盒说明书，测定蛋白质的浓度。

2.2根据蛋白质的浓度调整提取的蛋白质样本的浓度，以保证后续实验的准确性。

步骤三：SDS-电泳3.1准备一定比例的分离凝胶和浓缩凝胶。

通常使用8%-12%的聚丙烯酰胺凝胶。

3.2预运行凝胶，将上清液和蛋白质样本与蛋白负载缓冲液混合，使其达到相同的体积分数，并加入还原剂和SDS。

3.3将混合样品加载到凝胶孔中，根据需要分别加载蛋白质标准，以便确定蛋白质样品的分子量。

3.4设置合适的电泳电压，使蛋白质在凝胶中进行电泳，直至蛋白质通过凝胶前进行分离。

3.5 可以通过染料（如Coomassie blue G-250染色）或银染等方法，可视化分离的蛋白质带。

步骤四：蛋白质转移4.1准备一块聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维膜（NC）作为蛋白质的转移载体，并根据凝胶大小和所需的转移时间切割。

4.2将预运行的蛋白质凝胶和转移载体置于转移装置中，确保凝胶和载体之间没有气泡。

4.3加入冷却的转移缓冲液，确保完全润湿载体，并移除空气泡。

4.4设置合适的转移电流和时间，以将蛋白质从凝胶中转移到膜上。

4.5转移结束后，将膜从转移装置中取出，并立即进行后续处理。

步骤五：免疫检测5.1将膜与阻塞缓冲液溶液处理，以防止非特异性结合。

wb蛋白提取步骤

wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言：WB蛋白提取是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。

本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。

一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分，释放出目标蛋白质。

常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。

其中，最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液，通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。

二、蛋白质提取蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。

在细胞裂解后，目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。

为了提取目标蛋白质，需要将裂解液进行离心，分离出上清液。

上清液中含有目标蛋白质，可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。

三、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一，旨在提高目标蛋白质的浓度，便于后续的蛋白质检测。

常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。

在浓缩过程中需要注意控制温度和pH值，以避免蛋白质的降解和聚集。

四、蛋白质检测蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步，用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。

常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。

其中，SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法，可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带；免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后使用酶标记的二抗进行检测。

总结：WB蛋白提取是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。

其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。

通过合理选择和操作这些步骤，可以获得高质量的蛋白提取物，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。

参考文献：[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622.[2] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.1979;76(9):4350-4354.[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.。

WB实验步骤详细总结材料

蛋白提取（所有操作在冰上进行）1.裂解1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min2.匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min3.离心（在基础4楼416室）1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）将样品转移至2~3个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100℃变性10min仪器屏幕：5.保存变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用WB实验步骤1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

2.配制分离胶1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。

1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）3.灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min5.浓缩胶的配制（5%）6.电泳（电泳液最多使用两次）1)安装电泳装置低板对，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）2)点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）3)连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔，打开开关恒压电泳先调电压至70mV，跑约20min。

WB实验步骤

WB 实验步骤1. 蛋白提取，吸出培养基，用适量DPBS清洗，吸出DPBS，尽量吸干净，加入适量细胞裂解液，冰上裂解15-30min2. 用细胞刮刀刮取皿或瓶底部的细胞，收集至1.5ml的离心管中，12000rpm离心，4度，15-30min将上清转移到新的离心管中3. 检测蛋白浓度，定量（20-40ug），用水和蛋白上样缓冲液配成30ul以内的体积，100度变性10min，冷却后离心，上样4. 将胶装在电泳槽内，加入1x电泳缓冲液到指定刻度，拔出梳子用注射器清洗胶孔，上样5. 60V电压压缩蛋白至同一位置（分离胶与浓缩胶交界处），130V分离蛋白。

