蛋白提取及WB步骤.doc

沸5 min~10 min，12000 rpm离心后加样；

（3）电泳：浓缩胶10 mA恒流电泳至交界处，分离胶20 mA 恒流电泳至溴酚蓝到达凝胶下缘，可根据蛋白分子量的大小确定电泳的位置；

我们是bioworld的机子，一般可以电泳用恒压80V跑到底。

5）Western blot分析

（1）半干转膜仪转膜（具体和实验室机子有关）：剪与凝胶大小一致的PVDF膜一张（膜用之前的处理：甲醇浸泡min,ddH2O 浸泡5min，然后和滤纸一起泡到转缓里），滤纸12张，浸泡于转膜缓冲液中至少20 min，先将滤纸逐层置于转膜仪上，用下胶尺逐层赶尽气泡，加上PVDF膜，赶尽膜与滤纸间的气泡，将聚丙烯酰胺凝胶放在PVDF膜上，赶尽凝胶与尼膜之间的气泡，逐层加上滤纸，要尽量排放整齐；按照0.8 mA/cm2~1 mA/cm2的功率恒流转膜2 h~2.5 h。注意正负极。

我们一般用的是250ma转两个小时。

（2）将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBS中封闭2 h；（3）加入5%脱脂奶粉稀释的一抗，4 ℃过夜；（4）次日用TBS洗3次，每次10 min；（5）加入HRP结合的二抗，37 ℃，1 h；（6）TBS洗4次，每次10 min；

（7）显影：这个是根据各个实验室的设备。