ELISA常见问题和处理

问题可能原因解决方法1、无颜色试剂孵育的时间没有按说明书操作。

确定生物素化抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的时间是否适当。

2、不同试剂盒或不同批号的试剂混用。

重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。

不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。

3、漏加酶检查操作流程，注意不要漏加5、HRP酶污染了叠氮钠使用新配制的试剂，禁含叠氮钠标准品有问题(若在标本孔中有信号)按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品某一容器未洗净,残留灭活酶物质尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体重新确认所选用的试剂.漏加显色剂A或B加显色剂后观察一下液面高度试剂配制/使用有误将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。

缓冲液污染配制新新鲜的缓冲液显色弱超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。

检查产品的有效期加入试剂的体积和时间有误确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。

试剂、样品用前未能平衡用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右缩短孵育时间能使实验的信号变弱。

检查孵育的时间。

在温度变化的环境内孵育酶标板。

确定孵育的温度，应避免温度的变化。

使用了被污染的试剂检查试剂是否被污染。

标准品/标本制备方法不规范检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。

低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。

样品用NaN3防腐,抑制了酶的反应显色底物制备不规范检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。

检测时间不当是否在规定的时间内检测。

仪器设定不正确，滤光片不匹配。

仪器是否设定正确，滤光片的使用等。

高背景(本底)洗涤操作不规范洗板不充分，使用手工洗板常出现。

最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。

每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。

若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。

板的内侧不应接触设备。

检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。

在两次洗板之间加30秒的浸泡。

实验中孵育温度和时间不适当确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当酶加量过多加酶前验看移液器调节量是否准确。

检查稀释度，若必要进行效价测定。

封闭不完全检查封闭液的计算量；提高封闭时间。

标本或标准品中的干扰物质做适当的对照显色剂受光照时间较长,或污染显色剂A和B应于使用前10分钟从冰箱取出整批样品放置时间过长,样品污染样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染缓冲液污染制备新鲜的缓冲液吸头重复使用,未洗净或消毒不完全而用于加酶或显色剂吸头尽可能一次性使用太多的信号：全部的板子变成规则的蓝色不充分的洗涤/洗涤步骤被遗漏-没结合的过氧化物酶仍有残留。

最好使用洗板机充分洗涤检查孔内是否有残留的洗液或加样量是否准确。

底物溶液混合太早并转成蓝色应控制底物混合的时机并立即使用太多的酶结合物检查稀释度，必要时进行效价测定封板膜或试剂容器被重复使用，导致HRP残留，使TMB底物产生非特异蓝色。

使用新鲜的封板膜，每步使用不同的试剂容器缓冲液中污染金属或HRP制备新鲜缓冲液高CV值(CV：coefficient of variation)，花板操作不慎或洗涤不充分按说明书洗板、加样、显色。

洗板尤为重要，如上所述出现干板，没有使用封板膜、封板膜重复使用确定每两步骤间，酶标板应保持湿润。

使用封板膜封口，注意每步使用新鲜的封板膜。

由于操作失误或板子质量差(结合不均匀)造成包板不均匀。

稀释用的PBS中不要加其它蛋白检查包被和封闭液体积、时间和试剂加入的方法。

检查所使用的酶标板，使用ELISA板子(不要使用组织培养板)移液器不准确，吸头重复使用。

检查并校准移液器。

每次取样必须换吸头。

回顾标本的加入步骤，确保每次加样的准确性，保证吸取的液体按所设定的体积吸入和排出，连续加样时注意检查吸头，确保所加液体的体积。

样品离心处理不全,反应孔内发生凝血或残留细胞成分标本充分离心, 3000rpm 6分以上，严禁使用凝血(溶血)的标本缓冲液污染制备新鲜的缓冲液标准曲线可得到，但两点之间区别很差(低或平的曲线)酶结合物不足检查稀释度，必要时进行效价测定捕获抗体没有很好结合到板上检查所使用的酶标板，使用ELISA板子(不要使用组织培养板)稀释用的PBS中不要加其它蛋白检测抗体不足检查稀释度，必要时进行效价测定板子显色不足延长底物孵育实验使用推荐品牌的底物溶液操作不慎回顾ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。

标准曲线稀释度计算有误核查计算的情况，制备新的标准曲线标准曲线很好，但是没有任何期望的阳性信号产生在标本中无相应的细胞因子使用内参对照重复实验，重新考虑实验的相应参数标本基质遮盖检测将标本至少做1∶2相应的稀释，或进行系列稀释观测它的恢复性标准曲线很好，但是标本的判读值很高标本中含的细胞因子水平超过实验范围将标本做稀释并再次实验当使用HRP酶结合物时，TMB底物加终止液后显绿色孔中的试剂显色不充分轻轻振荡板子边缘效应工作环境温度不均衡避免将板子在变化温度环境中孵育漂移实验过程中出现间断整个实验应连续操作：在实验开始前将所有标准品和标本做适当的准备试剂没有按说明书平衡至室温在所有试剂加入孔前，确保它们已平衡至室温，除非说明书中有另外的要求。

是否可更改试剂盒所提供的实验操作步骤？一般厂商为确保最高的灵敏度和特异性，对试剂盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范性应按说明书操作。

是否可混用不同试剂盒中的试剂？不行。

绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的，若有问题可与厂家或代理商联系。

是否可增加或减少标本的体积。

商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的，应按说明书操作，不建议更改所加标本的体积。

是否可重确定自己的标准曲线的点？可以。

说明书上有建议的制备标准曲线时标准品的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但是必须在实验范围内，高于试剂盒中最高标准品的点和低于灵敏度以下的点是无效的。

ELISA操作常见问题ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。

1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。

因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。

一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。

但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。

2．试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温(约25℃)，一般需在室温放置20～30分钟以上。

平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。

冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。

3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。

4．加样在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。

注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。

加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。

加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。

溅出会对邻近孔产生污染。

出现气泡则反应液界面有差异。

所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。

5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。

ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。

温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。

最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。

一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。

因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。

6．洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。

洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。

洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。

7．边缘效应使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。

经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。

聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。

因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。

8．显色显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可。

一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。

9．比色比色要注意波长的选择。

以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。

因此，容易出现滤光片错用的问题。

其次，单波长或双波长比色选择的问题。

所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。

最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。

因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。

由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。