配置转膜缓冲液，并将膜浸泡其中，4度预冷6. 待蓝色的缓冲液条带到达距离胶底面0.5cm处即可开始转膜，按照从负极到正极海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵的顺序组装，避免产生气泡，对应正负极放入转膜槽7. 低温转膜90min，丽春红染色，初步判定WB效果，并在对应位置将目的条带剪下来8. 用5%的脱脂牛奶封闭，室温1小时以上，用特定的一抗4度过夜9. 清洗一抗，用适量的TBST，室温3次，每次10min10. 加入对应的二抗，室温孵育1小时以上，并清洗3次，同911. 按1:1的比例配置发光试剂，并发光注意电泳时电压可适当更改，根据个人时间安排及经验我们有2种膜，PVDF和NC膜，大家可根据需要选用，另外膜的孔径也有差异，0.22um的适合检测分子量较小的蛋白，0.45um的适合检测分子量较大的蛋白抗体分为兔抗，羊抗，鼠抗等，大家看清楚，抗体通常用5%的牛奶配制转膜时盒子里面要有冰袋，外面要有冰，尽量保持低温，提高转膜效率发光液最好现配现用曝光时不要过曝或者用过曝的图片，可能会掩盖差异。

蛋白提取及Western blot 原理及步骤

蛋白质提取原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。

方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。

5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇(5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。

Western bolt原理及步骤原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。

WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

WB实验步骤详解

WB实验步骤详解WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。

在WB实验中，通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来，然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上，并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。

最后，使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。

下面是WB实验的详细步骤：1.提取蛋白质：首先，从细胞、组织样本中提取蛋白质。

这个步骤可以使用不同的方法，例如细胞裂解、组织切碎和离心等。

提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。

2.蛋白质电泳分离：将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。

通常使用的凝胶是SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳），该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。

样品加载完毕后，通电进行电泳分离。

较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部，较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。

3.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。

通常使用的膜是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。

在转印之前，通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。

然后，将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起，将其放置在转印装置中，施加电流进行蛋白质转印。

4.阻断：将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。

阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。

最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。

5.抗体孵育：使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。

首先将抗体稀释在主抗体稀释液中，然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。

通常在4℃下过夜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。

选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。

6.辅助抗体孵育：将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上，用于识别已结合的主抗体。

这些次级抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光染料标记进行共轭，以便于标记的抗体的检测。

次级抗体与主抗体结合形成复合物。

7.检测：使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。

这些方法可以使用酶标法（如辣根过氧化物酶反应和色素显色）或荧光技术（如荧光染料）。

wb蛋白提取步骤

wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言：WB蛋白提取是一种常用的蛋白质分离和检测方法，广泛应用于生物学研究领域。

本文将介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质浓缩、电泳分离和膜转移等过程。

一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，主要目的是将细胞膜破坏，释放蛋白质。

细胞裂解的方法有多种，常用的有机械破碎法和化学裂解法。

其中，机械破碎法适用于坚硬的细胞壁，如细菌和酵母菌；而化学裂解法适用于无细胞壁的动物和植物细胞。

二、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是为了提高样品中蛋白质的浓度，使其更易于检测。

常用的蛋白质浓缩方法有盐析法、醇沉淀法和凝胶过滤法等。

其中，盐析法是利用蛋白质与盐溶液中的离子相互作用，使蛋白质从溶液中沉淀出来；醇沉淀法则是利用醇与蛋白质的亲和性，使蛋白质在醇溶液中沉淀；凝胶过滤法则是利用蛋白质分子在凝胶中的大小和电荷差异，通过筛选作用将蛋白质从其他物质中分离出来。

三、电泳分离电泳分离是WB蛋白提取的关键步骤，通过电场作用使蛋白质在凝胶上进行分离。

常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-PAGE电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于分离较小的蛋白质，其原理是根据蛋白质的分子大小和电荷差异进行分离；而SDS-PAGE电泳则是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电荷，并根据蛋白质的分子大小进行分离。

四、膜转移膜转移是将电泳分离后的蛋白质转移到膜上，以便进行进一步的检测。

常用的膜转移方法有湿式转移和半干式转移。

湿式转移是将凝胶和膜浸泡在缓冲液中，通过电场使蛋白质从凝胶转移到膜上；而半干式转移则是将凝胶和膜通过滤纸或海绵进行转移，速度更快。

五、膜检测膜检测是WB蛋白提取的最后一步，通过特定的抗体与目标蛋白质结合，并利用染色剂使蛋白质在膜上可见。

常用的膜检测方法有荧光标记法和酶标记法。

荧光标记法是利用荧光标记的抗体与目标蛋白质结合，通过荧光显微镜观察；酶标记法则是利用酶标记的抗体与目标蛋白质结合，通过酶的催化作用产生可见的色素反应。

wb细胞蛋白提取步骤

wb细胞蛋白提取步骤一、背景介绍WB（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析方法，通过将蛋白质样品经电泳分离后转移到膜上，再与特异性抗体反应并检测，从而确定目标蛋白的存在与表达水平。

而WB细胞蛋白提取是WB实验的前提，本文将介绍WB细胞蛋白提取的步骤。

二、实验器材准备1. 细胞培养器：细胞培养器是培养细胞的必备设备，可提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。

2. 细胞离心管：用于离心细胞，分离细胞上清液和细胞沉淀。

3. 细胞裂解液：细胞裂解液是提取细胞蛋白的重要试剂，可选择RIPA缓冲液等。

4. 低温冰箱：用于保存试剂和细胞裂解液等在实验过程中需要低温保存的物品。

5. 离心机：用于离心细胞、沉淀蛋白等。

三、细胞样品准备1. 细胞培养：将需要研究的细胞株在无菌条件下培养至对数生长期。

2. 细胞收集：用PBS等缓冲液洗涤细胞，使细胞悬浮液中不含有培养基或其他杂质。

3. 细胞裂解：将细胞悬浮液加入细胞裂解液中，用震荡器或超声波仪器进行细胞裂解。

四、细胞蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞裂解液和细胞悬浮液混合，通过震荡器或超声波仪器进行细胞裂解，破坏细胞膜释放细胞内的蛋白质。

2. 离心：将细胞裂解液离心，分离出细胞碎片和细胞膜等残留物，得到上清液。

3. 蛋白含量测定：使用BCA或Bradford方法等，测定提取的蛋白液中的蛋白质浓度，以便后续实验的样品配比。

4. 储存：将提取的蛋白液分装成适量的小管，存放在低温冰箱中保存，避免蛋白质降解和污染。

五、质检和实验准备1. SDS-PAGE凝胶制备：根据需要分离的蛋白质大小，选择合适的凝胶浓度，制备SDS-PAGE凝胶。

2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白液按照浓度进行加载，进行电泳分离。

3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到PVDF或nitrocellulose膜上，使蛋白质固定在膜上。

4. 阻断：将转膜后的膜放入蛋白质阻断液中，阻断膜上未结合的部分空位。

wb实验基本步骤.doc

wb实验基本步骤.doc
WB实验是一种常见的实验方法，主要用于检测特定蛋白质在样本中的含量和分子量，通常用于生物化学、免疫学和分子生物学等领域的研究。

以下是WB实验的基本步骤：
1、制备蛋白提取液：首先需要将要检测的细胞、组织等样本分别加入不同的缓冲液中进行细胞破碎和蛋白提取，以获得纯度较高的蛋白提取液。

2、电泳：将提取的蛋白质样品通过电泳进行分离，通常会使用SDS-PAGE凝胶进行分离。

将不同分子量的蛋白质分别移动到凝胶上的不同位置，以便之后的检测。

3、转移：将凝胶上的蛋白质转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，通常使用电泳转移法，将蛋白质从凝胶中转移至聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，以便后续的抗体检测。

4、阻断：用牛血清白蛋白或者干奶粉等物质对转移膜进行阻断，避免后续的抗体与非目标蛋白质结合。

将药液涂抹在膜上，使其涂满，然后放在室温或冰箱中进行阻断。

5、抗体反应：将目标蛋白质的抗体与转移膜中的蛋白质结合，用于识别其中的目标蛋白质。

将稀释好的抗体液滴到转移膜上，可以进行全膜反应或局部反应，稍作震荡和轻轻摇晃。

6、显色：将荧光素和遥光素添加到转移膜上，用于显示蛋白质的分布位置和含量。

将荧光素和遥光素稀释好涂在膜上，等待5~10分钟后进行观察。

7、数据分析：通过使用图像分析软件对转移膜蛋白质条带进行测量，得到蛋白质的含量和分子量等数据。

尽可能准确地确定目标蛋白质的含量和分子量等信息。

wb细胞蛋白提取步骤

wb细胞蛋白提取步骤WB细胞蛋白提取步骤引言：WB（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，通过该技术可以检测特定蛋白质的存在与表达水平。

而WB细胞蛋白提取是进行WB实验的关键步骤之一，本文将详细介绍WB细胞蛋白提取的步骤。

步骤一：细胞收集需要从培养皿中收集目标细胞。

将细胞培养液倒入50 mL离心管中，离心5分钟（1000 rpm），将上清液去除，留下沉淀的细胞。

步骤二：洗涤细胞将细胞沉淀用无菌PBS洗涤3次，每次洗涤后离心5分钟（1000 rpm），去除上清液。

步骤三：细胞裂解将洗涤后的细胞沉淀加入适量的细胞裂解液（如RIPA缓冲液），并加入蛋白酶抑制剂。

用移液管反复吸取和排放细胞裂解液，使细胞完全裂解。

将细胞裂解液放置在冰上浸泡20分钟，促使细胞内蛋白质释放。

步骤四：离心细胞裂解液将细胞裂解液离心10分钟（12000 rpm），将上清液转移到新的离心管中，以避免沉淀物对后续实验的干扰。

步骤五：测定蛋白浓度采用BCA方法或其他合适的蛋白浓度测定方法，测定细胞裂解液中的蛋白质浓度。

步骤六：蛋白样品制备将细胞裂解液中的蛋白质与蛋白加载缓冲液按照一定比例混合，加入适量的蛋白酶抑制剂，并进行煮沸处理。

煮沸处理的目的是使蛋白质变性，并使其在WB实验中得到更好的分离和检测。

步骤七：SDS-PAGE电泳将蛋白样品加载到SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。

可以根据需要选择合适的凝胶浓度和电泳条件，以获得最佳的蛋白分离效果。

步骤八：蛋白转膜将电泳分离后的蛋白转移到聚合物膜（如PVDF膜）或硝酸纤维素膜上，可以使用湿法或半湿法转膜方法。

转膜后，可以用荧光素或染色剂对膜进行染色，以观察蛋白质的迁移情况。

步骤九：膜孔堵塞为了防止非特异性结合，需要对转膜后的膜进行堵塞处理。

一般使用5%的脱脂奶粉或3%的BSA等溶液进行堵塞，在室温下搅拌1小时或过夜。

步骤十：一抗孵育将膜与一抗溶液孵育，一抗可以是特异性抗体，用于检测目标蛋白的存在。

细胞蛋白提取做westernblot

冰上操作：组织的WB:按HE包埋的组织大小的一半，加入500ul裂解液匀浆,切记事先要将组织用剪刀剪碎后再匀浆，心肝肾较脆先匀，脂肪最后匀。

组织重量（g）：裂解液=1：10培养皿里培养基要完全吸干，用配好的PBS洗两次，要吸干后再加裂解液配置裂解液：RIPA裂解液：PMSF：蛋白磷酸酶抑制剂为100:1：1（PMSF可不加）60mm的皿（含培养基3ML）裂解液加120ul （分化率高加200ul）35mm的皿（含培养基1ML）裂解液加50ul （分化率高加100ul）六孔板（分化率低每孔裂解液加150ul）分化率高加200~300ul的RIPA确保裂解液不是过于浑浊，应适当澄清，否则适量再加入裂解液充分裂解5~30min，刮蛋白要刮到全部位置，先皿朝外刮放置口水进去，再朝内将液体全部刮下，用移液抢移到0.5mlEP管12000rpm 4℃离心10~20min,确保提取的液体澄清，取上清到0.5ml的EP管中（也可不取上清，直接快速吸走沉淀）考马斯亮蓝测蛋白浓度：（考马斯亮蓝液体配置：考马斯：水=1:4）因脂肪细胞蛋白难溶，所以需先和PBS混合溶解后再加考马斯亮蓝96孔每孔先加18ul的PBS，再加待测蛋白体积2ul，再加配好的考马斯亮蓝溶液200ul。

空白孔即18ul的PBS加配好的考马斯亮蓝溶液200ul。

反应10min后紫外595nm，真实吸光度=吸光度平均值-空白吸光度，将算得的吸光度带入标准曲线，测得浓度，测得的浓度/2=实际的浓度(ug/ul)（mg/ml）（常规方法200ul考马斯+2ul蛋白）Ps：解决孔底结晶的方法：1.每次加蛋白后用枪头悬空于孔底搅拌2.所有孔加完事后每孔加20ulPBS助溶空白孔一定要条件一致每孔上样50ug~100ug的蛋白（3t3-l1细胞的脂肪因子指标需上样90ug）15孔的小孔：上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品。

10孔的大孔：上样总体积一般不超过30ul，加样孔的最大限度可加40ul样品。

wb蛋白提取步骤

wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤一、引言WB（Western Blot）蛋白提取是一种常用的蛋白质分析方法，通过将样品中的蛋白质分离、定量和检测，可以研究蛋白质的表达水平、功能和相互作用等。

本文将介绍WB蛋白提取的步骤及操作要点。

二、样品准备1. 收集样品：根据研究目的，选择合适的样品进行提取。

样品可以是细胞、组织、血清、培养基等。

2. 样品处理：对于细胞和组织样品，可先用PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基或组织液。

对于血清样品，可离心去除悬浮的细胞或血小板。

三、蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞沉淀离心后，加入细胞裂解液，使细胞膜破裂释放蛋白质。

可以选择不同的细胞裂解液，如RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。

2. 组织裂解：将组织样品切碎后，加入组织裂解液，将组织细胞破碎并释放蛋白质。

组织裂解液可以选择RIPA缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。

3. 蛋白质提取：将裂解液离心，收集上清液，即为蛋白提取物。

可以通过BCA方法或Lowry方法等测定蛋白质的浓度。

四、蛋白质分离与检测1. SDS-PAGE凝胶电泳：将蛋白样品加热变性，然后加载到凝胶孔中，施加电场使蛋白质在凝胶中进行分离。

常用的凝胶浓度为8%~15%。

2. 转膜：将凝胶中的蛋白质转移到膜上，常用的转膜方法有湿式转膜和半干式转膜。

常用的膜材料有PVDF膜和NC膜。

3. 阻断与孵育：将转膜后的膜放入阻断液中进行孵育，阻断非特异性结合位点，避免假阳性结果的产生。

4. 一抗和二抗孵育：将目标蛋白特异性抗体（一抗）孵育于膜上，然后孵育与一抗结合的二抗，二抗中带有标记物，例如辣根过氧化物酶（HRP）等。

5. 显色与成像：使用化学发光法或染色法，使膜上特定蛋白质形成显色带，然后使用成像系统进行成像和分析。

五、结果分析通过观察显色带的位置和强度，可以初步判断蛋白质的表达水平。

根据需要可以进行定量分析，使用专业软件测量带的强度，并与内参蛋白进行比较分析。

六、注意事项1. 样品保存：样品提取后应及时保存，避免蛋白质降解。

wb组织蛋白提取方法

wb组织蛋白提取方法WB组织蛋白提取方法引言：WB（Western Blotting）是一种常用的蛋白质检测方法，通过将待检测的蛋白质进行电泳分离，然后转移到膜上，再用特异性抗体进行检测。

WB组织蛋白提取是进行WB实验的重要前提，正确的提取方法能够保证蛋白质的完整性和浓度，从而获得准确可靠的实验结果。

一、准备工作1. 材料准备：组织样本、液氮、无菌离心管、摇床、离心机、清洗液（PBS）、RIPA裂解液、丙酮、蛋白酶抑制剂等。

2. 工具准备：离心管架、离心管盒、离心管架盖、冰桶、温度计等。

二、组织样本的采集和处理1. 组织样本的采集：将所需的组织样本取出并迅速置于液氮中，确保样本冷冻速度快，避免蛋白质降解。

2. 组织样本的处理：将组织样本放入无菌离心管中，加入适量的PBS缓冲液，用摇床低速摇动几分钟使组织均匀悬浮。

三、组织样本的裂解和离心1. 组织样本的裂解：将PBS悬浮液倒入离心管中，加入适量的RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，充分混合后放置冰上浸泡30分钟至1小时，使细胞完全裂解释放蛋白质。

2. 组织样本的离心：将裂解液离心10分钟，离心速度为12000rpm，将上清液转移到新的离心管中，避免沉淀物的污染。

四、蛋白质的沉淀和洗涤1. 蛋白质的沉淀：向上清液中加入4倍体积的丙酮，充分混合后放置-20℃冰箱中沉淀过夜，使蛋白质充分沉淀。

2. 蛋白质的洗涤：将离心管取出，离心10分钟，离心速度为12000rpm，将上清液倒掉，加入无菌PBS缓冲液洗涤2次，以去除丙酮等残留物。

五、蛋白质的溶解和浓度的测定1. 蛋白质的溶解：向离心管中加入适量的RIPA裂解液，用摇床低速摇动几分钟使蛋白质充分溶解。

2. 蛋白质浓度的测定：使用BCA或Lowry方法等蛋白质浓度检测试剂盒，按照说明书进行操作，得到蛋白质的浓度。

六、蛋白质的保存和使用1. 蛋白质的保存：将提取的蛋白质分装至无菌离心管中，分别存放于-80℃冰箱中或液氮中，避免蛋白质降解。

WB操作步骤

WB操作步骤操作步骤（一）蛋白样品制备（1）贴壁细胞总蛋白的提取：（整个操作尽量在冰上进行）收集细胞，加裂解液100ul漩涡混匀，冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（二）蛋白含量的测定（1）制作标准曲线1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2、取适量的蛋白标准稀释至终浓度0.5 mg/ml ；按照下表将0.5mg/ml BSA和稀释液PBS加到96孔板中，并取样品2ul加入96孔板中，加PBS至20ul.（样品和标准品均设置复孔）3、按A:B=50:1配制适量的BCA工作液，混匀，室温24h内稳定。

各孔加入200ulBCA工作液37°30min后，测定A562，求平均值，绘制标准曲线。

编号 1 0.5mg/ml BSA (ul) PBS(ul) 2 1 19 3 2 18 4 4 16 0.1 5 8 12 0.2 6 12 8 0.3 7 16 4 0.4 8 20 0 0.5 0 20 得到标准BSA浓度 (ug\%ul) 0 0.025 0.05 （三）SDS－PAGE电泳电泳时间一般为2～3h，电压为80V 30min;120V 3h较好，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

SDS-PAGE 分离胶浓度 6% 8% 10% 最佳分离范围 50-150kD 30-90kD 20-80kD12% 15% 12-60kD 10-40kD ? 配制10%的过硫酸铵 ? 配制12%分离胶（5ml)? 待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水 ? 聚合40分钟后，倒掉蒸馏水 ? 配制5%浓缩胶（2ml）灌浓缩胶 ? 插上梳子，聚合20分钟?注意：灌胶过程中避免产生气泡（四）转膜转膜详细操作过程：（1）转一张膜需准备6张7.0～8.0cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的PVDF膜。

WB原理、步骤及总结.doc

WB原理、步骤及总结实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。

SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。

因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。

电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。

方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。

固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。

蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S 检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。

用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。

主要溶液10%分离胶水3.3mL、30%丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/LTris（pH8.8）2.5mL、10%SDS0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED0.004mL5%浓缩胶水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL1×Tris–甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tris2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris1.21gNaCl8.77g，Tween-201mL，加去离子水至1LStripping1.3mLTris（pH6.8），4mL10%SDS，140µlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤1SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。

蛋白提取步骤

提蛋白及WB的步骤整个过程细胞或蛋白都必须放冰上准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记1.5ml 离心管及0.6ml离心管、细胞刮板、开低温高速离心机细胞裂解液配制：1ml cell lysis10ul NP-40（离心机后）25ul 焦磷酸钠40ul NaF1ul β-甘油磷酸2 ul Na3VO41ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱）10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒）细胞裂解和收集1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。

2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加0.1ml ），冰上静置1-2min。

3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。

细胞破碎4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。

（超声波破碎仪的铁棒不要碰到离心管的壁和底部）超声波设置：工作功率5% 工作时间3min开机时间15s，关机时间30s温度0度，报警温度1度5.4℃、13000r/min，离心15min。

（离心机用后一直保持打开的状态，）蛋白保存6.蛋白保存及分装：吸上清液至0.6ml离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。

-80℃保存。

注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。

样品处理超过1h，补加一次。

BCA测定蛋白浓度1、测空白板，选差异较小的孔。

BCA测定法波长 570，Bracford：5952、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至0.5mg/ul。

取5ul标准蛋白+45ul PBS3、加样：浓度00.10.20.30.4BSA（ul）0481216PBS（ul）201612844、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量，一般防止损耗，多算一个样。

WB实验组织总蛋白提取方法

WB实验组织总蛋白提取方法WB实验组织总蛋白提取方法WB组织总蛋白提取步骤第一步提取组织蛋白上清液1，准备裂解液（1）溶PMSF（将PMSF晶体溶到PMSF溶剂中，即配成10ml100mM的PMSF液体）（2）裂解液的制备组成：PIRA裂解液+PMSF溶剂+蛋白酶抑制剂10mlPIRA=100ulPMSF=1片蛋白酶抑制剂（3）将配好的裂解液放在4℃备用。

2，研磨组织（心尖）（1）准备研钵，药勺（2把），长镊子，保温箱（里面放入冰块），汤勺，离心管，天平，手套（2幅），液氮，冰盘，振荡器。

（2）将所有接触到组织的工具用液氮预冷。

（3）1人负责将组织组织给研磨者并随时加液氮（此人必须记住每次研磨者所研磨的组织的编号）2人研磨组织（多次快速），同时一人将1.5ml离心管编号预冷去皮。

（4）将研磨好的组织放在去皮处理的对应的离心管中称重。

（用大白纸记录好每个样的重量，便于离心时配平用）。

（5）加裂解液（1mg组织加6ul裂解液）。

（6）震荡混匀后放入冰盘上，等所有的`样加完后一齐在摇床上摇1h。

3，离心提取蛋白上清液（1）提前30min预冷离心机（4℃）。

（2）配平。

（3）离心，按照配平时的组放样（13000r，5min）。

（4）取上清液，储存在-20℃备用。

（提前将1.5ml的离心管编号）。

第二步BCA法测蛋白浓度1，37℃预热水浴箱2，配蛋白标准液（1）准备9个1.5ml离心管并编号A,B,C,D,E,F,G,H,I（2）按照说明书配制标准样。

3，将蛋白上清液稀释十倍（1）准备0.5ml的离心管并编号。

（2）取上清液6ul，然后加入54ul蒸馏水，震荡混匀。

2，配BCA工作液RagentA：B=50:1工作液所需用量计算：总体积=（n待测样+9标准样）×2×200ul其中A液xx，B液xx。

3，向酶标板（96孔板）中加入蛋白和工作液先加25ul蛋白，再加200ul工作液，每个样加两个孔。

wb实验_精品文档

wb实验WB实验导言：WB实验（Western Blotting）是一种广泛应用于生物医学研究中的实验技术，它通过将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，再将被分离的蛋白质转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，最后使用特定抗体对目标蛋白质进行检测。

本文将详细介绍WB实验的基本原理、步骤和应用。

一、基本原理1.1 蛋白质电泳分离在WB实验中，首先将待测蛋白质与断裂蛋白质加入SDS-PAGE （聚丙烯酰胺凝胶电泳）胶液中，然后通过电泳，根据蛋白质的分子量以及电荷特性，将蛋白质从胶液中分离出来。

当电流作用于聚丙烯酰胺凝胶时，蛋白质会根据其电荷和分子量的不同，在电场中迁移。

1.2 蛋白质转移接下来，将蛋白质从SDS-PAGE胶液中转移到固定在聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上。

这一步骤通常使用电泳转移装置，通过电流将蛋白质从凝胶中转移到膜上。

此过程可以进一步将蛋白质进行定量或定性分析。

1.3 特定抗体检测转移完成后，利用特定抗体对目标蛋白质进行检测。

特异性抗体与目标蛋白质结合后，通过化学或光学方法可可视化目标蛋白质。

常见的可视化方法包括荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射性探针等。

二、实验步骤2.1 样品制备样品的制备是WB实验的关键步骤之一。

需要将待测蛋白质从细胞或组织中提取出来，并进行蛋白质浓度的测定。

可以使用细胞裂解液来破坏细胞膜，释放蛋白质。

同时，可以使用加热和还原剂来使蛋白质在电泳过程中分离。

2.2 SDS-PAGE电泳分离将样品和标准蛋白质分别加载到预制的凝胶槽中。

开启电源，设定适当的电流和运行时间，进行电泳分离。

分离完成后，将凝胶放入转移装置中。

2.3 蛋白质转移将凝胶转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上。

同时提供足够的电流，并根据蛋白质大小和热力学性质设置适当的时间，以确保蛋白质可以完全转移到膜上。

2.4 特定抗体检测将蛋白质膜进行一定的前处理步骤，如预浸泡、阻断和洗涤。

然后，加入特定的一抗，与目标蛋白质结合。

蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤

蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。

平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。

4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。

（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。

二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。